- Restriction fragment length polymorphism (RFLP) 제한 단편 길이 다형성 마커를
genomic in situ hybridisation (GISH)와 함께 사용하여
이질사배체 (allotetraploid) 종 Coffea arabica (2n = 44)의 기원을 조사했다. - 잠재적인 이배체(diploid) 조상 종들의 RFLP 패턴을 C. arabica의 RFLP 패턴과 비교함으로써,
C. arabica에서 결합된 두 세트의 염색체 또는 게놈의 출처가 확인되었다. - C. arabica의 게놈 조직은 두 추정 게놈 공여자 종들로부터 동시에 표지된 전체 게놈 DNA를 프로브(probes)로 사용하여 GISH에 의해 확인되었다.
- 이러한 결과는 C. arabica가 C. eugenioides와 C. canephora 사이의 교잡화(hybridisation) 또는 이들 이배체 종들과 관련된 생태형(ecotypes)에 의해 형성된 복이배체(amphidiploid)임을 분명히 시사한다.
- 우리의 결과는 또한 C. arabica의 두 구성 게놈과 그 조상 종의 게놈 사이에 낮은 차이가 있음을 나타내며,
이는 C. arabica의 종 형성(speciation)이 비교적 최근에 발생했음을 시사한다. - 현재 커피 종의 분포를 기반으로, C. arabica 종 형성 지역을 중앙아프리카에서 정확하게 파악하는 것은 어려운 것으로 보인다. 왜냐하면 열대림의 구성과 범위가 (신생대) 제4기 후기(the late Quaternary period) 동안 상당히 다양했기 때문이다.
커피 생산은 주로 Coffea arabica L.과 C. canephora Pierre의 두 종에 의존한다. 더 높은 품질은 C. arabica와 관련이 있는데, 세계 커피 생산량의 70%를 차지한다. C. arabica는 에티오피아 남서부 고지대(highlands of South-Western Ethiopia)와 수단의 보마 고원(Boma Plateau of Sudan)에 유전적 다양성의 주요 중심지가 있다. C. arabica 개체군들은 Mount Imatong (수단)과 Mount Marsabit (케냐)에서도 보고되었다 (Berthaud and Charrier 1988).
상당한 경제적 중요성에도 불구하고, 커피나무에 대한 유전적 연구는 다소 제한적이었다.
C. arabica는 그 屬에서 유일한 4배체(tetraploid) 종(2n = 4x = 44)이며 자가수정이 가능한(self-fertile) 반면, 다른 종들은 2배체(diploid)이며 일반적으로 자가불화합성(self- incompatible)이다 (Charrier and Berthaud 1985).
이 종은 이배체-같은 감수분열 행태(diploid-like meiotic behaviour)를 보이며, C. arabica의 경우 이질사배체 기원 (allotetraploid origin)이 제안되었다 (Carvalho 1952; Grassias and Kammacher 1975).
그럼에도 불구하고, 핵형분석 (karyotyping)(Bouharmont 1959), 이배체 종과의 하이브리드들에서의 염색체 쌍 (chromosome pairing) (Krug and Mendes 1940; Monaco and Medina 1965; Chinnappa 1968; Kammacher and Capot 1972; Charrier 1978), 그리고 C. arabica의 반수체 식물(dihaploid plants)에서의 염색체 쌍 (Vishveshwara 1960; Berthaud 1976; Kammacher 1980)에 기반한 연구들은 C. arabica의 두 가지 추정 구성 게놈들 사이와, 그리고 C. arabica와 이배체 Coffea 종 사이의 현저한 염색체 친화성(marked chromosome affinity)과 실질적인 염색체 분화가 없음(absence of substantial chromosome differentiation)을 밝혀냈다.
DNA sequence analysis를 기반으로 한 최근 조사들은 C. arabica가 두 개의 이배체 Coffea 종들의 결합(association)으로 인해 초래되었다는 가설을 지지한다.
엽록체(chloroplast) DNA(Cros et al. 1998)와 핵 리보솜(nuclear ribosomal) DNA(Lashermes et al. 1997a)에서의 변이(variation) 분석이 23개 이상의 코페아 분류군을 대표하는 샘플에 대해 수행되었다.
C. arabica의 cpDNA는 C. eugenioides 및 C. sp. Moloundou의 cpDNA와 유사한 것으로 나타났으며, 이는 cpDNA의 모계 유전이 커피 나무들에서 확립되었기 때문에, C. arabica가 그 종들에 관계된 종으로부터 모계로 분기되었을 수 있었을 것이라고 제시한다 (Lashermes et al. 1996a).
한편, C. arabica의 핵 리보솜 DNA의 내부 전사 스페이서 (internal transcribed spacer)(ITS2) 영역은
C. eugenioides 및 C. sp. Moloundou의 해당 서열들로부터 현저하게 분기적(markedly divergent)이며,
canephoroid 종 (C. canephora, C. congensis 그리고 C. brevipes)에서 발견되는 서열과 거의 동일한 것으로 보인다.
전체 게놈 DNA(total genomic DNA)를 프로브(probe)로 사용하는
in situ 하이브리드화 (genomic in situ hybridisation)와 같은 분자세포유전학 분석(Molecular cytogenetic analysis)은 종종 염색체의 게놈 기원(genomic origin of chromosomes)을 밝히고, 배수체들(polyploids), 하이브리드들, 그리고 파생 육종 계통들(derived breeding lines)에서의 재배열된 염색체 세그먼트를 식별하는데 가치가 있는 것으로 밝혀졌다 (Bennett et al. 1992; Kenton et al. 1993; Orgaard et al. 1995; D'Hont et al. 1996).
더욱이, 종간 이배체 잡종(interspecific diploid hybrid)에서 두 개의 먼 이배체 커피 종 게놈들 (two distant diploid coffee species genomes)을 판별할 수 있는 가능성이 최근 보고되었다 (Barre et al. 1998).
본 연구에서는 C. arabica의 액세션들 뿐만 아니라 잠재적인 이배체 조상 종을,
핵 단일 복사 프로브(nuclear single-copy probes)를 사용하여
restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) 분석했다.
또한, 우리는 C. arabica의 부모 게놈을 구별하기 위해, genomic in situ hybridisation (GISH)를 성공적으로 사용했다.
우리는 특히 C. arabica의 게놈 구성(genome constitution)과 종 형성 방식(mode of speciation)을 결정하는 데 관심이 있었다.
RFLPs를 위해 서베이된 식물들은 다음과 같은 것들을 포함하였다.
⊙ C. arabica의 다른 잠재적 이배체 조상 종들을 대표하는 7개 액세션들
(C. canephora, C. congensis, C. eugenioides, C. sp. Moloundou),
⊙ 하나의 a dihaploid genotype (Dublin and Parvais 1976), 그리고
⊙ 2개의 대조되는 유전자형들(하나는 cultivar, 하나는 wild type)
(Lashermes et al. 1996b)을 포함하는 3개의 C. arabica 액세션들.
GISH를 위해 사용되는 식물 재료는 C. arabica의 F1 hybrid (Et 30 × Caturra)의 자손으로부터 얻어졌다.
⊙ 게놈 DNA는 Agwanda et al. (1997)에 의해 설명된 핵 분리 단계 후에
⊙ 동결 건조된 잎들로부터 분리되었다.
⊙ 제한 효소 분해 (Restriction enzyme digestion),
⊙ 겔 전기영동 (gel electrophoresis),
⊙ 알칼리 이동 (alkaline transfer),
⊙ 디곡시게닌을 사용한 DNA 프로브의 비방사성 표지화
(non-radioactive labelling of DNA probes with digoxigenin) 그리고
⊙ 서던 분석(Southern analysis)이
이전에 보고된 대로 수행되었다 (Lashermes et al. 1995).
pUC18의 C. arabica (cultivar N39)의 PstI fragment library에서 구한 핵 게놈 클론들(Nuclear genomic clones)이 프로브(probes)로 사용되었다.
프로브들은, C. canephora에서 single-copy가 되도록, 그리고 매핑에서 설립된 주요 유전자 연결그룹들의 우수한 커버범위를 제공하기 위해, 이중 반수체 유전자형들(doubled haploid genotypes)을 사용하여 사전 선발되었다 (Paillard et al. 1996; Lashermes et al., in preparation).
잘 정의된 제한 단편(restriction fragments)을 검출한 프로브/제한효소(restriction enzyme) 조합을 식별하기 위해, EcoRI, DraI 또는 HindIII로 분해된 아라비카 액세션 Et 30의 DNA를 함유하는 블롯(blots)에 대해 예비 스크린을 수행했다. 그 프로브들은 그 다음에, 본 연구에 포함된 모든 액세션들로부터의 DNAs를 함유하고 있는 Southern blots에서 사용되었고, 선정된 제한효소(restriction enzyme)로 분해되었다.
서로 다른 길이의 제한 단편들(restriction fragments)은 RFLP 유전자좌의 대립유전자(alleles of RFLP loci)로 해석되었다.
동일한 레인 내의 밴딩 강도(banding intensity)의 차이들(variations)은 대립유전자 카피 수(allele copy number)의 차이를 나타내는 것으로 가정되었다.
C. arabica에서 거의 동일한 강도의 두 밴드들이 발견되었다.
이는 동일한 유전자좌의 서로 다른 대립유전자(different alleles of the same locus), 따라서
이형접합성 (heterozygosity)을 나타내거나, 또는
다른 유전자좌들로부터 유래하는 것일 수 있었을 것이다.
그러나 C. arabica의 반수체 유전자형(dihaploid genotype)에서 관찰된 밴딩 패턴에 기초하여,
후자의 가능성이 받아들여진다.
대립유전자는 감소하는 분자량에 따라 알파벳 순서로 할당된 문자로 지정되었다.
유전자형들 간의 유전적 거리(Genetic distances, GD)는 다음과 같이 추정되었다:
Gdxy = (Nx + Ny)/(Nx + Ny + Nxy)
여기서, Nx는 ⇒ 라인 y가 아닌 라인 x에서 검출된 대립유전자의 수,
Ny는 ⇒ 라인 x가 아닌 라인 y에 있는 대립유전자의 수,
Nxy는 ⇒ x와 y 라인 모두에 존재하는 대립 유전자의 수.
Neighbour-joining tree construction method (Saitou 및 Nei 1987)에 의한 분석은
TREECOM 소프트웨어 패키지 (Van der Peer and De Wachter 1994)를 사용하여 수행되었다.
부트스트랩 방법 (bootstrap method) (Felsenstein 1985)이 트리 토폴로지의 신뢰성을 평가하기 위해 채택되었다.
화분에서 재배된 나무들로부터 뿌리 끝(Root tips)을 수확했다. 뿌리 끝은, 효소용액에서 분해시간을 뿌리의 직경에 따라 30~40분으로 단축한 점을 제외하고는, D'Hont et al. (1996)에 의해 설명된 대로 처리되었다.
염색체 스프레드(chromosome spreads)가 있는 슬라이드들을
⊙ 37°C에서 45분 동안 R-Nase(1Ig/ml)로 처리하고,
⊙ 70°C에서 2×SSC의 70% 포름아미드(formamide)에서 2.5분 동안 변성(denatured)시킨 후,
⊙ -20°C에서 에탄올 시리즈를 통해 탈수했다(dehydrated).
교잡화 혼합물(슬라이드당 30 μl)은
⊙ 50% formamide 포름아미드),
⊙ 10% dextran sulphate (덱스트란 황산염),
⊙ 2 × SSC,
⊙ 1% SDS,
⊙ 8.3 ng/μl의 digoxigenin-11-dUTP-labelled C. canephora genomic DNA (accession IF 200), 그리고
⊙ 8.3 ng/μl의 biotin-14-dUTP-labelled C. eugenioides genomic DNA (accession DA60)으로 구성되었다.
그 교잡화 혼합물을
⊙ 75℃에서 10분 동안 변성시키고,
⊙ 얼음 위에서 5분 동안 냉각시켰다.
염색체 제제를 37°C의 습한 챔버에서 밤새 배양했다.
Texas Red를 사용한 biotin과, FITC(fluorescein isothiocyanate)를 사용한 digoxigenin의 동시 검출은 Leitch et al. (1994)에서 설명한 대로 수행되었다.
모든 슬라이드는 McIlvaine citrate buffer (pH 7.0)에 용해된 21g/ml의 4,6-diaminido-2-phenylindole(DAPI)로 대조염색되었다.
그 슬라이드들을 Vectashield antifade solution (Vector Labs)에 마운트하고, Fujicolor 400 print 필름에서 사진을 찍었다.
Table 1에 설명된 10개 액세션들의 RFLP 패턴을 스터디하기 위해, 커피 게놈에 분산된 23개의 프로브(probes)가 사용되었다.
그 프로브들은 연구된 모든 액세션들에서 단순한 다형성 패턴(simple polymorphic patterns)을 나타냈고, 따라서 서로 다른 restriction fragment lengths는 RFLP-정의 유전자좌의 대립 유전자들로 쉽게 해석되었다 (Table 2).
분석된 23개의 RFLP -defined loci 중 18개(즉, 75%)가 C. arabica의 액세션들에 중복되어(in duplicate) 존재하는 것으로 나타났다.
이러한 중복들(duplications)은 이질사배체(allotetraploid) 게놈의 경우에 기대되는 두 쌍의 동조염색체들 (homoeologous chromosomes)을 나타내는 것으로 해석되었다.
C. arabica에서는 5개 유전자좌에서 단일 대립유전자(a single allele)가 검출되었다.
따라서 그 패턴들이 하나의 유전자좌를 반영하는지 아니면 동일한 대립유전자를 공유하는 두 개의 동형인, 별개의 유전자좌들을 반영하는지 여부를 결정하는 것은 불가능했다.
유전자좌당 대립유전자의 수는 2에서 7까지 다양했는데, 이는 본 연구에 사용된 액세션들 중 상당한 수준의 다형성을 반영한다.
평균적으로 유전자좌당 4.7개의 대립유전자가 식별되었다.
그러나 C. arabica는 낮은 다형성을 보였다.
C. arabica에서 41개의 유전자좌 [즉, (18×2) + 5]가 스크린되었음을 가정할 때, C. arabica의 3 액세션들 간의 다형성 유전자좌의 비율은 7%였다.
이에 비해 C. canephora와 C. congensis 액세션들에서의 다형성 유전자좌의 비율은 각각 74%와 68%였다.
또한, C. arabica에서는 이형접합성 유전자좌(heterozygous loci)가 검출되지 않았다.
대조적으로, 이배체 분류군에서의 이형접합성 유전자좌의 평균 비율은 4%(C. sp Moloundou), 23%(C. eugenioides), 27%(C. congensis), 36%(C. canephora) 범위였다.
본 연구에 포함된 2배체 및 4배체 액세션들 중에서 총 108개의 RFLP 대립유전자가 확인되었다 (Table 2).
RFLP 기반의 유전적 거리를 이용하여 구축된 neighbour-joining tree는 Fig. 1과 같다.
이배체 액세션들은 두 개의 명확하게 구분되는 그룹을 형성했다.
canephoroid 종(예: C. canephora, C. congensis)에 속하는 액세션들은 함께 그룹화되는 반면,
C. eugenioides 및 C. sp. Moloundou는 두 번째 그룹에 관련된다.
C. arabica의 액세션들로 구성된 세 번째 그룹은 두 개의 이배체 액세션 그룹과 명확하게 분리되었다.
C. arabica에 있는 RFLP alleles (대립유전자들)을 여러 잠재적인 이배체 선조 종들의 액세션들에서 식별된 것들과 비교하였다.
C. arabica에서 검출된 44대의 alleles (대립유전자들) 중에서, 35개 (즉, 80%)가 본 연구에 포함된 이배체 액세션들중 적어도 하나에서 검출되었다.
더욱이, C. arabica에 특유적인 것으로 발견된 9개 alleles 중에서 3개가 C. arabica에서 다형적인(polymorphic) 유전좌들로 발견되었다 (mapped to).
C. arabica에서 검출된 24개의 alleles들이 the canephoroid group의 액세션들 중 하나에서도 관찰되었고, C. arabica에 있는 19개의 alleles가 C. eugenioides 또는 C. sp. Moloundou에서 관찰되었다 (Table 3).
2개의 이배체 액세션 그룹들의 각 그룹 내에서, C. arabica에서 검출된 대부분의 alleles를 보유하는 유전자형들은 C. canephora의 액세션 IF181과 02555이었고 (14개의 대립유전자들), 그리고 C. eugenioides 액세션이었다 (18개 대립유전자들; see Table 2).
분석된 23개의 RFLP-defined loci 중에서 11개의 유전자좌들의 경우에, C. arabica에서 관찰된 각 유전자좌에서의 유전자형들을, the canephoroid group에서 관찰된 대립유전자와 “C. eugenioides” 그룹에서 검출된 대립유전자의 연합(association)으로 얻을 수 있었다 (Table 3).
그 23개의 유전자좌들 중 7개의 경우에, C. arabica에 존재하는 2개의 대립유전자들 중 하나가, 2개의 이배체 액세션들 그룹들 중 하나에서 발견되지 않았다.
나머지 5개의 유전자좌들은, C. arabica에서 단형성(monomorphic)이었고, 그 유전자좌들은, the canephoroid group에서 (대립유전자 2개) 또는 , “C. eugenioides” group에서 검출되었다 (대립유전자 3개).
C. arabica 염색체들의 DAPI 착색(staining) 결과, 뚜렷한 밴드들을 나타내지 않았다 (Fig. 2a).
이전에 보고된 바와 같이(Bouharmont 1959), 염색체는 크기와 형태가 다소 균일해 보여, 염색체 식별이 힘들고 게놈 판별이 불가능했다.
C. canephora의 digoxigenin-labelled total DNA를 하나의 프로브(probe)로 사용하고,
C. eugenioides의 biotin-labelled total DNA를 두 번째 프로브로 사용하여,
C. arabica의 염색체 준비물(chromosome preparations)에 대해 현장 혼성화(In situ hybridisation)를 수행했다.
FITC 또는 Texas Red를 검출하기 위해 특정 필터를 사용하면 모든 염색체들이 황록색과 빨간색으로 표시되어,
두 DNA 프로브와의 강한 서열 상동성(strong sequence homology)을 나타낸다 (Fig. 2b).
그러나 형광 강도의 약간의 차이는 염색체 간에 구별할 수 있었다.
더욱이, 두 게놈 DNA 모두가 동원체 영역(중심절 영역, centromeric regions)에 강하게 혼성화되었으며(hybridised), 염색체 암(the chromosome arms)을 따라 약한 혼성화 (hybridisation)가 관찰되었다.
FITC 필터를 사용한는 염색체 준비물(chromosome preparation)와
Texas Red 필터를 사용하는 염색체 준비물의 이중 노출이 Fig. 2c에 나와 있다.
C. arabica에서는 두 그룹의 염색체가 명확하게 구별된다 (Fig. 2d).
22개의 염색체는 주로 노란색 형광을 나타냈는데, 이는 C. canephora의 게놈 DNA 프로브에 대한 더 높은 친화력을 시사한다.
나머지 22개 염색체는 붉은색-주황색으로 나타났는데, 이는 C. eugenioides의 전체 게놈 DNA로 인한 빨간색 염색이 황록색 형광보다 더 강렬함을 시사한다.
C. arabica의 현장 혼성화 (in situ hybridisation)를 위한 프로브로 동시에 사용된
C. canephora 및 C. eugenioides의 Labelled total genomic DNA를 통해
우리는 각각 22개의 염색체들로 구성된 두 세트를 구별할 수 있었다.
한 세트는 카네포라 게놈 프로브에 대해 더 뚜렷한 친화성(affinity)을 보인 반면,
두 번째 세트는 eugenioides probe와 우선적으로 혼성화되었다.
본 결과는 C. arabica genome이 두 개의 서로 다른 조상 게놈에 속하는 염색체들의 결합(association of chromosomes)에서 발생했음을 명확하게 보여준다. 따라서 GISH는 상당한 성공을 거두었다.
그러나 동원체(centromeres)에서 종말체(telomeres)까지의 라벨링이 불균일하고 아라비카 염색체의 크기가 작기 때문에, 이 기술을 사용하여 주요 게놈간 재배열(major intergenomic rearrangements)이 존재하는지 여부는 판단하기가 어려웠다.
야생 이배체 종의 RFLP 패턴을 C. 아라비카의 RFLP 패턴과 비교함으로써, C. arabica에서 결합된 두 세트의 염색체 또는 게놈의 기원을 특정할 수 있다.
엽록체 DNA(chloroplast DNA)와 핵 리보솜 DNA(nuclear ribosomal DNA)의 변이 패턴(Lashermes et al. 1997a; Cros et al. 1998)으로부터 추론된 계통발생적 관계와 일치하여, 이 분석에 포함된 이배체 Coffea 액세션들은 두 그룹(즉, canephoroid 및 eugenioides-type)으로 나뉘어졌다.
분석된 많은 RFLP 유전자좌들의 경우, C. arabica에서 관찰된 유전자형들은 이 두 그룹의 대립유전자 조합을 통해 얻을 수 있다.
따라서 이러한 데이터는 C. arabica가 이배체 Coffea 종의 두 그룹과 관련된 두 게놈, 즉 Ca 및 Ea의 결합(association)에서 비롯된다는 가설을 뒷받침한다.
조사된 분류군 중에서, C. canephora와 C. eugenioides는 각각 Ca 및 Ea 게놈과 가장 유사한 현존하는 종으로 보인다. 그러나 canephoroid 그룹에 속하는 이배체 종들 사이의 분류학적 경계는 어느 정도 의심스럽다. 왜냐하면 이들 종은 쉽게 교배할 수 있고 번식력이 높은 잡종을 생산하기 때문이다 (Berthaud and Charrier 1988).
광범위한 탐사 임무를 수행한 후 더 많은 샘플을 사용할 수 있게 되면 아마도 개체군 유전학 연구를 기반으로 조상에 대한 추가 명세가 결정될 수 있을 것이다.
현저한 종 내 RFLP 변이(marked within-species RFLP variation)와 종별로 분석된 소수의 액세션들에도 불구하고,
C. arabica에서 식별된 RFLP 대립유전자들의 대부분은 이배체 액세션들에서도 검출되었다.
이 결과는 이 분석에 포함된 이배체 액세션들의 사후 선택 (a posteriori the choice)을 뒷받침한다.
이는 또한 C. arabica의 두 구성 게놈들과 그 조상 종의 게놈 사이에 낮은 분기(low divergence)가 있음을 나타낸다.
유사하게, Cros et al. (1998)은 C. arabica와 C. eugenioides 사이에 엽록체 DNA 서열 차이 (chloroplast DNA sequence divergence)가 없음을 관찰했다.
대조적으로, RFLP 분석과 GISH를 모두 사용하여, C. canephora와 C. eugenioides의 게놈 사이 뿐만 아니라 Ca와 Ea 게놈들 사이에서 실질적인 핵 게놈 분기(substantial nuclear genome divergence)가 관찰되었다.
Coffea 종의 게놈이 약 500만~2500만 년 전에 공통 조상으로부터 분기되기 시작했다고 가정하고 (Lashermes et al. 1996a), 위의 고려 사항을 바탕으로 C. arabica의 종 형성(speciation)은 비교적 최근 시대(즉, 역사적 시대부터 100만년 전까지)에 발생했을 가능성이 높다.
RFLP 분석을 통해 아라비카 액세션들의 경우에 다형성이 매우 낮은 것으로 나타났다.
이 결과는 동질효소 표지(isozyme markers)(Berthou and Trouslot 1977) 및 random amplified polymorphic DNA (Orozco-Castillo et al. 1994; Lashermes et al. 1996b)와 같은 다양한 기술을 사용하여 이전에 얻은 분자 데이터와 일치한다. 따라서 그 농경형태학적 변이는 소수의 자발적인 주요 유전자 돌연변이(few spontaneous major-gene mutations)로 인한 결과인 것으로 여겨진다.
C. arabica에서 검출된 제한된 다양성(limited diversity)은 그 기원, 생식 생물학 및 진화의 결과일 가능성이 높다.
육종과 관련하여, C. arabica에 존재하는 감소된 다양성(reduced diversity)과, 다양한 커피 종들 간의 상호교배(intercrossing) 가능성 (Berthaud and Charrier 1988)은 아라비카 육종에서 이배체 유전자 풀(diploid gene pool)의 사용을 장려한다 (Carvalho 1988).
현재의 결과는 C. arabica의 조상종(progenitor species)과 관련된 종에 대한 노력을 집중할 것을 시사한다.
C. canephora의 활용이 어느 정도 고려되었지만 (Carvalho 1988), C. eugenioides, C. congensis 또는 C. sp. Moloundou와 같은 다른 분류군은 바람직한 유전자의 원천들로 간과되어왔다.
현재의 컬렉션을 위의 종들의 추가적인 액세션들에 의해 확대하면, 중앙아프리카에서 추가 탐사 임무를 정당화할 수 있을 것이다.
또한, 커피 나무들에서의 최근 유전자 표지자(genetic markers) 개발의 발전이 외래 생식질(exotic germplasm) 활용에 대한 새로운 기회를 제공한다 (Lashermes et al. 1997b).
이형접합성 상태 (heterozygous state)에서 관찰된 RFLP 유전자좌의 비율은 이배체 분류군에 따라 다양했다.
지금까지 자가수정이 가능한 것으로 확인된 두 개의 이배체 Coffea 분류군 중 하나인 C. sp. Moloundou(Anthony et al. 1998)는 감소된 수준의 이형접합성(heterozygosity)을 보였다.
절대 이종교배 (Obligate outcrossing)는 분석된 다른 이배체 분류군에서 이형접합 컨디션(heterozygous condition)의 유지의 원인일 가능성이 높다.
C. arabica에서의 상황은 특히 놀랍다.
비록 매우 동형접합적(highly homozygous)이지만, C. arabica는 이질사배체 기원(allotetraploid origin)과 관련하여 상당한 양의 고정된 이형접합성(fixed heterozygosity)을 가지고 있다.
그런 고정된 이형접합성(fixed heterozygosity)은 C. arabica에, 개별 유전자좌에서 가장 높은 이형접합성(highest heterozygosity)을 나타내는 이배체 액세션들에 존재하는 내부 유전적 가변성(internal genetic variability)의 수준을 제공한다.
결과적으로, C. arabica는 그것의 이배체 조상들(diploid progenitors) 보다 잠재적으로 훨씬 더 큰 개체 변동성 (individual variability)을 가지고 있다.
이러한 유전적 변이의 증가(increase in genetic variation)와, 그리고 새롭고 적응 가능한 유전자 조합의 가능한 형성은, 다양한 새로운 배수체 식물(polyploid plants)에 대해서도 보고된 바와 같이, C. arabica의 성공적인 정착에 있어 핵심 요소일 수 있었다 (Grant 1971).
우리의 결과는 C. arabica가 모친(female parent)인 C. eugenioides와 그리고 C. canephora 또는 이들 종들과 관련된 생태형(ecotypes) 사이의 교잡화(hybridisation)에 의해 형성된 복이배체(amphidiploid)라는 것을 분명히 시사한다.
생식력이 있는 하이브리드 타입(fertile hybrid types)을 초래하는 다배체화(배수체화, Polyploidisation)는 이배체 종간 잡종(diploid interspecific hybrid)의 염색체 배가(chromosome doubling) 또는 자생적인 삼배체(spontaneous triploid)의 역교배(backcrossing)를 통해 발생하는 등 다양한 방식으로 발생할 수 있다 (Harlan and deWet 1975).
기원 방식(mode of origin)은 여전히 불분명하지만, 감소되지 않은 배우자(unreduced gametes)가 포함될 가능성이 높다.
그러한 사건(event)은 커피나무에서 쉽게 상상할 수 있다.
특히, C. canephora 및 C. liberica에서 저온 처리(cold treatment)가 단일 핵 미세포자(single-nucleus microspores)의 형성을 포함하여 비정상적인 꽃가루 발달을 유도하는 것으로 보고되었다 (Lanaud and Parvais 1980).
나중에, 진화 과정(evolutionary process)에서 자가 생식 능력(self-fertility)과 정상적인 감수 분열(regular meiosis)을 결합한 형태가 선택되었을 수도 있다.
대부분의 이배체 종(diploid species)에 존재하는 자가-불화합성 시스템(self-incompatibility system)의 붕괴는 종간 커피 하이브리드들(interspecific coffee hybrids)에서 종종 관찰되었다 (Charrier 1978).
염색체 쌍(chromosome pairing)을 조절하는 유전자의 존재가 최근에 확립되었다 (Lashermes et al., submitted).
그러나 4배체 전형(tetraploid arche-type)이 현재의 복이배체(amphidiploid) C.arabica로 진화하는 동안 발생한 게놈 재조직을 밝히기 위해서는 추가 작업이 필요하다.
현재, C. canephora는 서부 및 중앙 아프리카의 열대 저지대 숲(tropical lowland forests)에 널리 분포하고 있으며, 시원하고 건조한 환경에 더 잘 적응하는 C. eugenioides는 능선 지역의 고지대(uplands of the ridge region)에서 발견된다 (Fig. 3).
두 종의 동지역적 출현(Sympatric occurrences)은 중앙아프리카 고원의 서쪽에서 관찰되었으며 (Thomas 1944), 이 곳에서는 종간 교잡화(interspecific hybridisations)가 일어날 수 있었다.
그러나 과거에 추정되는 부모 종(presumed parental species) 사이에 다른 접촉 지역이 발생했다는 사실을 배제할 수는 없는데, 그 이유는 중앙아프리카 열대림의 구성과 범위가 (신생대) 제4기 후기(late Quaternary period)의 환경 변화에 의해 상당한 영향을 받았기 때문이다 (Hamilton 1976; Jolly et al. 1997).
그럼에도 불구하고, C. arabica에서 관찰된 낮은 다형성(low polymorphism)을 고려하면, 다중-장소 종 형성(multi-site speciation)은 배제될 수 있다.
C. arabica의 확산과 성공적인 정착에는 단일 위치(a single location)로부터 유래된 소수의 나무들 만이 관여했을 가능성이 높다.
더욱이, C. arabica는 그 이배체들보다 다소 추운 환경 조건에 더 잘 적응하고, 이배체 커피 종의 분포 지역 외부에 있는 에티오피아 고원에 유전적 다양성의 중심지를 가지고 있다 (Fig. 3).
Hamilton (1976)은 아마도 홍적세의 기후 충격(the climatic shocks of the Pleistocene)에서 살아남은 피난 개체군 (refuge populations)으로부터 발생한 어떤 핵심지역이 홀로세(the Holocene) 동안 숲 확산과 재서식화화의 중심지 역할을 했다고 제시했다.
C. 아라비카의 현재 분포는 다른 커피 종과 다른 보호구역(refuge)에 보존되었음을 의미하거나, Hamilton(1982)이 제안한 대로 소규모 핵심 지역(minor core areas)이 있는 에티오피아 보호구역(refuge)의 독특한 생존 커피 종(unique survival coffee species)을 나타낸다.
- Agwanda C, Lashermes P, Trouslot P, Combes MC, Charrier A (1997)
Identification of RAPD markers for resistance to coffee berry disease, Colletotrichum kahawae, in Arabica coffee. Euphytica 97:241~248 - Anthony F, Louarn J, Bontems S, Groell C, Charrier A (in press)
Classification of new coffee taxa (Coffea sp.) from Central Africa by enzyme markers and morphological traits. Can J Bot - Barre P, Layssac M, D'Hont A, Louarn J, Charrier A, Hamon S, Noirot M (1998)
Relationship between parental chromosomic contribution and nuclear DNA content in the coffee interspecific hybrid: C. pseudozanguebariae × C. liberica var dewevrei. Theor Appl Genet 96:301~305 - Bennett ST, Kenton AY, Bennett MD (1992)
Genomic in situ hybridization reveals the allopolyploid nature of Milium montianum (Gramineae). Chromosoma 101:420~424 - Berthaud J (1976)
Etude cytogénétique d'un haploide de Coffea arabica. Café Cacao Thé 20:91~96 - Berthaud J, Charrier A (1988) Genetic resources of Coffea.
In: Clarke RJ, Macrae R (Eds) Coffee vol 4: agronomy. Elsevier, London, pp 1~42 - Berthou F, Trouslot P (1977)
L'analyse du polymorphisme enzymatique dans le genre Coffea : adaptation d'une méthode d'électrophorése en série. Eighth Conference of ASIC, Abidjan (Ivory Coast), pp 373~383 - Bouharmont J (1959)
Recherche sur les affinités chromosomiques dans le genre Coffea. INEAC Série Sci 77, Brussels - Carvalho A (1952)
Taxonomia de Coffea arabica L. Caracteres morfologicos dos haploides. Bragantia 12:201~212 - Carvalho A (1988)
Principles and practices of coffee plant breeding for productivity and quality factors: Coffea arabica.
In: Clarke RJ, Macrae R (eds) Coffee, vol 4: agronomy. Elsevier, London, pp 129~165 - Charrier A (1978)
La structure génétique des caféiers spontanés de la région malgache (Mascarocoffea).
Mémoires ORSTOM 87, ORSTOM Ed, Paris - Charrier A, Berthaud J (1985) Botanical classification of coffee.
In: Clifford MN, Wilson KC (Eds), Coffee: botany, biochemistry and production of beans and beverage. Croom Helm, London, pp 13~47 - Chinnappa CC (1968)
Interspecific hybrids of Coffea canephora and Coffea arabica. Curr Sci 37:676~677 - Cros J, Combes MC, Trouslot P, Anthony F, Hamon S, Charrier A, Lashermes P (1998)
Phylogenetic analysis of chloroplast DNA variation in Coffea L. Mol Phylog Evol 9:109~117 - D'Hont A, Grivet L, Feldmann P, Rao S, Berding N, Glaszmann JC (1996)
Characterisation of the double genome structure of modern sugarcane cultivars (Saccharum spp.) by molecular cytogenetics. Mol Gen Genet 250:405~413 - Dublin P, Parvais JP (1976)
L'haploidie spontanée liée à la polyembryonie chez le Coffea arabica L. Café Cacao Thé 20:83~89 - Felsenstein J (1985)
Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39:783~791 - Grant V (1971)
Plant speciation. Columbia University Press, New York - Grassias M, Kammacher P (1975)
Observations sur la conjugaison chromosomique de Coffea arabica L. Café Cacao Thé 19:177~190 - Hamilton AC (1976)
The significance of patterns of distribution shown by forest plants and animals in Tropical Africa for the reconstruction of Upper Pleistocene paleoenvironments: a review. Palaeoecol Africa 9:63~97 - Hamilton AC (1982)
Environmental history of East Africa. Academic Press, London - Harlan JR, deWet JMJ (1975)
On Ö. Winge and a prayer: the origins of polyploidy. Bot Rev 41:361~390 - Jolly D, Taylor D, Marchant R, Hamilton A, Bonnefille R, Buchet G, Riollet G (1997)
Vegetation dynamics in central Africa since 18,000 yr BP: pollen records from the interlacustrine highlands of Burundi, Rwanda and western Uganda. J Biogeogr 24:495~512 - Kammacher P (1980)
Sur le comportement méiotique des dihaploides de Coffea arabica L.. Ninth Conference of ASIC, London, pp 717~724 - Kammacher P, Capot J (1972)
Sur les relations caryologiques entre Coffea arabica et C. canephora. Café Cacao Thé 16:289~294 - Kenton A, Parokonny AS, Gleba YY, Bennett MD (1993)
Characterization of the Nicotiana tabacum L. genome by molecular cytogenetics. Mol Gen Genet 240:159~169 - Krug CA, Mendes AJT (1940) Cytological observations in Coffea IV. J Genet 39:189~203
- Lanaud C, Parvais JP (1980)
Observations, avant mise en culture, des divisions anormales des noyaux de grains de pollen de caféier induits au froid. Ninth Conference of ASIC, London, pp 547~554 - Lashermes P, Combes MC, Cros J (1995)
Use of non-radioactive digoxigenin-labelled DNA probes for RFLP analysis in coffee.
In: Berville A, Tressac M (eds) Techniques et utilisations des marqueurs moléculaires. Les Colloques n°72, INRA, Paris, pp 21~25 - Lashermes P, Cros J, Combes MC, Trouslot P, Anthony F, Hamon S, Charrier A (1996a)
Inheritance and restriction fragment length polymorphism of chloroplast DNA in the genus Coffea L. Theor Appl Genet 93:626~632 - Lashermes P, Trouslot P, Anthony F, Combes MC, Charrier A (1996b)
Genetic diversity for RAPD markers between cultivated and wild accessions of Coffea arabica.
Euphytica 87:59~64 - Lashermes P, Combes MC, Trouslot P, Charrier A (1997a)
Phylogenetic relationships of coffee-tree species (Coffea L.) as inferred from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA. Theor Appl Genet 94:947~955 - Lashermes P, Agwanda C, Anthony F, Combes MC, Trouslot P, Charrier A (1997b)
Molecular marked-assisted selection: a powerful approach for coffee improvement.
Seventeenth Conference of ASIC, Nairobi, pp 474~480 - Leitch AR, Schwarzacher T, Jackson D, Leitch IJ (1994)
In situ hybridization: a practical guide. BIOS Scientific, London - Monaco LC, Medina DM (1965)
Hibridaçoes entre Coffea arabica e C. kapakata. Analise citologica de um hibrido triploide.
Bargantia 24:191~201 - Orgaard M, Jacobsen N, Heslop-Harrison JS (1995)
Molecular cytogenetics in the genus Crocus L..
In: Brandham PE, Bennett MD (eds) Kew Chromosome Conference IV,
Royal Botanical Gardens, Kew, pp 291~299 - Orozco-Castillo C, Chalmers KJ, Waugh R, Powell W (1994)
Detection of genetic diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD markers.
Theor Appl Genet 87:934~940 - Paillard M, Lashermes P, Pétiard V (1996)
Construction of a molecular linkage map in coffee. Theor Appl Genet 93:41~47 - Saitou N, Nei M (1987)
The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees.
Mol Biol Evol 4:406~425 - Thomas AS (1944) The wild coffees of Uganda. Emp J Exp Agric 45:1~12
- Van de Peer Y, De Wachter R (1994)
TREECOM for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. CABIOS 10:569~570 - Vishveshwara S (1960)
Occurrence of a haploid in Coffea arabica Kents. Indian Coffee (Chikmagalure) 24:123~124
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