커피의 쓴맛을 결정하는 다양한 화합물

Coffee Chemistry

커피의 쓴맛을 결정하는 다양한 화합물

mjcafe 2025. 5. 15. 18:34

■ Abstract
■ Introduction
■ Materials and Methods
	Chemicals and materials.
	Isolation of bengalensol.
	Functional calcium mobilization assay.
	Molecular modelling.
	Human sensory experiments.
■ Results and Discussion
	Screening for TAS2Rs activated by mozambioside.
	Comparing the potencies of mozambioside and caffeine.
	Identification of further bitter compounds activating TAS2Rs.
	Probing for competitive effects among identified TAS2R agonists.
	Molecular modelling and docking of newly identified bitter agonists.
	Human sensory experiments.
■ References

Abstract

커피는 세계에서 가장 많이 소비되는 뜨거운 음료들 중 하나이며
확연한 쓴맛을 가지고 있음에도 그 자극효과 때문에 높게 평가된다.
비록 여러 쓴맛 성분들이 식별되어져 왔지만,
커피 bitterness의 상세한 분자적 기초는
5가지 인간의 쓴맛 수용체들을 활성화하는 카페인을 제외하고는 잘 이해되지 않고 있다.
우리는
인간의 쓴맛 수용체들의 cDNAs를 표현하는 포유류 세포들(mammalian cells)을 사용하는
기능성 칼슘 영상화 실험들(functional calcium imaging experiments),
관능 실험들(sensory experiments), 그리고
가상(인실리코) 모델링 어푸로치(in silico modeling approaches)를 이용하여
카페인 이외에 다른 쓴맛 성분들의 공헌을 설명했다.
우리는
카페인에 대해서 보다 훨씬 더 높은 민감성으로 쓴맛물질 mozambioside에 반응한
2개의 인간의 쓴맛 수용체들(human bitter taste receptors) TAS2R43 and TAS2R46를 식별했다.
나아가,
구조적으로 관계된 쓴맛 물질들 bengalensol, cafestol, 그리고 kahweol도
전형적인 커피 쓴맛물질 카페인 보다 훨씬 더 강력하게(much more potently)
그 두 가지 쓴맛 수용체들을 활성화했다.
그러나, TAS2R43 and TAS2R46의 유력하지만 약한 활성자인 kahweol의 경우에는,
TAS2R43 발현 세포에 mozambioside와 동시에 함께 적용되었을 때 억제효과를 관찰했다.
분자 모델링 실험들은
그 수용체 리간드 결합공동(binding cavity) 내의 결합지점들의 중복(overlapping binding sites)을 보여주어,
커피-함유 음료들의 전체적인 쓴맛(overall bitterness)을 경감하는데 유용할 수도 있을 것이라는 것을 제시한다.
아울러, 우리는
커피의 쓴맛은 복수의 쓴맛 화합물들과 몇가지 인간 쓴맛 수용체들과의
복잡한 상호작용(a complex interaction)에 의해 결정된다는 것을 발견했다.

Introduction

다양한 종류의 커피는 쓴맛에도 불구하고 전 세계적으로 가장 널리 소비되는 음료 중 하나이다.
커피의 가장 잘 알려진 쓴맛 성분은
methylxanthine alkaloid인 카페인으로, 뚜렷한 약리학적 활성을 가지고 있다.
가장 두드러진 생리 활성 중 하나이자, 아마도 높은 소비량의 이유일 수 있는 것은
중추 신경계를 자극하는 기능인데,[1]
이는 주로 아데노신 수용체 길항작용(adenosine receptor antagonism)에 기인한다.[2]
카페인의 쓴맛은 추정하건대
인간의 쓴맛 수용체(human bitter taste receptors) 25가지 중 5가지의 활성화로 인해 발생한다.[3]
G protein-coupled receptors (GPCR)이라는 상과(superfamily)에 속하는
taste 2 receptors (TAS2R)[4-6]라고 불리는 쓴맛 수용체들(bitter taste receptors)은
구강(oral cavity) 내의 味蕾들(taste buds)에서 발현되며,[7]
잠재적으로 독성이 있는 식품 성분의 섭취에 대한 경고 기능을 하는 것으로 알려져 있다.
그러나 성인은 적당한 쓴맛을 참거나 심지어 선호하기도 한다.[8]
최근 카페인이 구강을 통과한 후에도 쓴맛 수용체와 계속 상호 작용한다는 것이 입증되었다.[9]
인체 개입 연구에 따르면, 口腔(oral), 口腔 + 胃, 胃(gastric)의 자극 경로에 따라,
카페인은 口腔 및 胃의 TAS2Rs를 자극하여,
다양한 시간 패턴으로 위산 분비를 유발하는 것으로 나타났다.[9]
카페인은 커피에서 가장 잘 알려진 쓴맛 성분일 수는 있어도,
쓴맛을 유발하는 유일한 자극 물질은 단연코 아니다.
최근, 주로 아라비카 커피 콩들에 존재하는
푸로카우란 배당체(furokaurane glycoside)인 모잠바이오사이드가 발견되었다.[10]
모잠바이오사이드 농도는
로스팅 되지 않은 커피에서 가장 높았는데, 이는 높은 로스팅 온도에서 부분적으로 분해됨을 시사한다.
쓴맛 인지 식역치가 60 μM인 모잠바이오사이드는
카페인보다 약 10배 더 강력하며,
이전에 확인된
2,5-diketopiperazines(디케토피페라진) [11]과
(furan-2-yl)methylated benzene diols and triols [12]보다도 더 강력하다.
로스팅된 커피에 풍부한
mono/di-O-caffeoyl quinides 그리고
hydroxylated phenylindanes [13-17]과 같은 몇 가지 추가적인 쓴맛 물질은
모잠바이오사이드와 동일한 쓴맛 식역치를 나타낸다.
그러나 카페인을 제외하고, 커피 특유의 쓴맛 화합물들의 쓴맛 수용체 활성화 스펙트럼은 알려져 있지 않다.
본 연구는
⇒ 커피의 전형적인 풍부한 쓴맛의 분자적 기초를 규명하고,
⇒ 카페인에 비해 모잠바이사이드의 효능이 더 높은 이유를 밝히기 위해,
⇒ 포유류 세포계(mammalian cell line)에서 발현되는 25개의 모든 인간 TAS2Rs의 cDNA를 이용한
기능적 스크리닝 접근법(functional screening approach)을 적용했다.
⇒ 식별된 모잠바이오사이드 수용체들을 추가로 분석하여
용량-반응 관계(dose-response relationships)를 구했다.

Materials and Methods

Chemicals and materials.

Mozambioside는
뮌헨 공과대학교 식품화학 및 분자감각과학 연구실(the Chair of Food Chemistry and Molecular Sensory Science)에서
이전에 기술된 방법[10]을 사용하여 분리하고, RP-HPLC로 정제했다.
HPLC-UV (280 nm) 및 ¹H NMR spectroscopy를 기준으로 최종 산물의 순도는 98% 이상인 것으로 측정되었다.
Caffeine, cafestol, kahweol은 Sigma-Aldrich(Steinheim, Germany)에서 구입했다.
Mozambioside와 Caffeine은
C1 buffer (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 10 mM glucose, 10 mM HEPES; pH 7.4)에
9 mM로, 다른 화합물은 DMSO에 10 mM로 용해했다.
모든 시험 화합물은 -20°C에 보관했다.
분리 및 정제된 벵갈렌솔(bengalensol) (아래 참조)은 NMR 분석을 위해 d₄-methanol에 용해했다.
스펙트럼(¹H, ¹³C, Cosy, HMBC, HSQC)은
Bruker Avance III 시스템 (Bruker, Rheinstetten, Germany)을 사용하여 측정했다.
정밀 질량 데이터는
Waters Synapt G2 S HDMS 질량 분석기 (Waters, Manchester, UK)를
Acquity UPLC core system (Waters, Milford, MA, USA)에 연결하여 수집했다.
분리된 화합물들은 BEH Phenyl column (50×2 mm, 1.7 μM)에서
aqueous formic acid (0.1%)과 ACN을 사용하여 크로마토그래피를 수행했다. [10]

Isolation of bengalensol.

순수 모잠바이오사이드 에탄올 용액(20 mg/mL, 1 mL)을
피펫으로 옮겨 반응 용기에 넣고 질소 기류에서 증발시켰다.
용기를 닫고 열처리(235℃, 12분)를 위해 가열 블록으로 옮겼다.
실온으로 냉각한 후,
로스트 산물 혼합물을 15% ACN 수용액 (3 ml)에 녹인 후,
반분취용 C18 컬럼 (Hyperclone, 5μ, 250×10 mm, Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)을 사용하여 HPLC-UV (280 nm)로 분리하였다.
이 때, 유속(flow rate)은
溶出(溶出物 A는 물에 녹인 0.1% 포름산, 溶出液 B는 CAN을 사용)과 500 μL-주입으로
6 mL/min로 하였다.
크로마토그래피 gradient는
15% B (5분)에서 시작하여, 35분 이내에 B를 45%까지 증가시키고, 等溶媒(isocratic) (9분)를 유지했다.
시작 조건은 1분 이내에 재설정되었고, 다음 주입 전 10분 동안 유지되었다.
개별 피크들은 HPLC-UV 용출물로부터 수작업으로 수집하여,
API Sciex 3200 triple quad mass spectrometer
(Q1 scan mode, ESI+, source temperature 400 ℃, declustering potential 40V,
ion spray voltage 5kV, mass range m/z 150~1000, loop injection,
50/50 ACN/water, 250 μL/min)에서
루프 주입(loop-injections)을 통해 MS로 분석했다.
Rt. 26.8 min에서 HPLC-UV-effluent로부터 수집된 피크는
벵갈렌솔(bengalensol)으로 확인되었으며 (pseudomolecular ion m/z 329 [M+H]⁺ 기준),
동결 건조하여 백색 분말 형태로 1.57 mg을 얻었다.
UPLC-ToF-MS 및 NMR 실험을 통해 그 정체가 확인되었다.
스펙트로스코픽 데이터는 공개된 데이터와 매우 일치했다.[18]
UV (H2O/ACN/formic acid 67/32.9/0.1, v/v/v) 280 nm;
UPLC-ToF-MS (ESI⁺) found m/z 329.1753, calculated 329.1753 (Δ 0.1 mDa) for C₂₀H₂₅O₄ ([M+H]⁺);
¹H NMR (MeOD, 500 MHz) δ 1.05 (3H, s, H20), 1.33 (1H, m, H12a), 1.50 – 1.68 (4H, m, H6a, H7a, H15a, H15b), 1.82 (1H, m, H7b), 1.89 (1H, m, H14a), 2.02 (1H, m, H9), 2.08 – 2.15 (2H, m, H12b, H14b), 2.55 – 2.57 (2H, m, H1a, H13), 2.66 (1H, d, J=16.0 Hz, H1b), 2.91 (1H, dd, J=12.2, 2.1 Hz, H5), 3.60 (1H, d, J=11.8 Hz, H17a), 3.69 (1H, d, J=11.8 Hz, H17b), 4.44 (1H, bs, H11), 6.60 (1H, d, J=1.7 Hz, H18), 7.80 (1H, d, J=1.7 Hz, H19);
¹³C NMR (MeOD, 125 MHz) δ 16.1 (C20, CH3), 22.2 (C6, CH2), 36.8 (C7, CH2), 40.3 (C14, CH), 42.4 (C13, CH2), 43.3 (C10, C), 43.6 (C12, CH2), 44.7 (C8, C), 45.9 (C5, CH), 52.9 (C15, CH2), 53.9 (C1, CH2), 56.1 (C9, CH), 65.1 (C17, CH2), 77.5 (C11, CH), 90.0 (C16, C), 110.8 (C18, CH), 143.0 (C4, C), 146.0 (C3, C), 149.5 (C19, CH), 186.0 (C2, C).

Functional calcium mobilization assay.

Functional calcium mobilization assays (기능적 칼슘 동원 분석)가
선행연구들에서 이전에 발표된 바와 같이 수행되었다. [3, 19-20]
간단히 말해,
G protein chimera Gα16gust44 [21]를 안정적으로 발현하는 HEK 293T 세포를
10% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 37°C, 5% CO₂ 조건으로 96-well-plates에서 배양하여
약 60%의 confluence (융합)에 도달할 때까지 배양한 후,
lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여
25개의 인간 TAS2Rs에 대한 cDNA constructs coding으로 일시적으로 형질이입했다 (transfected).
각 화합물-수용체 조합에 대해 96-well-plate에 동일한 웰들을 복제하여 형질이입시켰다.
음성 대조군으로 empty vector (모의 벡터, mock)를 형질이입시켰다.
형질이입(24-26시간) 후,
세포에 칼슘 민감성 염료인 Fluo4-AM (Thermo Fisher Scientific)을
프로베네시드(probenecid) (2.5 mM)와 함께 1시간 동안 처리하고,
C1 buffer으로 세척한 후,
형광 이미징 플레이트 리더기(fluorometric imaging plate reader) (FLIPRtetra, Molecular Devices)에 넣었다.
시험 화합물들(최종 농도의 3배)을
수용체-형질이입된 세포들(receptor-transfected cells)에 자동으로 적용했다.
시험 화합물 적용 전후 488 nm에서 여기(excitation)시킨 후,
510 nm에서 형광 변화를 기록했다.
소마토스타틴(somatostatin) 14 (100 nM, Bachem)를 두 번째 적용하여
세포 활력(cell vitality)을 평가했다.
Determination of half maximal effective concentration (EC₅₀) and
threshold values of TAS2R43 and TAS2R46 activation.
TAS2R43 및 TAS2R46 활성화의 최대반감 유효농도 (EC₅₀) 및 식역치 측정.
용량-반응 관계(dose-response relationships) 정립을 위해
HEK 293T-Gα16gust44 세포들에
각각 TAS2R43 및 TAS2R46를 코딩하는 cDNA constructs로 일시적으로 형질이입시키고,
각 화합물의 농도를 증가시켜 처리하였다 (형광 측정 시 최종 농도: C1 buffer 중 0.03~1000 μM).
TAS2R43에 대한 陽性對照群(positive control)으로는
aristolochic acid(아리스톨로크산)(최종 농도: 10 μM)과
TAS2R46에 대한 strychnine(스트리크닌)(최종 농도: 30 μM)을 각각 사용하였다.
데이터는 3회 반복하여 수행한 독립적인 실험에서 수집하였다.
모의-형질이입된 세포의 형광 변화(fluorescence change)를
해당 수용체 발현 세포의 형광 변화에서 뺐다.
세포 밀도 차이를 보정하기 위해, 신호들을 배경 형광(background fluorescence)으로 정규화했다.
용량-반응 관계(Dose-response relationships)는
信號振幅(signal amplitudes)을 로그 화합물 농도에 대해 그래프로 표시하여 정립했다.
half maximal effective concentration (EC₅₀)는
y = (max – min) / [1 + (x/EC₅₀)^-Hillslope] + min
(여기서 x는 substance concentration)이라는 등식을 사용하여
비선형 회귀분석(nonlinear regression)에 의해 파악되었다.
모든 계산과 그래프는 SigmaPlot 14.0으로 수행되었다.
Competition Experiment.
경쟁 실험(competition experiment) 진행을 위해,
HEK 293T-Gα16gust44 세포들을
cDNA constructs coding for TAS2R43로 일시적으로 형질이입시키고,
카웨올 농도를 증가시켜 처리했다
(형광 측정 시 최종 농도: C1 buffer에 카웨올 0.1~30 μM을 첨가한 100 μM 모잠바이오사이드).
데이터는 3회 반복하여 수행한 독립적인 실험들로부터 수집했다.
측정, 처리 및 분석은 위에 설명된 바와 같이 수행되었다.

Molecular modelling.

모잠바이오사이드, 벵갈렌솔, 카페스톨, 카웨올의 구조는 Builder 툴을 사용해 구축하고,
LigPrep을 이용하여 pH 7 ± 0.5에서
stereoisomers (입체이성질체)와 protonation states (양성자화 상태)를 생성하여
도킹(docking)을 준비했다.
이 과정은
Schrödinger Small-Molecule Drug Discovery Suite 2018-3
(Schrödinger, LLC, New York, NY, 2018)에 구현된 바와 같다.
TAS2R43의 3D 구조 모델은 BitterDB에서 다운로드했다.[22]
그런 다음,
Schrödinger Induced-Fit (IF) 도킹 프로토콜(Schrödinger Suite 2018-3 Induced Fit Docking protocol; Glide, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2018; Prime, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2018) [23]을 사용하여,
분석된 화합물 중 가장 부피가 큰 모잠바이오사이드의 결합 모드를 조사했다.
IF는 확장된 샘플링을 사용하여 수행되었으며,
그 리간드 포즈(ligand pose)에서 5Å 떨어진 잔류물의 측쇄는 유연하게 설정되었다.
결합 부위(binding site)는 Trp88 ^3.32와 Phe261 ^7.35 잔류물의 중심으로 설정되었다.
그 manuscript 전체에서,
transmembrane (TM) residues (막관통 잔류물)은
Ballesteros-Weinstein (BW) 방법에 따라 윗첨자 번호로 식별된다 [24] :
TM 번호 X에서 클래스 A GPCRs의 가장 보존된 잔류물에 해당하는 잔류물은 index X.50으로 지정되고,
나머지 잔류물은 이 위치를 기준으로 번호를 매긴다.
그런 다음,
Glide Standard Precision (Schrödinger Suite 2018-3)을 사용하여,
IF 계산에서 얻은 TAS2R43 수용체 구조에 대한
bengalensol, cafestol 및 kahweol의 도킹 시뮬레이션을 수행했다.
격자 상자(the grid box)는 도킹된 모잠바이오사이드의 중심이었다.

Human sensory experiments.

General conditions and panel training.
본 연구의 센서리 테스트 참여에 대한 사전 동의를 받은 후,
11명의 평가자(여성 7명, 남성 4명, 24~44세)는
최소 1년 동안 센서리 실험 교육을 받아 사용된 방법론과 미각 언어에 익숙해졌다.
센서리 실험은 20~23°C의 에어컨이 설치된 센서리 부스에서 황색 조명 조건 하에 진행되었다.
아로마-활성 화합물들과의 교차-모달 상호작용(cross-modal interactions)을 최소화하기 위해,
패널리스트들은 센서리 평가 시 코 클립을 사용했다.
Modified Half-Tongue and Two-Alternative Forced Choice Test.
변형된 반설테스트 및 이지선택형 테스트.
kahweol의 맛 식역 농도(taste threshold concentration)를 측정하기 위해,
앞서 설명한 바와 같이 일부 변형된 half-tongue test를
여과지 직사각형(1×2 cm²; AeroPress Micro-Filter, California, USA)에 적용했다.[25]
더 자세히 설명하면,
kahweol과 cafestol을 에탄올에 최종 농도 60 mM로 용해했다.
이 용액 10 μL를 직사각형 여과지에 도포하고 38°C에서 용매를 제거했다.
대조군으로, 직사각형 여과지에 에탄올 10 μL(blank)을 채운 후 38°C에서 증발시켰다.
물로 입을 헹군 후,
패널리스트들에게 자극물이 담긴 종이 직사각형을 혀 앞쪽의 오른쪽 또는 왼쪽에 놓고,
반대쪽에는 익명화된 대조군 직사각형(빈종이)을 놓고,
쓴맛 및/또는 떫은맛을 느낄 수 있는 혀 쪽을 찾도록 요청했다.
또는, 패널리스트들에게 변형된 두 가지 대안 강제 선택 테스트를 실시하도록 했다.
자극물이 담긴 종이 직사각형과 익명화된 대조군 직사각형을 차례로 맛보고 샘플 사이에 입을 헹구었다.
이 시험 구성을 사용하여 패널리스트들은 쓴맛 및/또는 떫은맛을 유발하는 샘플을 표시해야 했다.
kahweol의 쓴맛 인지 식역 농도를 대략적으로 결정하기 위해,
38℃에서 용매를 제거한 후 kahweol의 에탄올 용액을 종이 운반체에 담가
60, 150, 300, 600 nmol/1×2cm²의 농도를 얻었다.
연속적 희석액들을 농도가 증가하는 순서로 센서리 패널에게 제시하고,
각 희석액의 쓴맛을
modified half-tongue test 또는 위에 자세히 설명된 두 가지 대안 강제 선택 테스트를 통해 평가했다.
각 패널의 개별 맛 식역치는
처음 놓친 농도와 마지막으로 정확하게 식별된 농도의 기하 평균으로 결정되었다.
센서리 패널의 식역치를 결정하기 위해 개별 식역치들의 평균을 구했다.

Results and Discussion

Screening for TAS2Rs activated by mozambioside.

모잠바이오사이드에 의해 활성화되는 인간의 쓴맛 수용체(human bitter taste receptors)를 확인하기 위해,
chimeric G protein Gα16gust44를 안정적으로 발현하는 HEK 293T-cells를 이용하여
기능적 칼슘 이미징 실험(functional calcium imaging experiments)을 수행했다.
이 세포에
25가지 잠재적 기능성 인간 TAS2R을 일시적으로 형질이입시켰을 뿐만 아니라,
陰性 대조군으로 빈 벡터를 사용하고,
3 mM 및 0.1 mM mozambioside를 사용하여 스크리닝했다.
陽性 대조군(제시되지 않음)으로는
aristolochic acid (최종 농도 30 μM 및 3 μM)로 자극한 TAS2R14 [26],
strychnine (최종 농도 300 μM 및 30 μM)으로 자극한 TAS2R10 [27],
strychnine (최종 농도 30 μM 및 3 μM)으로 자극한 TAS2R46을 사용했다 [28].
3 mM 농도의 mozambioside는 강력한 cellular artefacts를 생성한 반면,
0.1 mM의 mozambioside는 25개의 TAS2R 중 2개를 특이적으로 활성화시켰다 (Figure 1).
caffeine은
5개의 수용체인 TAS2R7, -R10, -R14, -R43, -R46의 반응을 유도한 반면,
mozambioside는
TAS2R43과 TAS2R46만 활성화시켰으며,
이는 카페인에 의해 활성화되는 TAS2R의 일부에 불과했다.

Figure 1. 모잠바이오사이드-활성화된 인간의 TAS2Rs에 대한 기능적 스크리닝.
A) 모잠바이오사이드의 구조식
B) HEK 293T-Gα16gust44 세포들에 잠재적으로 기능하는 25가지 인간 쓴맛 수용체를 코딩하는 cDNA를 일시적으로 형질이입시켰다. 형질이입 후, 세포들에 칼슘 민감성 염료인 Fluo4-am을 첨가하고, 100 μM 모잠바이오사이드(mozambioside) 처리 시 형광 변화를 형광 이미징 플레이트 판독기(FLIPR-tetra)를 사용하여 모니터링했다. 원시 형광 흔적들이 해당 TAS2R과 함께 표시되어 있다. TAS2R43 및 TAS2R46을 발현하는 세포의 일시적인 형광 변화는 화살표로 표시되어 있다. 스케일 바(오른쪽 하단 모서리); 2000 상대 형광 단위, 200초.

Comparing the potencies of mozambioside and caffeine.

선행연구의 이전 센서리 실험들에서
모잠바이오사이드가 카페인에 비해 상당히 높은 효능을 나타냄이 밝혀졌으므로 [10],
본 연구에서는
TAS2R43 및 TAS2R46을 형질이입시킨 HEK 293T-Gα16gust44 세포를 이용하여
두 모잠바이오사이드 반응성 수용체에 대한 카페인과의
전체 용량-반응 관계(full dose-response relationships)를 비교 분석했다 (Figure 2).
모잠바이오사이드는
~30 μM의 식역 농도에서 TAS2R43을 활성화시켰지만,
TAS2R46 반응성은 약 300 μM의 농도에서 분명했다.
TAS2R43을 발현하는 세포에서
수용체 반응이 포화됨을 통해
최대-반 활성화 농도(half-maximal activating concentration) (EC₅₀)를
측정할 수 있었는데, 이는 50.6 ± 13.8 μM이었다.
카페인의 경우, 두 수용체 모두 1 mM의 식역 농도를 나타냈으며,
TAS2R43이 더 높은 신호 진폭을 보였다.
따라서 모잠바이오사이드가 TAS2R43에서 가장 높은 효능을 보였다.
모잠바이오사이드로 활성화된 TAS2R43의 EC₅₀ 농도는
이전에 관찰된 센서리 인지 식역인 60 μM10과 거의 일치하며,
이는 이 수용체가 인간에서 이 화합물의 민감한 감지를 담당함을 시사한다.
흥미롭게도, 쓴맛 수용체 유전자와 커피-선호의 연관성을 조사한 이전 연구에서는
TAS2R43 유전자의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms)과
유의미한 상관관계를 발견하여,
이 수용체가 인간의 커피 쓴맛 인지에 지배적인 역할을 한다는 것을 입증한 바 있다 [29].
TAS2R43 기능과 관련된 것으로 알려진
2개의 non-synonymous single nucleotide polymorphisms (비동의 단일염기다형성)[30-31]은
수용체의 첫 번째 (35번 위치; Trp=fully functional, Ser=reduced function)와
세 번째(212번 위치; His 또는 Arg=functionally similar)
세포 내 루프(intracellular loops)의 리간드 결합 포켓(ligand binding pocket)에서 멀리 떨어져 위치하므로,
리간드 결합 효과(ligand-binding effects)는 예상되지 않는다.
더욱이, TAS2R43 유전자는
a copy number polymorphism (복제수 다형성)[30-32]으로 인해
인간 유전체에서 흔히 발견되지 않는데,
이는 인간 집단 내에서 커피가 함유된 음료에 대한 개인의 쓴맛 인지에 훨씬 더 현저한 차이가 있음을 시사한다.
두 수용체 모두 카페인에 비해 낮은 농도의 모잠바이오사이드에 반응한다는 사실은
카페인에 비해 관찰된 모잠바이오사이드의 효능 증가와 잘 일치한다 [10].

Figure 2. TAS2R43 및 TAS2R46 발현 세포에서 모잠바이오사이드와 카페인의 용량-반응 관계.
HEK 293T-Gα16gust44 세포에 TAS2R43 및 TAS2R46에 대한 cDNA를 일시적으로 형질이입시켰다. 형질이입 후, 세포에 칼슘 민감성 염료인 Fluo4-am을 첨가하고, 모잠바이오사이드와 카페인 처리에 따른 형광 변화를 형광 이미징 플레이트 판독기(FLIPR-tetra)를 사용하여 모니터링하였다. 검은색 곡선은 표시된 TAS2R로 형질이입된 세포에 해당하며, 회색 곡선은 빈 발현 벡터(음성 대조군)로 형질이입된 세포에서 얻은 것이다. 식역 농도(수용체 형질이입 세포 반응이 해당 모의 형질이입 대조군 세포보다 유의하게 높은 최저 농도, n=3, p<0.01)는 별표로 표시하였다.
Y축은 상대적 형광 변화(ΔF/F), X축은 로그로 조정된 μM 단위 농도이다.

Identification of further bitter compounds activating TAS2Rs.

TAS2R을 활성화하는 추가적인 쓴맛 화합물들의 식별.
Mozambioside가 두 가지 쓴맛 수용체인 TAS2R43과 TAS2R46을 강력하게 활성화한다는 사실은
커피에 존재하는 구조적으로 유사한 화학물질들이
동일한 수용체에도 작용할 수 있는지에 대한 의문을 제기했다.
따라서 mozambioside와의 구조적 유사성을 감안하여,
bengalensol, cafestol and kahweol과 같은 화합물들을 파악했다 (Figure 3).
파악된 세 가지 물질 모두
모잠바이오사이드의 아글리콘 부분과 유사하며,
모잠바이오사이드와의 최대 공통 하위구조(maximal common substructure) 유사성은
cafestol과 kahweol의 경우 각각 0.6389 (Tanimoto coefficient는 ChemMine tools 33을 사용하여 측정)이고,
bengalensol의 경우 0.9167을 나타낸다.
또한 새롭게 동정된 이 물질들에 대한 용량-반응 관계도 얻어졌다 (Figure 3).
모잠바이오사이드에서 얻은 결과와 유사하게,
카페스톨과 벵갈렌솔 또한
TAS2R46에 비해 더 높은 효능(potency)과 효험(efficacy)으로 TAS2R43을 활성화시켰다.
Kahweol 만이 두 수용체 모두에서 유사한 효능과 효험을 보였다.
Cafestol의 경우,
TAS2R43에서 0.3μM의 최저 식역 농도가 관찰되었는데,
이는 TAS2R46의 식역 농도보다 약 30배 낮았다.
Bengalensol의 경우,
TAS2R43은 TAS2R46 (역치 농도 10μM)에 비해 약간 더 민감했다 (식역 농도 3μM).

Figure 3. TAS2R43 및 TAS2R46 발현 세포에서 카페스톨, 카웨올, 벵갈렌솔의 용량-반응 관계.
HEK 293T-Gα16gust44 세포에 TAS2R43 및 TAS2R46에 대한 cDNA를 일시적으로 형질이입시켰다. 형질이입 후, 세포에 칼슘 민감성 염료인 Fluo4-am을 첨가하고, 카페스톨, 카웨올, 벵갈렌솔 처리에 따른 형광 변화(구조식은 패널 상단 참조)를 형광 이미징 플레이트 판독기(FLIPR-tetra)를 사용하여 모니터링했다. 검은색 곡선은 표시된 TAS2R로 형질이입된 세포에 해당하며, 회색 곡선은 빈 발현 벡터(음성 대조군)로 형질이입된 세포에서 얻은 것이다. 식역 농도(수용체 형질이입 세포 반응이 해당 모의 형질이입 대조군 세포보다 유의하게 높은 최저 농도, n=3, p<0.01)는 별표로 표시했다.
Y축은 상대적 형광 변화(Δ F/F), X축은 로그로 조정된 농도(μM)이다.

TAS2R43에서 카페스톨과 벵갈렌솔의 EC₅₀-값은
3.9±0.8 μM 및 3.9±0.3 μM으로 거의 동일했으며, 모잠바이오사이드보다 낮았다.
마찬가지로, TAS2R46은
카페스톨(7.8±3.5 μM)과 벵갈렌솔(11.9±1.1 μM)로 자극했을 때 비슷한 EC₅₀-값을 보였다.
모잠바이오사이드의 경우,
TAS2R46 반응의 포화 부족으로 이 값을 측정할 수 없었기 때문에
EC₅₀-값을 모잠바이오사이드와 비교하는 것은 불가능했다.
그럼에도 불구하고, 본 연구의 데이터는
카페스톨과 벵갈렌솔이 모잠바이오사이드에 비해 TAS2R46에 더 강력한 자극을 줄 가능성이 있음을 시사한다.
이에 대한 직접적인 증거는 없지만,
모잠바이오사이드의 당 부분(sugar moiety)이 입체 장애(sterical hindrance)로 인해
수용체의 결합 포켓(binding pockets)에 대한 적합성을 감소시킨다고 추측해 볼 수 있다.
이는 여러 수용체 및 화합물 특이적 매개변수에 의존할 수 있는데,
이전 연구에서
TAS2R46은 glycoside-aglycon pair인 wogonoside와 wogonin에 의해
유사한 효능(효능 차이는 있지만)으로 활성화되는 반면,
wogonin만이 TAS2R14를 활성화할 수 있었고, 우고노사이드는 활성화할 수 없었다 [34].
흥미롭게도,
또 다른 물질 쌍인 glycoside baicalin (배당체 바이칼린)과
이에 상응하는 아글리콘 baicalein(바이칼레인)은
아글리콘에 대한 TAS2R14의 이러한 편향을 보이지 않았지만, 오히려 유사한 활성화 특성을 보였다 [34].
후속적으로 파악된 이들 세 가지 물질들로
25개의 모든 인간 TAS2R에 대한 스크리닝을 수행하지 않았다는 점에 유의하는 것이 중요하며,
따라서 이러한 쓴맛 화합물에 의한 추가적인 잠재적 TAS2R 활성화를 배제할 수는 없다.

Probing for competitive effects among identified TAS2R agonists.

확인된 TAS2R 작용제 간의 경쟁적 효과 탐색.
mozambioside, cafestol, bengalensol과는 달리,
kahweol은 두 수용체에 제한된 효능과 효과로 작용했다.
이는 이 물질이 다른 화합물과의 강력한 구조적 연관성에도 불구하고
낮은 친화도의 작용제이거나, 두 수용체에 제한된 효능을 나타내는 부분 作用劑일 가능성을 시사한다.
이 의문을 해소하기 위해,
이 수용체-화합물 쌍에서 얻은 더 큰 신호 진폭(larger signal amplitudes)에서 득을 보기 위해,
모잠바이오사이드로 자극된 TAS2R43 발현 세포를 사용하여 경쟁 실험을 수행하기로 했다 (Figure 4).
이 실험에서는
TAS2R43 발현 세포를 100 μM의 mozambioside와 증가하는 kahweol 농도로 자극했다.
Kahweol 10 μM부터 시작하여 TAS2R43 신호가 유의미하게 감소하는 것이 관찰되었다.
Mozambioside와의 성공적인 경쟁에 필요한 kahweol의 농도가 100 μM보다 낮았으므로,
kahweol은 低親和力作用劑(low affinity agonist)라기보다는
TAS2R43의 部分的作用劑(partial agonist)라고 제시하는 바이다.

Figure 4. 카웨올과 모잠바이오사이드를 처리한 TAS2R43 발현 세포의 억제 곡선.
HEK 293T-Gα16gust44 세포에 TAS2R43 cDNA를 일시적으로 형질이입시켰다. 형질이입 후, 세포에 칼슘 민감성 염료인 Fluo4-am을 첨가하고, 모잠바이오사이드(100μM 상수)를 처리하고, 카웨올 농도를 증가시키면서 형광 변화를 형광 이미징 플레이트 리더(FLIPR-tetra)를 사용하여 모니터링하였다. 검은색 곡선은 TAS2R43을 처리한 세포에 해당하며, 회색 곡선은 빈 발현 벡터(음성 대조군)를 처리한 세포에서 얻은 것이다. 카웨올의 최저 억제 농도(수용체 형질이입 후 세포 반응이 모잠바이오사이드 단독 처리 시보다 유의미하게 낮은 최저 농도, n=3, p<0.01)는 별표로 표시하였다.
Y축은 상대적 형광 변화(ΔF/F), X축은 대수적으로 조정된 μM 단위 농도이다.

Molecular modelling and docking of newly identified bitter agonists.

새롭게 식별된 쓴맛 작용제의 분자 모델링 및 도킹.
수용체-구조 맥락에서,
TAS2R43 결합(binding) 및 활성화(activation)에 대한 모잠바이오사이드와 카웨올의 경쟁을
더욱 자세히 탐구하기 위해
상동성 모델링(homology modelling) 및 리간드 도킹(ligand docking) 실험을 수행했다.
사용 가능한 실험적 GPCR 구조를 가진
쓴맛 수용체의 낮은 서열 상동성(low sequence homology) 때문에,
리간드-TAS2R 상호작용을 시뮬레이션하기 위해서는
결합 부위의 넓은 구조적 공간을 샘플링하는 것이 필수적이다 [35].
따라서 모잠바이오사이드와 결합 부위 잔기(binding site residues)
모두의 유연성을 허용하는 유도 적합 시뮬레이션(induced-fit simulations)을 수행했다.
최고 점수(즉, -7.79 kcal/mol의 도킹 점수)를 갖는 도킹 포즈가 Figure 5에 나타나 있으며,
모잠바이오사이드가 수용체 결합 부위에서
Asn176 ^5.39 및 Lys265 ^7.39와 수소 결합 접촉을 형성함을 보여준다.
TAS2R43 binding site는
두 개의 트립토판 잔기(tryptophan residues)인
Trp66 ^2.61과 Trp88 ^3.32에 의해 추가적으로 형성되며,
이는 리간드와의 疏水性相互作用을 설명한다.
흥미롭게도, 리간드는
나프토푸란基(naphthofuran group)와 함께 결합 부위의 바닥에 위치하는데,
이는 다른 두 作用劑인 카페스톨과 벵갈렌솔, 그리고 부분적 작용제인 카웨올과 공통적인 핵심 구조이다.
모잠바이오사이드의 경우,
글리코실 부분(glycosyl moiety)이
두 번째 세포외 루프(extracellular loop) 방향을 가리키는 용매에 더 많이 노출된다.
이는 TAS2R16의 리간드 결합 포켓에
도킹 되었을 때의 쓴맛 배당체의 방향(orientation of bitter glycosides)과 유사하다 [36].

Figure 5. TAS2R43 모델에 대한 모잠바이사이드의 예측 결합 모드.
A) 결합 모드의 3D 표현. 리간드는 결합 부위 하단에 나프토푸란基(naphthofuran group)(노란색)를, 상단에 글리코실 성분(glycosyl moiety)(청록색)를 위치시켜 세포외 루프(ECL2)와 상호작용한다. ECL2 모델링의 불확실성 때문에, 그리고 명확성을 위해, 이 루프는 시각화하지 않았다.
B) 결합 모드의 2D 표현. 수소-결합 상호작용들은 녹색 점선으로, 소수성 상호작용은 주황색 점선으로 표시했다.

실제로, 카페스톨, 카웨올, 벵갈렌솔의 도킹 시뮬레이션은
분석된 모든 화합물이 오르토스테릭 결합 부위(orthosteric binding site)에 위치하며
유사한 상호작용 패턴을 공유함을 확인시켜 준다 (Figure 6).
여기서 확인된 작용제 상호작용에 관여하는 위치는
이미 발표된 인간 TAS2R 구조-기능 분석 결과와 잘 일치한다.
실제로, Trp66 ^2.61, Trp88 ^3.32, Asn176 ^5.39, Lys265 ^7.39의 네 가지 위치 모두
작용제 상호작용에 중요한 것으로 이전에 밝혀졌다.
Trp66 ^2.61, Asn176 ^5.39, Lys265 ^7.39가
스트리크닌(strychnine)에 의한 TAS2R46 활성화에 중요한 것으로 밝혀진 반면 [37],
Trp88 ^3.32는
작용제에 의한 TAS2R43 및 TAS2R30 활성화에 관여하는 것으로 알려져 있다 [38].
또한, 수용체 TAS2R10에서 Asn176 ^5.39에 인접한 잔기,
즉 Gln175 ^5.40과 Lys265 ^7.39와 동일한 위치(Met263 ^7.39)가
작용제 반응성에 중요한 것으로 확인되었다 [27].
마지막으로, 우리는 TAS2R14 작용제 상호작용에
Trp66 ^2.61과 Lys265 ^7.39의 대응 단백질(counterparts)이 중요한 역할을 한다는 것을 발견했다 [26].

Figure 6. 카페스톨, 카웨올, 그리고 벵갈렌솔의 TAS2R43 모델로의 예측 결합 모드들.
3D 표현들은 위부분에 나와 있고, 2D 표현들은 아래 부분에 묘사되어 있다.

TAS2R43과 TAS2R46의 아미노산 시퀀스 비교 결과,
Trp66 ^2.61, Trp88 ^3.32, Asn176 ^5.39, Lys265 ^7.39가 부분적으로 보존되어 있는 것으로 나타났다. [37]
사실, 유일한 차이점은
TAS2R46이 Lys 대신 265 7.39 위치에 Glu를 가지고 있다는 것이다.
또 다른 흥미로운 사실은
매우 유사한 두 수용체인 TAS2R43과 TAS2R31이
이 네 위치 중 단 한 위치, 즉 176 ^5.39 위치에서만 차이가 있다는 것이다.
TAS2R43은 아스파라긴 잔기(asparagine residue)를 가지고 있는 반면,
TAS2R31은 아스파르트산(aspartic acid)을 가지고 있다.
Asn176 ^5.39은 H-bond donor (수소-결합 공여체)로서 4가지 물질 모두와 상호작용하는데 사용되므로,
이는 TAS2R31이 우리의 스크리닝 실험에서 아무런 반응을 보이지 않은 이유를 설명할 수 있다.
이러한 결과를 바탕으로, 카웨올은
더 강력하고 효율적인 작용제와 동일한 수용체 결합 부위에 대한 경쟁을 통해
커피 제품의 쓴맛을 감소시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있다고 추정할 수 있다.
카웨올은
그것의 지질 앵커(lipid anchor)로 인해 추출된 커피에서 여과를 통해 자주 제거되므로 [39],
카웨올을 첨가한 커피 음료는
TAS2R43 작용제의 쓴맛에 민감한 사람들의 전반적인 맛을 개선할 수 있을 것이다.

Human sensory experiments.

현재까지 카웨올과 카페스톨의 쓴맛에 대한 센서리 데이터가 기록되어 있지 않으므로,
경험이 풍부한 인간 패널리스트를 대상으로 센서리 평가를 수행했다.
카웨올과 카페스톨의 쓴맛을 평가하기 위해,
두 물질 모두 제한된 水溶性(water solubility)을 보였기 때문에,
변형된 반설 시험 (modified half-tongue test) 또는
변형된 이지 강제 택일 테스트(modified two-alternative forced choice test)를 사용했다.
5% 에탄올(v/v) 또는 0.3% DMSO(v/v)에 물질을 용해하더라도
현탁액이 형성되어 센서리 평가에 방해가 되었다.
DMSO 농도가 높을수록 강한 쓴맛이 유발된다는 사실,
예를 들어 DMSO는 인간 쓴맛 수용체인 TAS2R38의 작용제이기 때문에 [40],
카페스톨과 카웨올의 센서리 영향을 분석하기 위해 대체 테스트 설정을 따랐다.
쓴맛 식역 농도를 측정하기 위해,
종이 賦形劑 (paper vehicles)(1×2cm)에
센소메타볼라이트(sensometabolite)를 연속 희석하여 적재하고,
패널리스트의 선호도에 따라
반설 시험(half-tongue test) 또는
이지 강제 선택 시험(two-alternative forced-choice test)을 통해 평가했다.
Cafestol은
테스트 최대 농도인 300 nmol/㎠까지 쓴맛을 느끼지 못했지만,
kahweol은
미각 인지 식역 농도인 55 nmol/ ㎠에서 쓴맛을 유발했다.
Kahweol에 탄소 이중 결합(carbon double-bond)이 하나 더 존재한다는 점을 제외하면
두 화합물은 매우 유사하지만,
용해도의 작지만 중요한 차이가 쓴맛 감지에서 관찰된 차이를 설명할 수 있을 것으로 추측한다.
실제로 ALOGPS 계산 (ALOGPS 2.1 소프트웨어 [41])에 따르면,
cafestol의 용해도(solubility)는 0.018 g/L로, kahweol (0.02g/L)보다 10% 더 낮다.
Cafestol의 예상치 못한 감지가능한 쓴맛의 부재에 대한 또 다른 설명은,
구강(oral cavity) 내 추정되는 주변-수용체 이벤트들[42]으로 인해
카웨올과 대조적으로 이 화합물이 비활성화되는 데서 발생할 수 있다.
종합적으로, 우리는
다양한 커피 쓴맛 화합물들에 반응하는 두 가지 주요 쓴맛 수용체인 TAS2R43과 TAS2R46을 확인했다.
이 수용체들은 인간에게 커피 음료의 쓴맛을 결정하는 가장 중요한 요인일 가능성이 높다.
더 나아가, 우리는 조사된 모든 화합물이
커피의 가장 유명한 성분인 카페인보다 더 강력하여
커피의 전반적인 쓴맛에 크게 기여할 수 있음을 발견했다.
그러나 커피가 함유된 음료의 실제 쓴맛 화합물 구성은
사용된 품종과 로스팅 및 추출 공정에 따라 매우 다양하다 [10, 12-16].
예를 들어, mozambioside는
거의 아라비카 콩들에서만 발견되며 로스팅 과정에서 그 함량이 크게 감소한다.[10]
따라서 아라비카 콩으로 만든 생두(볶지 않은)에는 mozambioside가 풍부하지만,
로스팅된 로부스타 콩들에는 상당히 적은 양의 mozambioside가 함유되어 있을 수 있다.
또한, cafestol과 kahweol은
일반적으로 여과를 통해 제거되므로 [39],
여과 단계가 없는 커피 제품(예: 에스프레소 또는 터키식 커피)에는 이러한 물질이 더 많이 함유되어 있다.
이는
mozambioside-responsive TAS2R43의 활성화를 감소시키는
kahweol의 능력이 발견되었기 때문에 중요하며,
이를 통해 덜 쓴맛이 나는 커피 음료의 생산이 가능해질 수 있다.
이전에 우리는
합성 감미료인 사이클라메이트(cyclamate)가
TAS2R43의 억제제 역할을 한다고 보고했다.[43]
체중을 의식하고 쓴맛에 민감한 많은 소비자들은,
사카린(saccharin)과 사이클라메이트(cyclamate)의 시판 혼합물과 같은
무칼로리 감미료(non-caloric sweeteners)로 단맛을 낸 커피를 선호하기 때문에,
쓴맛 억제는 감미료 자체 때문만이 아니라 부분적으로는 TAS2R43 억제 때문일 수 있다.
TAS2R43을 포함한 커피 반응성 TAS2R은
구강 뿐만 아니라 여러 구강 외 조직에서도 발현된다는 점에 유의해야 한다 (최근 리뷰 논문은 [44] 참조).
그러한 구강 외 조직 중 하나는 위장관(gastrointestinal tract)인데,
胃에서 카페인에 의한 TAS2R43 활성화가
위산 분비(gastric acid secretion)에 관여하는 것으로 밝혀졌다.[9]
여기에 보고된 더욱 강력한 쓴맛을 자극하는 커피 성분이
위산 분비 및 기타 생리적 과정에서도 두드러진 역할을 할 수 있는지 조사하는 것이 타당해 보인다.

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