커피나무 (family Rubiaceae, 꼭두서니科)는 코페아(Coffea)와 실란투스(Psilanthus)의 두 속(genera)으로 분류된다. 경제적으로 중요한 두 가지 재배 종인 C. arabica L.과 C. canephora Pierre를 포함하는 Coffea 속에 특별한 관심이 기울여졌다.
C. arabica (2n = 4× = 44)는 複二倍體 (amphidiploid) (Lashermes et al. 1999)인 반면,
다른 Coffea 종은 2배체 (diploid)(2n = 2 × = 22)이다.
Coffea 종의 분자 계통학(Molecular phylogenies)이 성공적으로 정립되었다 (Cros et al. 1998). 이러한 분석은 강력한 지리적 관련성(correspondence) (예: 서아프리카, 중앙아프리카, 동아프리카 및 마다가스카르)을 나타내는 여러 주요 분류군 (clades)을 제시한다. 추가 단계는 개체군의 유전적 구조와 종들 간의 유전자 흐름을 연구하는 것이다.
본 고의 목적은 커피 종의 유전 연구에 적합한 simple sequence repeats (SSRs) 또는 미세부수체 (microsatellites) (Weber & May 1989)로 알려진 일련의 분자 유전자 마커를 개발하는 것이다. 미세부수체 유전자좌(microsatellite loci)를 신뢰적으로 검출하는 11개의 프라이머 쌍(primer pairs)이 설명된다. 우리는 C. arabica와 C. canephora 유전자형(genotypes)을 판별하는 데 있어, 유전자 마커(genetic markers)로서의 잠재력을 평가하고 다양한 커피 종의 교차 증폭(cross-amplification)을 조사했다.
식물 재료(55개체)는 아프리카와 마다가스카르에서 여러 차례 수집 임무를 수행하여 얻은 것이다.
C. arabica 종은 에티오피아와 예멘의 여러 위치에서 샘플링된 32개 개체로 대표되는 반면,
C. canephora 종은 중앙아프리카 공화국, 콩고 및 코트디부아르에서 수집된 10개 개체로 대표된다.
총 13종의 커피 분류군이 조사되었다.
밀접하게 관련된 Psilanthus 屬도 P. ebracteolatus와 P. travencorensis라는 두 종으로 대표되었다.
DNA 분리는 Agwanda et al. (1997)이 설명한 대로 핵 분리 단계(nuclei isolation step)를 통해 동결 건조된 잎에서 이뤄졌다.
(TG)13 motifs (Vascotto et al. 1999)가 풍부한 부분적 게놈 라이브러리(C. arabica var. Caturra)의 DNA 클론을 자동 형광 기술(ABI sequencer)을 사용하여 시퀀싱했다.
식별된 반복의 측면 영역(flanking regions of identified repeats)에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 (Oligonucleotide primers)는 컴퓨터 프로그램 Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research)를 사용하여 11개 시퀀스들에 대해 설계되었다.
SSR 분석은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 수행되었다.
SSR 유전자좌의 PCR 증폭을 위한 반응 혼합물에는
⊙ 게놈 DNA 25ng,
⊙ Tris-HCl,
⊙ pH 9.0 10mm,
⊙ Triton X-100 0.1%,
⊙ MgCl2 1.5mm,
⊙ 각 프라이머 0.2pmol,
⊙ dCTP 0.2mm,
⊙ dGTP,
⊙ dTTP,
⊙ dATP 0.01mm,
⊙ [a33P]-dATP 0.8mCi(Amersham Pharmacia), 그리고
⊙ 0.5U의 Taq DNA polymerase (Promega)가
25mL 최종 용량에 함유되었다.
반응은 PTC-200 thermocycler (MJ Research)에서 수행되었다.
증폭 주기(amplification cycle)는
⊙ 94°C에서 초기 2분 변성,
⊙ 94°C에서 45초 동안 5회 변성,
⊙ 각 사이클마다 온도가 1도씩 감소하면서 60°C에서 1분 프라이머 어닐링, 그리고
⊙ 72°C에서 1분 30초 신장(elongation)으로 구성되었다.
그런 다음
⊙ 90°C에서 45초,
⊙ 55°C에서 1분,
⊙ 72°C에서 1분 30초의 30 사이클을 수행한 후
⊙ 72°C에서 최종 8분 신장(elongation)을 수행했다.
증폭 산물은
8m urea (요소)와 1× TBE가 포함된 6% 변성 폴리아크릴아미드 겔(denaturing polyacrylamide gel)에서
전기영동되었다.
Radioactively labelled 10-bp ladder DNA가 크기 표준으로 사용되었다.
11개의 primer pairs (프라이머 쌍)은 가변 길이 단편(variable length fragments)의 증폭에 성공적이었다 (Table 1).
11개의 미소부수체 유전자좌(microsatellite loci) 중 5개만이 C. arabica에서 다형적(polymorphic)인 것으로 나타났다.
이 결과는 C. arabica의 기원, 생식 생물학 및 진화의 결과로 유전적 다양성이 매우 낮다는 것을 보여준다 (Lashermes et al. 1999).
반면에, C. canephora의 액세션들에 걸쳐 미세부수체 유전자좌는 광범위한 유전적 다양성을 보여주었다.
평균 이형접합성 값(mean heterozygosity values)은 자가수분이 우세한 C. arabica와 자가 불화합성(self-incompatible) 종인 C. canephora에서 각각 0.04와 0.47이었다.
11개 프라이머 쌍을 사용한 종간 증폭 결과는 Table 2에 보고되어 있다.
C. arabica에서 분리된 시퀀스들로부터 설계되었지만, 이 프라이머들은 대부분의 이배체 커피 종에 대해 잘 작동했다.
Psilanthus 속의 대표자들은 두 속에 속하는 종, 즉 Coffea와 Psilanthus가 밀접하게 관련되어 있다는 가설을 뒷받침하는 프라이머 쌍으로부터 일관되게 증폭 산물을 산출했다 (Cros et al. 1998).
종합적으로, 본고에서 설명된 프라이머는 자연 식물 개체군들의 생식질 관리 및 유전자 연구와 관련하여 커피 종의 유전적 변이 수준을 조사하는데 유용한 마커를 제공할 수 있다.
- Agwanda C, Lashermes P, Trouslot P, Combes MC, Charrier A (1997)
Identification of RAPD markers for resistance to Coffee Berry Disease, Colletotrichum kahawae, in Arabica coffee.
Euphytica, 97, 241–248. - Cros J, Combes MC, Trouslot P et al. (1998)
Phylogenetic analysis of chloroplast DNA variation in Coffea L.
Molecular Phylogenetics and Evolution, 9, 109–117. - Lashermes P, Combes MC, Robert J et al. (1999)
Molecular characterisation and origin of the Coffea arabica L. genome.
Molecular General Genetics, 261, 59–266. - Vascotto F, Degli Ivanissevich S, Rovelli P et al. (1999)
Microsatellites in Coffea Arabica: construction and selection of two genomic libraries.
Proceedings of the III International Seminar on Biotechnology in the Coffee Agroindustry. Londrina, Brazil. - Weber JL, May PE (1989)
Abundant class of human DNA polymorphism which can be typed using the polymerase chain reaction.
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