일반적으로 SSRs 또는 미소부수체(microsatellites)로 알려진
단순 반복 염기서열 (Simple sequence repeats)은
진핵생물 게놈(eukaryotic genomes)에서 발견되는
반복적인 DNA 서열(repetitive DNA sequence)의 한 유형이다.
SSR은 [A]n (모노뉴클레오티드 모티프 mononucleotide motif) 또는
[CT]n (디뉴클레오티드 모티프 dinucleotide motif)과 같은
짧은 (1-6 bp) 모티프의 반복으로 구성된다 [1].
식물에서는 게놈 서열(genomic sequence) 50kbp마다 대략 하나의 SSR이 있다 [2].
♣ bp = base pair (DNA 길이를 나타내는 단위)
SSR 서열의 타입
“perfect" SSR ⇒ 하나의 모티프의 반복으로 완전히 구성된 경우
“imperfect" 또는 “compound(복합)" SSR ⇒ 여러 개의 서로 다른 반복 단위 모티프로 구성.
SSR은
⊙ 주로 비암호화 영역(noncoding regions)에서 발견되지만
⊙ 식물 게놈의 유전자 및 유전자간 영역 전체에 널리 퍼져 있다 [3].
SSR은
일반적으로 DNA 복제(replication) 중에 DNA 중합효소(polymerase enzyme)에 의해 발생한 오류를 통해 발생하고 돌연변이 된다. 이에 따라 반복 단위가 SSR 서열에 추가되거나 제거된다 [4]. 그러나 감수분열(meiosis) 중 불규칙인 재조합(illegitimate recombination)도 SSR 확장 및 수축(expansion and contraction)에 역할을 할 수 있다.
이러한 메커니즘은
SSR 서열의 돌연변이율을 세대당 배우자(gamete)당 유전자좌(locus)당 약 10-2-10-3으로 증가시키며 [5],
이는 비반복성 게놈 DNA의 돌연변이율(mutation rate)의 약 106배이다 [6].
따라서 SSR은 매우 다형성이 높으며(highly polymorphic),
이러한 높은 수준의 다형성으로 인해 이러한 서열은 분자 마커 개발을 위한 이상적인 표적이 된다 [7].
그러나 SSR 마커 개발 과정은 상당히 복잡할 수 있다 [8, 9].
SSR 마커 대립유전자(marker alleles)는
일반적으로 반복 횟수(numbers of repeats)의 차이가 있으며,
이러한 대립유전자는 일반적으로 비암호화 영역 및 중립 선택압(neutral selective pressure) 하에서
공동우성(codominant)이다 [2].
SSR 대립유전자(alleles)는 또한,
반복 가능한 결과를 얻기 어려운 RAPD와 같은 일부 다른 마커 유형과 달리,
재현성이 높다 (highly reproducible) [10].
SSR 마커는
상대적으로 사용 비용이 저렴하며,
SSR 마커 프로토콜을 자체적으로 수행하는 것은 대부분의 분자 실험실에서 가능하다.
SSR의 이러한 측면은
지난 20년 동안 SSR을 분자 마커 연구의 "workhorse"로 만드는 데 기여해 왔으며,
많은 식물 종에서 SSR 마커는 앞으로 수년 동안 중요한 역할을 할 것이다.
SSR은
1984년에 식물에서 처음 발견되었으며 [1],
분자 마커로서의 유용성은 불과 5년 후인 1989년에 실현되었다 [5, 11].
그 이후로 SSR은 초기에는 밀[12,13], 쌀[14], 대두[15]와 같은 중요한 작물에서, 그리고 최근에는 오이[16], 해바라기[17], 땅콩[18] 등과 같은 작물에서, 매우 광범위한 작물 종에서 분자 표지로 개발 및 사용되었다.
SSR은
또한 인구 유전학[19] 및 분자 체계학[20]의 진화 연구에 사용되었으며,
이후 게놈 진화[21] 및 게놈 스트레스에 대한 반응[22]에서의 역할에 대해 연구되었다.
SSR은 또한 마커-활용 선발 [23–25] 및 정량적 형질 유전자좌 매핑 [23, 25]에서 유용성을 입증했다.
SSR marker genotyping (SSR 마커 유전자형 분석)의 첫 번째 단계는
SSR 영역의 측면 서열(flanking sequence)에 특이적인 프라이머(primers)를 디자인하는 것아다.
프라이머 ⇒ 시발체
주요 작물 종 및 모델 식물의 경우, 적합한 SSR primers가 이미 퍼블릭 데이터베이스에서 이용 가능하지만,
다른 경우에는 SSR 마커를 처음부터 설계해야 한다.
게놈 서열(genomic sequence)을 구할 수 있는 경우,
소프트웨어 프로그램을 사용하여 SSR을 식별할 수 있으며,
게놈 서열로부터 프라이머를 설계하여 SSR 영역을 증폭할 수 있다.
그러나 많은 종의 경우 게놈 서열이 이용 가능하지 않으며,
이 경우 게놈 서열 라이브러리를 만들어야 하며,
미소부수체(microsatellites)를 포함하는 것으로 추정되는 클론을 서열 분석하고,
프라이머 서열(primer sequences)을 설계하고,
독특한 SSR 유전자좌(unique SSR loci)로부터 해석 가능한 다형성 산물(polymorphic products)을 증폭시키도록
프라이머를 확인해야 한다 [9].
성공적으로 시퀀싱된 클론에서 유용한 SSR 프라이머 생산까지의 평균 감소는 83% 손실로 추정된다 [9].
미소부수체(Microsatellite)가 풍부한 라이브러리는
저렴한 비용(2002년 미화 1,500달러로 추산)으로 한 달 이내에 생산할 수 있으며 [8],
라이브러리로부터 작동하는 프라이머를 개발하는 데 6개월을 할당하는 것은 아마도 대부분의 종에 대해 합리적일 것이다 [9] .
SSR 프라이머를 구득 가능하게 되면,
유전형 분석(genotyping) 목적으로 SSR 영역(region)의 PCR-based amplification(증폭)을 수행할 수 있다.
SSR을 검출하기 위해 혼성화(hybridization)와 같은 다른 방법을 사용할 수 있지만 [1, 5],
차세대 시퀀싱(next-generation sequencing)을 사용하면 실험실 기반 서열 검출의 필요성이 없어질 수 있으며 [26],
PCR 기반 증폭은 지금까지 가장 간단하고 가장 널리 사용되는 SSR 마커 방법이다 [11].
PCR primers는
target SSR sequence의 양쪽에 특이적인 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)이다 (보통 18-25bp 길이):
5'-3’ direction의 시퀀스에 특이적인 하나의 정방향 프라이머 (forward primer)와
3'-5' reverse complement direction (보충 방향)의 시퀀스에 특이적인 하나의 역방향 프라이머 (reverse primer).
DNA 단편(fragment)을 증폭시킨 후, 마지막 단계는
PCR 산물의 크기 다형성(size polymorphism)을 시각화하는 것이다.
이를 수행하는 가장 일반적이고 쉽게 접근할 수 있는 방법은 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)으로,
PCR 산물을 고체 겔의 웰(well)에 로드하고 전류를 흐르게 하는 것이다 (Fig. 1).
작은 조각이 큰 조각보다 더 빠르게 이동하기 때문에, 이 과정은 시간이 지남에 따라 음전하를 띤 DNA 조각들을 분리한다.
■ 아가로스 겔 전기영동(AGE, agarose gel electrophoresis)의 인기 있는 대안으로는,
■ 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis)과
■ 모세관 겔 전기영동(capillary gel electrophoresis)이 있다.
PAGE는
AGE보다 기술적으로 더 어렵지만 조각 크기의 작은 차이를 5% 이하의 차이까지 해결할 수 있다는 장점이 있다 [27].
모세관 겔 전기영동은 일반적으로
DNA 조각들의 형광 라벨링(fluorescent labeling)과
Sanger sequencing machine을 사용한 후속 검출을 포함한다.
이 방법에서는 DNA를 모세관 겔(capillary tube gels)에 넣고 전기영동 후,
형광 표지된 (fluorescently labeled) DNA 단편의 이동을 기록한다 (Fig. 2).
대립유전자 간 단편 크기의 단일 염기쌍 차이(Single base-pair differences)는 이 방법을 사용하여 해결할 수 있다.
SSR 대립유전자 시각화의 이 세 가지 방법은
비용, 생산 용이성, 채점 및 민감도 간의 트레이드-오프 측면에서 상당한 유연성을 제공한다.
SSRs은
다양한 유전자형의 전체 게놈 서열 분석(whole genome sequencing of different genotypes)을 통해
이미 잘 특성 분석되어 있는 종들에서 마커로서 직접 사용될 수도 있다 [26].
그러나 이 방법은 아직 개발 중이며, 차세대 시퀀싱을 사용하여 반복 영역(repetitive regions)을 정확하게 조립하는 것은 어렵다 [28]. 이는 아마도 현재 세대의 시퀀싱 기술에서 마커로서 SSR 영역의 유용성을 제한할 것이다.
미래에는 SSR 영역의 생물정보학-기반 분석이
SSR 마커를 사용하는 실험실-기반 유전형 분석(laboratory-based genotyping using SSR markers)을 대체할 수 있지만,
PCR 기반 SSR 유전형 분석(PCR-based SSR genotyping)의 높은 유용성은 앞으로 수년 내에 많은 종에서 이 방법의 사용을 보장할 것이다.
1. PCR master mix components:
⊙ 20 mM MgCl,
⊙ 2.5 mM dNTP mix,
⊙ 10 μM forward primer,
⊙ 10 μM reverse primer,
⊙ 10× buffer,
⊙ 5 U/μl Taq DNA polymerase.
2. 식물조직으로부터 추출된 정제된 게놈 DNA
3. 열순환기(Thermocycler) 또는 가열된 수조 3개
4. 얼음, 또는 콜드 블록
5. 분자생물학 등급 아가로즈 파우더
6. Gel electrophoresis tank. (겔 전기영동 탱크)
7. 1× TAE solution:
Tris base (트리스 염기),
glacial acetic acid solution (빙초산용액), 그리고
0.5 M EDTA (ethylenediamine tetra-acetic acid) sodium salt solution (소금용액), pH 8.0.
※ 1 l of 50× TAE stock solution 만들 경우:
242 g Tris base,
57.2 ml glacial acetic acid,
100 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0;
※ 1 l with deionized H2O (탈이온수 1리터).
Dilute stock solution 1 part to 49 parts deionized H2O (탈이온수) to make up 1× TAE.
8. 10 mg/ml Ethidium bromide solution (에티듐 브로마이드용액 -- 염색용).
9. 6× Loading buffer:
25 mg xylene cyanol (자이렌 시아놀) and/or
bromophenol blue (브로모페놀 블루) and
4 g sucrose in 10 ml of H2O.
10. DNA ladder.
Primers는
맞춤 올리고뉴클레이티드(custom oligonucleotides)로 상업적으로 구해질 수 있고 ( see Note 2 )
다음 기준들을 충족하도록 구득 가능한 게놈 DNA 시퀀스로부터 디자인되어야 한다.
- Forward primer와 reverse primer는 그 SSR 시퀀스의 측면에 위치해야 한다.
- Primer length 18–25 bp.
- GC content of primer >40 %.
- Annealing temperature of primer >45 °C.
- No strings of repeated mononucleotides >3.
- 반복 영역들 또는 뒤집혔을 때 서로 바인드할 영역들이 없어야 한다.
- 전방향 프라이머와 역방향 프라이머 사이에 보충적 시퀀스가 없어야 한다.
1. 10–50 μl 반응당 PCR 믹스들을 구성하고 (Note 4 참조), 아이스 용기 위의 0.2 ml PCR 튜브에 넣는다 (Note 5 참조).
- 0.125 mM dNTP mix (e.g., 1.6 μl of 2.5 mM solution in a 20 μl reaction).
- 1× DNA polymerase buffer (e.g., 2 μl of 10× DNA polymerase buffer in a 20 μl reaction).
폴리머레이즈 완충액, 중합효소 - 2 mM MgCl (e.g., 2 μl of 20 mM MgCl solution in a 20 μl reaction;
only add MgCl if not present in 10× DNA polymerase buffer). - 0.5 μM forward primer (e.g., 1 μl of 10 μM solution in a 20 μl reaction).
- 0.5 μM reverse primer (e.g., 1 μl of 10 μM solution in a 20 μl reaction).
- 10–75 ng of genomic DNA (e.g., 5 μl of 10 ng/μl DNA solution in a 20 μl reaction).
- 1 U of Taq (DNA polymerase enzyme from Thermus aquaticus ;
e.g., 0.2 μl of 5 U/μl solution in a 20 μl reaction). - 정제된 탈이온수를 적절한 부피로 준비한다 (예, 20 μl reaction에 20 μl 까지).
2. 튜브를 튕겨서 잘 섞는다 (소용돌이 치지 않게 한다).
3. Thermocycler programming (see Note 6)
Heat cycling (see Note7 ):
Initial denaturation, 그 다음에
15–35 cycles of denaturation, melting, and annealing, 그리고
final extension.
※ 500 bp의 산물의 경우 전형적인 온도와 시간:
(a) Initial denaturation: 94 °C for 5 min. 그 다음에 (b) – (d)단계들을 35 사이클
(b) Denaturation: 94 °C for 30 s. (변성)
(c) Melting ( see Note 8 ): 50 °C for 60 s. (溶解, 溶融 )
(d) Annealing: 72 °C for 60 s. (소둔 燒鈍), 그 다음에 확장단계(a single extension step)
(e) Extension: 72 °C for 10 min.
1. 전기영동을 위한 아가로즈 겔을 준비한다.
1g의 분자생물학급의 아가로즈 파우더를 원뿔 플라스크에 넣고 무게를 잰다.
100ml의 1× TAE 완충액을 더한다 (1% 아가로즈 겔을 만든다, Note 10 참조)
그 용액을 끓기 직전까지 가열하고, 모든 파우더가 용해되었는지 체크한다.)
그 플라스크의 외부를 편하게 잡을 수 있을 때까지(~60 °C) 수돗물로 식힌다.
(균일하지 못한 냉각을 방지하도록 플라스크를 돌리거나 소용돌이치게 하면서 식힌다).
그런 다음, 2 μl의 10 mg/ml ethidium bromide 용액을 더한다 (Note 11 참조).
2. 일반적으로 양끝이 좁아지는 단단한 플라스틱 트레이로 된 겔 몰드에 액체 아가로즈를 붓는다.
(겔이 준비된 후 그 겔 트레이의 양쪽 끝이 열려야 하므로 그 겔을 통하여 흐름이 연결되도록 하기 위함)
그 겔 트레이에 앉힌 comb을 더해주어, 샘플들이 겔이 세트된 후에 로드될 수 있는 웰을 만든다.
3. 로딩 완충액을 PCR 산물을 가지고 있는 튜브들 각각에 적절한 농도로 더해주고,
균일한 용액이 되도록 피펫팅을 하여 섞어준다.
4. 겔의 끝에서 테이프를 제거하고 전기영동 탱크에 넣어서, 완충액이 그 겔의 상부를 덮도록 하고,
겔 트레이는 탱크의 모서리에 나란히 위치하고 웰들은 음전극을 향하도록 한다.
5. 각 열에서 첫번째와 마지막 웰에 DNA 래더를 로드한 다음, 나머지 웰들에 순서대로 샘플들을 더해준다.
6. 겔 탱크의 뚜껑을 닫는다. 이때 전극들이 잘 접촉되었는지 확인하고 그 다음 전기 영동을 시작한다.
스탠다드 겔 탱크를 사용하는 경우에는 (Note 13 참조), 전압을 100볼트, 240A로 30~60분으로 설정한 다음,
로딩 완충액이 그 겔에 잘 들어가는지 진행을 추적하기 위해 일정 간격을 두고 체크한다.
7. 로딩 버퍼가 겔 쪽으로 2/2 또는 3/4까지 내려가는 만족스러운 진행이 된 후에,
전기영동을 중지하고, 탱크에서 겔을 꺼낸다.
그 겔을 자외선 투과조명기 캐비닛(ultraviolet (UV) transilluminator cabinet) 또는
자외선 투과조명기 박스에 넣고 시각화한다.
노출된 피부에 UV 화상을 입지 않도록 적정한 보호 장치를 사용하도록 한다.
8. 그 겔의 래더에 대한 상태적 DNA 밴드들의 위치를 사진 촬영하거나 아니면 기록한다.
1. 한 밴드에서 SSR 대립유전자들이 존재하면 1, 없으면 0으로 스코어링한다.
개체당 1개 또는 2개의 대립유전자들이 하나의 유전자좌에서 관찰되어야 한다.
(더 자세한 정보를 위해 또는 이것이 그런 경우가 아니라면 Note 14를 참조하라.)
SSR 대립유전자 카피 수는 아가로즈 겔 전기영동으로부터 신뢰적으로 결정될 수는 없다 (Note 15 참조).
2. 그 개체군에 대해 실행된 모든 SSR 마커들에 관한 스코어링 데이터를 맞춰보고,
게놈 위치별로(예, 엽록체 1, 연결그룹 4) 또는 안다면 다른 관계들에 의해서 소팅한다.
3. 데이터는 무료 또는 상용 소프트웨어 프로그램들 중 하나로 입력되어,
⊙ 연결 맵/개체군 연결 불균형의 결정,
⊙ 개체군 유전적 다양성의 결정,
⊙ 발생계통 관계 트리의 생성,
⊙ 개체군 principal components analysis (PCA)와 같은 분석들을 수행할 수 있을 것이다.
표현형 또는 개체군 구조 데이터의 추가(예, 재배품종들, 계통들)로
⊙ 정량적 형질 유전자좌(quantitative trait loci, QTLs)의 발견,
⊙ 결합 맵핑(association mapping),
⊙ 반수체형과 알려진 표현형들의 매칭(matching of haplotypes to known phenotypes), 그리고
⊙ 상관관계 분석(correlation analyses) 등과 같은 분석들을 할 수 있게 될 것이다 (Note 16 참조).
1. 유용한 SSR 프라이머를 얻는 것은
- 매우 복잡한 프로세스이며,
- 부정확한 세그먼트 증폭, 식별된 SSR에서의 다형성 부족 또는 특정 증폭(특히 배수체 게놈)으로 인해 프라이머가 실패할 수 있다. DNA 라이브러리를 개발하고, 작동하는 SSR primer pairs를 획득하기 위한 후속의 테스트들은 7개월로 추산된다 [9].
2. 프라이머는
- 맞춤형 올리고뉴클레오티드(custom oligonucleotides)로 주문할 수 있으며,
- 이를 상업적으로 제공하는 회사(예: Fisher-Biotech 및 Finnzymes)는 종종 프라이머 2차 구조에 대한 추정치, 용융 온도, 그리고 프라이머 시퀀스를 기반으로 한 프라이머 쌍 간의 호환성 등을 제시하는 웹 페이지를 제공한다. 주문하기 전에 이러한 사항을 확인하는 것이 바람직하다.
- 프라이머는 실온에서 배송될 수 있으며, 맞춤형 농도나 용량으로 주문하거나 건조된 펠렛(pellets)으로 주문할 수 있다.
- 일반적으로 프라이머 가격은 각각 미화 20달러 정도이지만, 비용은 회사, 국가 및 프라이머의 특성(예: 길이, 형광 태그)에 따라 다르다.
3. 비숙련 작업자들, 특히 교육 랩들에서의 PCR 실패는
- 반응제 투여 실패나 잘못된 량의 반응제 투여와 같은 마스터 믹스 조성에서의 실수가 가장 일반적인 원인이다.
- 반응제를 차갑게 유지하고, 모든 성분들 합친 후 잘 섞는 것(튜브를 뒤집는 것보다 튕기는 것이 더 좋지만, 강한 진동으로 섞는 것은 안됨)도 성공에 필수적이다.
- 공급업체로부터 dNTPs, buffer (완충액), Taq DNA polymerase (중합효소) 또는 magnesium chloride (염화마그네슘)의 "불량 배치"를 획득하거나, PCR 반응에서 위양성(false positives)을 주게 하는 오염 물질이 있는 반응제를 획득하는 것도 가능하다.
- 일반적으로 프로세스는 DNA 양에 매우 관대하지만 (많은 경우 1~200ng가 여전히 작동함) 낮은 DNA 품질(오염 물질)로 인한 PCR 실패도 보통 있는 일이다.
4. 최소 권장 PCR 용량은 보통 10μl이며,
- SSR genotyping 목적을 위해서는 50μl가 충분하다.
- 반응량이 적을수록 실패할 가능성이 높으며, 반응량이 20~25μl이면 성공률과 시약 비용 절감 사이에서 적절한 절충안을 제공한다.
5. 몇 개 이상의 샘플에 대해서는 게놈 DNA를 제외한 모든 시약을 포함하는 마스터 믹스를 구성한다.
- 예를 들어, PCR을 위해 24개의 DNA 샘플을 준비하는 경우, 하나의 반응 용량에 필요한 DNA를 제외한
모든 시약의 양에 25 (피펫팅 오류의 경우 +1)를 곱한 다음, - 적절한 양의 마스터 믹스를(예: 5 μl DNA 용액을 함유한 20 μl 반응량에서 15μl)
PCR 튜브의 개별 DNA 샘플들에 더해준다.
6. PCR mix는 주기적으로 가열과 냉각을 반복해야 한다.
- 이는 적절하게 가열된 수조들 사이에서 튜브를 수작업으로 이동함으로써 달성될 수 있지만,
- 정확한 온도로 가열 및 냉각될 수 있는 튜브 고정 블록을 포함하는 상업적으로 생산된 열순환기(thermocyclers)가 더 일반적으로 사용된다.
7. 대부분의 상업적으로 이용 가능한 Taq DNA polymerase (중합효소)에는
- 특정 효소에 최적화된 열 순환기 프로토콜을 제안하는 프로토콜 뿐만 아니라 10× 반응 완충액(reaction buffer), MgCl 용액 및 dNTP 믹스의 튜브들도 함께 제공된다.
- Taq DNA 중합효소 효소 특허는 현재 만료되었으며, 따라서 이 효소는 이제 자체 실험실에서 생산될 수 있다.
- “핫 스타트” 및 “proof reading” 기능을 갖춘 다양한 변형 Taq 효소들도 상업적으로 이용 가능하다.
- Hot start Taq은 열 안정성이 더 높으며 열 순환기 프로토콜의 변성(denaturation) 및 어닐링 단계 (annealing steps)를 위해 더 높은 온도(예: 98°C)에서 돌려져야 한다.
- Proof-reading Taq은 일반 Taq보다 복제 시 시퀀스 오류가 적다.
- SSR 증폭 및 유전자형 분석 절차에는 핫 스타트나 proof-reading Taq이나 필요하지 않지만, proof-reading Taq은 프라이머 디자인 검증 단계에서 분리된 미소부수체 영역의 시퀀싱 중에 다형성을 확인하는 보다 강력한 수단을 제공할 수 있다.
8. 용융 온도(Melting temperature, Tm)는 oligonucleotide primers의 조성에 따라 결정된다.
- GC 함량이 높은 긴 프라이머들은 GC 함량이 낮은 짧은 프라이머들에 비해 용융 온도가 더 높으며, 시퀀스도 Tm 에 영향을 미친다. 온라인 계산기를 사용하면 Taq 및 올리고뉴클레오티드 공급업체를 통해 프라이머 Tm을 예측할 수 있으며, 각 프라이머 쌍에 대해 더 낮은 용융 값을 사용하는 것이 일반적으로 권장된다.
- PCR 동안 용융 온도를 낮추면 프라이머 결합 특이성(primer binding specificity)이 감소하므로, 다루기 어려운 반응 (recalcitrant reactions)에서 생성물을 생성할 가능성이 더 높으며, 또한 여러 개의 특정 생성물(특히 배수체에서)을 생성할 가능성이 높다.
- 용융 온도를 높이면 프라이머 결합 특이성이 높아지지만, 프라이머 Tm에 비해 용융 온도가 너무 높으면 반응이 실패할 수 있다.
- 일반적으로 용융 온도는 48~68°C이며, 프라이머 Tm이 65°C를 초과하는 경우 2단계 PCR이 권장된다.
- Two-step PCR에는 PCR 반응에 용융 및 어닐링 단계가 추가되어, 72°C의 더 긴 단계가 두 개의 짧은 단계를 대체한다.
9. 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)의 대안으로는
폴리아크릴아미드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)과
모세관 전기영동(capillary electrophoresis)이 있다.
- 폴리아크릴아미드 젤은 아가로스 대신 아크릴아미드를 사용하여 만들어지지만 비슷한 원리로 작동한다.
- 모세관 전기영동은 Applied Biosystems 3730x1 sequencer와 같은 시퀀싱 기계를 사용하기 때문에, 인-하우스에서는 거의 수행되지 않는다.
- PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동과 동일한 방식으로 얻어지지만, 상황에 따라 몇 가지 추가 샘플 준비 단계들(예: formamide 추가, PCR 산물 건조 또는 튜브에 DNA ladder 추가 등)이 the fragment analysis service에 따라 때때로 필요하다. PCR 산물의 시각화는 형광 라벨링(via fluorescent labeling)을 통해 수행되며, 이는 증폭 후 또는 형광 라벨이 붙은 프라이머(형광 라벨링에는 한 쌍의 프라이머만 필요함)를 사용하여 수행된다.
- 형광 라벨이 붙은 올리고뉴클레오티드는 맞춤형 특허 염료(FAM, VIC, PET, NED 등) 세트를 보유하고 있는 Applied Biosystems와 같은 공급업체로부터 얻을 수 있다. 예상되는 크기나 형광 염료 색상을 기준으로 서로 다른 프라이머의 대립 유전자를 분리할 수 있는 경우 여러 샘플을 동일한 레인에서 실행할 수 있다.
- 모세관 겔 전기영동으로 PCR 산물(최적 길이 100~500bp)을 분리한 후, 형광 피크의 이미지 파일이 생성된다.
무료 소프트웨어를 사용하여 이 데이터를 분석할 수 있으며, 실행 간 약 0.3bp의 재현성으로 절편 크기를 추정할 수 있도록 내부 표준을 기준으로 대립유전자의 크기를 조정할 수 있다. - "stutter"로 알려진 현상은 종종 0.5~2bp 간격으로 분리된 거짓 추가 대립유전자들을 유발하므로, 서로 가까이 있는 대립유전자들의 점수를 매길 때 주의를 기울여야 한다. 이는 동일한 유전자좌의 각 대립유전자에 대해 동일한 패턴(예: 기본 대립유전자 오른쪽에 있는 하나의 작은 대립유전자, 단일 피크 대신 이중 피크 또는 크기가 감소하는 피크 세트)으로 나타나는 경향이 있으며, 다른 인접한 대립유전자와 함께 항상 관찰된다면 false로 추정될 수 있다.
10. 아가로스 품질과 관련하여,
- 0.8~2.5% (즉, buffer 100ml당 0.8~2.5g의 아가로스)의 SSR 유전형 분석을 위한 겔을 만드는 데, 스탠다드 분자생물학 등급 아가로스를 사용해야 한다.
- 더 높은 품질의 아가로스를 사용하지 않으면 더 높은 농도의 젤은 분해능이 부족하다.
- 1×TAE buffer는 1×TBE buffer (10.8 g Tris base, 5.5 g boric acid(붕산) 및 0.5 M EDTA 0.5 ml, 1 l의 dH2O 중 pH 8.0)으로 대체될 수도 있다.
- 1×TBE는 1×TAE보다 분해능이 더 높으므로 고품질 아가로스(예: Agarose1000)로 만든 고농도(예: 4%) 젤에서 작은 절편들을 구별하는 데 사용할 수 있다.
11. Ethidium bromide (브롬화 에티듐)는
- 자외선 아래에서 형광을 발하는 DNA의 the thiamine residues (티아민 잔기) 사이에 삽입 결합(intercalating bonds)을 형성하기 때문에,
- 분자유전학 실험실에서 젤상의 DNA 시각화를 위해 여전히 일반적으로 사용된다.
- 그러나 에티듐 브로마이드 역시 발암 물질로 알려져 있으며, 원하는 경우 SybrGreen과 같은 상업적으로 생산된 형광 대체 물질로 대체될 수 있다.
- 에티듐 브로마이드를 사용하거나 에티듐 브로마이드 오염 지역에서 작업할 때는 라텍스 장갑이 이 화학물질을 투과할 수 있으므로 니트릴 장갑을 사용하는 것이 좋다.
12. PCR 산물의 저장
- PCR 결과물은 나중에 시각화하기 위해 이 단계에서 저장할 수 있지만,
- 로딩 버퍼(loading buffer)를 추가하기 전에 저장하는 것이 좋다.
- 단기 보관(최대 2주)의 경우 4°C가 적합하고 장기 보관의 경우 -20°C가 바람직하다.
13. 더 빠르고 더 높은 전압에서 작동하는 젤 탱크(gel tanks)도 시중에서 구입할 수 있으며,
미리 만들어진 아가로스 젤(agarose gels)을 처음부터 만드는 대신 구입할 수도 있다.
14. 미소부수체(Microsatellites)는
- 공동우성 분자 마커(codominant molecular markers)로, 생성된 모든 대립유전자를 관찰할 수 있어야 하므로 마커 데이터 분석을 단순화한다.
- 프라이머에 의해 단 하나의 SSR 유전자좌가 증폭되는 경우, 한 개체에 대해 최대 2개의 대립유전자가 관찰되어야 한다.
- 하나의 대립유전자의 관찰은 그 해당 유전자좌의 동형접합성(homozygosity) 또는 크기가 너무 가까워 구별할 수 없는 두 개의 대립유전자를 나타낸다.
- 일부 개체의 경우 대립유전자가 없는 것은 PCR 실패, 프라이머 결합 부위의 다형성 또는 결실 돌연변이 (deletion mutations)로 인해 발생할 수 있다.
- 여러 유전자좌가 단일 프라이머로 증폭되는 경우(3개 이상의 대립유전자가 존재하는 것으로 감지 가능) 대립유전자 스코어링은 더욱 복잡해질 수 있다.
- 다중 유전자좌의 증폭은 배수체에서 흔히 발생하지만 다른 종에서도 발생할 수 있다.
- PCR 반응에서 용융 온도를 높이면 프라이머 특이성이 높아져 2차 유전자좌의 증폭으로 생성된 추가 밴드를 제거할 수 있다.
- 유전적 다양성을 간단히 결정하기 위해서는, 알려진 SSR 유전자좌에 대립유전자를 할당하는 것이 그다지 중요하지 않다.
- 이러한 분석에서는 계통수(phylogenic trees) 생성을 위해 개체 간 유사성 매트릭스(similarity matrix)를 생성하기 위해 밴드 패턴을 사용하고 SSRs의 이차적으로 중요하기 때문이다.
- 마찬가지로, 연계도 (linkage maps) 생성에는 SSR 위치에 대한 사전 지식이 필요하지 않으며, 실제로 SSRs을 연계 그룹(linkage groups)에 할당하는 데 사용될 수 있다.
- 그러나 일배체형 결정(haplotype determination) 및 유전적 이입 분석(analysis of genetic introgressions)과 같은 SSR의 다른 용도에서는, SSR의 위치와 그에 따른 각 유전자좌에 속하는 대립유전자의 정확한 식별이 중요하다.
15. 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 사용하여 PCR 산물을 분리하는 경우,
- 대립유전자 복제 수(allele copy number)는 형광 피크들의 상대적 증폭을 기반으로 결정될 수 있다.
- 복제 수를 적절하게 평가하려면, 상대 피크 증폭(relative peak amplification)이 필요하고, 모든 마커들에 대해 신뢰할 수 없기 때문에, 두 개 이상의 대립 유전자가 동일한 PCR 프라이머들에 의해 증폭되는 경우에만 이 작업을 수행할 수 있다.
- 대립유전자 copy number 분석의 신뢰성을 평가하려면, 동일한 프라이머로 증폭된 다른 모든 대립유전자에 대한 각 대립유전자의 증폭 비율을 계산해야 한다.
- 비율이 정수 배수(예: 1:1, 1:2)로 깔끔하게 떨어지지 않는 경우, 해당 마커를 사용하여 대립유전자 카피 수를 평가해서는 안 되지만, 그렇지 않은 경우 이 기술은 同祖的 非相互 轉座(homoeologous nonreciprocal translocations)와 같은 이벤트를 감지하는 데 어느 정도 유용성을 제공할 수 있다 [29 – 31].
16. 데이터 분석
- SSR 대립유전자들은 정규 분포가 아닌 이항 분포이므로,
- 일반 선형 회귀분석보다는 로지스틱 회귀분석 (Logistic regression)를 SSR 데이터를 사용하여 수행해야 한다.
- 개체군 전반에 걸쳐 증폭 실패율이 높은 대립유전자를 제거하기 위한 데이터 정리(Data cleaning)도 제안된다.
- 이는 후속 분석에 편향을 줄 수 있기 때문이다.
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