본 리뷰는 커피 탄수화물의 화학, 생리학 및 분자적 특성에 대한 최근의 진전을 요약한 것으로, 특히 세포벽 다당류에 초점을 맞춘다. 자세한 화학 연구들의 결과는 커피 생두 및 배전두의 갈락토만난과 아라비노갈락탄 다당류 모두의 새로운 구조적 특징을 보여주었다. 처음으로 특정 다당류 에피토프(抗原決定基)에 대한 단일 클론 항체를 기반으로 하는 면역학적 프로브가 커피콩 세포벽에서 갈락토만난, 아라비노갈락탄 및 펙틴 다당류의 분포 패턴을 밝히는데 사용되었다. 마지막으로, 생리학적 및 분자적 연구 결과가 제시되며, 이는 커피 생두의 대사 상태가 최종 커피 음료 품질에 미칠 수 있는 잠재적 역할에 대한 인식이 높아지고 있음을 강조한다.
1. Introduction
커피 내의 탄수화물(carbohydrates)의 중요성은 콩에서의 높은 농도 뿐만 아니라 커피 음료의 감각적 어필에 공헌하는 로스팅 과정 동안에 겪는 복잡한 변화 때문일 수 있다.
본 리뷰에서는, 우리는 지난 5년간의 커피 탄수화물 문헌에 집중할 것이다. 이 시점 이전의 내용에 대해서는 “Coffee, Recent developments” (Bradbury, 2001)의 탄수화물 볼륨에 훌륭한 요약이 보고되어 있다. 그것은 아라비카와 로부스타의 많은 품종들의 생두와 원두에서의 저분자량 당류(the low molecular weight sugars)에 대한 상세한 보고가 포함되어 있는데, 여기에서는 반복하지 않을 것이다.
최근 수년간 커피 생두 발육의 생리학과 생화학 그리고 그것이 커피 품질에서 수행할 수 있는 역할에 대한 관심이 증대되어 왔다.
여기에는 콩 발육 동안의 커피 에서의 당 대사(sugar metabolism)를 sink-source relationships와 관련하여 이해하고자 하는 연구도 포함된다. 그러나, 지금까지는 커피의 탄수화물 생리(carbohydrate physiology)에 관련하여 발표된 문헌들이 매우 적다.
본 리뷰에서 다뤄질 주요 포커스는 커피 콩 세포벽의 다당류이며, 지난 5년간 그들의 화학, 생화학, 그리고 배유 내에서의 분포를 이해하는데 있어 상당한 발전이 있어 왔다.
2. Carbohydrate status developing grains
Free sugars:
커피 연구의 드라이버는 커피 음료의 플레이버와 아로마의 잠재적 前驅物質들로서 커피라는 곡물의 다양한 構成 成分들을 생각해왔다. 低分子量 糖類(sugars) 또는 多糖類(polysaccharides)에 초점을 두면서, 그런 연구들의 대다수는 Arabica 커피와 Robusta 커피의 잘 익은 곡물들에 초점을 두어왔다. 콩의 성장과 발육, 그리고 콩 프로세싱의 수확후 단계들 동안의 炭水化物 프로파일의 진화에 대한 정보는 부족하다.
이 단계들에서의 green bean의 代射的 狀態는 잘 익은 그린빈의 최종 化學的 組成에 영향을 미칠 것이며, 이 대사적 상태를 조절하는 영향요인들이 커피 콩 品質에 영향을 미치는 요인들이다.
Rogers et al., (1999)의 연구
- Robusta와 Arabica 품종들로부터 얻은 곡물들이
발육하는 동안의 당(sugars)과 당 알코올(sugar alcohols) 함량의 변화에 관한 연구를 진행. - 그 곡물들은 Arabica의 경우 개화 (WAF) 12-30주 후에,
Robusta의 경우에는 18-40 WAF에 수확되었다. - 발육의 초기 단계들에서는, 성숙의 반 단계까지,
⇒ 葡萄糖(glucose)과 果糖(fructose)이 주요 遊離糖이었으며,
⇒ 葡萄糖은 지속적으로 果糖 농도의 2배였다.
⇒ Arabica 품종들에서의 포도당(glucose) 레벨 (between 8-12 % dry weight)이
Robusta의 경우보다 더 높았다 (2-4 % dry weight). - 곡물 발육의 끝 시점에서는
⇒ 두 품종들에서 모두 glucose와 fructose의 농도들이
무수 중량 기준으로 0.03%에서 0.04%까지 각각 감소하였던 반면에,
무수 중량의 5-12%에 달하는 자당(sucrose)이
본질적으로 완숙한 곡물에서의 전체 유리당류(total free sugars)의 100%였다. - 胚乳(endosperm)에서 外胚乳 조직들(perisperm tissues)을 분리해내어
각각에 있는 遊離糖 농도를 분석하는 더욱 세부적인 분석이 Arabica의 한 품종에 대해 이루어졌다. - 발육의 초기 단계들에서의 sucrose에 비해
더 높은 glucose와 fructose의 농도들은 ⇒ 항상 外胚乳 조직들에 연관되었다. - Endosperm에서는 비록 초기 단계들에서라도, sucrose가 지배적인 당이었다.
- 저자들은 外胚乳 내의 蔗糖(sucrose)의 異化作用(catabolism)이
삼투압(osmotic pressure) 증가가 소실 공간(the locular space) 내에서의 초기 확장과
sink function을 가능케하기 위한 조직에 의한 요건과 일치적인지를 조사하였다. - Sugar alcohols (mannitol)과 과당류 oligosaccharides (raffinose, stachyose)에 대한 분석 결과들은
곡물의 발육 동안의 이 화합물들이 代謝(metabolism)에 대한 근본적인 변화들을 가리키는
어떠한 현저한 트렌드도 나타내지 않았다.
Geromel et al., 2004)의 연구
- 커피 콩 발육 동안의 sucrose synthase (자당 신타아제) (Susy EC2.4.1.13)과
invertase (자당효소)의 생화학 및 분자적 특성 분석을 탐구하였다. - 이 연구의 목적은 콩 발육 동안의 sink-source relationships와 관련하여
커피에서의 糖 代謝(sugar metabolism)를 이해하고자 하는 것이었다. - 이를 위해 그들은 콩 발육 단계들에서 Coffea arabica로부터
펄프(pulp), 외배유(perisperm) 그리고 배유(endosperm) 내의
그 2가지 효소들(enzymes)의 당 농도(sugar concentrations)와 활동성(activities)을 측정하였다. - Susy가 Sucrose의 합성(synthesis) 보다는 분해(degradation) 쪽으로 더욱 많이 기능하면서
invertase 보다는 더욱 활동적(active)이었다. - 이는 invertase-encoding genes (인버타아제-인코딩 유전자)의 발현이
테스트된 어떠한 조직들에서도 관찰되지 않았다는 사실에 의해 지지되었다. - Susy activity는 외배유 발달의 마지막 단계들에서 절정이었는데,
이는 그 조직이 콩 사이즈를 콘트롤 하는데 있어서 그리고 그린 콩 내에서의 당의 형성에 있어서
역할을 했다는 것을 제시한다. - molecular level 2에서 cDNAs는 커피 열매에서의 공간적 시간적 발현에서의 차이들을 보여준 Susy isoforms를 인코딩하면서 복제되었다.
Mazzafera and Purcino (2004)의 연구
- 커피 품질에 관계되는 수확후 프로세싱 방법들 동안의 씨앗 대사의 중요성(seed metabolism)이 강조되었다.
- 그들은 커피 콩의 수확후 생리(postharvest physiology of the coffee bean)에 주의를 기울여서,
수확후 프로세싱 방법들의 성격에 의해 영향을 받을 가능성이 있는
탄수화물을 포함한 여러 그룹의 대사물질들에 대한 변화들을 설명하였다. - 정확하게 최종 음료 품질이 수확기의 그 콩의 대사적 상태에 의해 정확하게 어떤 영향을 받는지는
아직 확정된 바가 없지만 이는 커피 연구자들에게서 더욱 많은 주의를 필요로 하는 분야도 남아 있다.
Polysaccharides:
多糖類(polysaccharides)
➡ 커피 생두 무수 중량의 50%까지를 차지한다.
➡ 3가지 주요 유형들로 구성되어 있다 :
⊙ mannans 또는 galactomannans,
⊙ arabinogalactan-proteins (AGPs), 그리고
⊙ cellulose
➡ 추가적으로,
소량의 pectic polysaccharides (Redgwell et al., 2002a)와
최근에는 xyloglucan이 존재하는 것으로 보여진 바 있다 (Oosterveld et al., 2003).
Galactomannans:
- 커피 콩 발육 동안의 유리당류(free sugars)의 생합성(biosynthesis)에 관한 정보가 적지만,
세포 벽 다당류(cell wall polysaccharides)의 생합성에 관해서는 알려진 정보가 더욱 적다. - 그럼에도 불구하고, 분자 테크닉의 등장으로, 이제 커피 세포벽 중합체들의 생합성 방식에 대해 관심이 고조되고 있다.
- 이는 특히 galactomannans과 관련하여 지속적인데,
galactomannans의 가용화(solubilization)가
상업적 추출 동안에 가용성 커피 파우더의 수율을 결정하는 중요한 요인이다 (Clifford, 1985). - 셀룰로오스를 제외하고, 가용화에 대한 가장 저항적인 중합체들이 갈락토만난들(galactomannans)이다.
- 갈락토만난 가용성 (galactomannan solubility)의 주요 결정요인들 가운데 하나가
갈락토스 잔기(galactose residues)를 가진 만난 백본(mannan backbone)의 치환 빈도(frequency of substitution)이다. - 이론상으로는,
그 만난들의 길락토화 정도(degree of galactosylation)의 증가는
갈락토만난들의 가용화 정도(degree of solubilisation)를 증가시킬 수 있을 것이다. - 갈락토만난들(galactomannans)의 최종 구조(final structure)를 조작하기 위해서는,
그들의 합성에 개입되는 대사 단계들(metabolic steps)을 이해하는 것이 필요하다. - 특히, 최종적인 갈락토화 정도를 좌우하는 핵심적 단계들은 어떤 것일까?
- 어떤 식물들에서, 최종적인 갈락토화의 정도는
1차적 합성 산물로부터 갈락토실 잔기들(galactosyl residues)을 쪼개는(cleaves)
an α-galactosidase의 작용(action)에 의해 결정되어지는 것으로 알려져 있다. - 만일 그런 메커니즘이 커피 콩에서 작용한다면,
the α-galactosidase gene의 down regulation은
더 높은 Gal/Man ratio를 가진 커피 콩들을 초래할 것이다. - Fischer et al. (1999)의 연구
이들은 coffee bean cell walls 12, 17 and 29 WAF의 단당류 조성을 조사한 바 있는데,
발육의 초기가 성숙기 보다 galactomannans가 더욱 높게 채워졌다고 보고했다(12, 17, 29). - Redgwell et al. (2003)은 더욱 자세한 연구에서,
커피 콩 beans 11, 15, 21, 26, 31 and 37 WAF의 내배유(endosperm)로부터 갈락토만난을 분리해내어
특징을 분석했다.
발육의 가장 빠른 단계에서,
galactomannans는 polysaccharides의 10%까지 차지하였지만
Gal/Man ratios이 1:2 ~ 1:7 사이로 크게 대체되었다.
성숙기에서는,
galactomannans는 전체 내배유 다당류의 ~50%를 차지하면서 지배적인 다당류가 되었지만
그들의 대체 정도(degree of substitution)은 Gal/Man ratios이 1:17~1:40 사이로 감소되었다.
galactomannans의 Gal/Man ratio 감소는 21 and 26 WAF 사이에서 시작되었으며,
free galactose의 상승과 동시성이 있었다.
최종 Gal/Man ratio은
α-galactosidase에 의한 주요 합성 산물들에서 galactose가 제거되는 결과의 정도까지 였다고 결론 내려졌다.
Other polysaccharides:
- 커피 콩 세포벽의 다른 다당류들에 대해서는 구조적 특징들로의 발달 변화들에 관한 주제에 관해 보고된 바가 많지 않다.
- Redgwell et al., 2003)의 연구
▨ galactomannans로의 발육적 변화들을 보고한 같은 연구에서
여러 발육 단계들에서의 세포벽 물질의 단당류 조성에 관한 데이터를 발표하였다 (Table 1).
▨ arabinose와 galactose가 거의 대부분 arabinogalactans로부터 파생되며
rhamnose와 galacturonic acid가 pectic polysaccharides의 구조적 성분들이라는 합리적인 가정을 하고
곡물 발육 동안의 이 폴리머들의 구조적 특징들에 있어서 약간의 구별가능한 트렌드가 추론될 수 있다.
▨ 성장의 가장 이른 단계들에서 arabinogalactans의 Gal/Ara ratio는 1.3:1 이었지만
이는 점차적으로 곡물 성장 동안에 증가했고,
▨ 성숙기에서는 2.6:1에 도달했다.
▨ 추가적으로, 가장 이른 단계에서 arabinogalactan은 총 다당류의 ~50%를 차지했지만,
이는 성숙한 곡물에서는 34%로 감소했다.
▨ pectic polysaccharides의 경우에,
가장 어린 성장 단계의 내배유는 pectic polymers로서 그 중량의 ~20%를 함유했고
성숙한 곡물에서는 드라마틱하게 떨어졌다 (~4%).
이는 빠른 성장과 세포분화의 기간 동안에 가장 일찍 형성된 층(layer)이
pectic polymers가 풍부한 call plate이기 때문이라고 기대될 수 있다.
- 요약하면
커피 콩 세포벽의 성장과 발달 동안에는, 여러 다른 다당류 타입들의 상대적 함유율과 그들의 구조적 특징들에서 전진적인 변화가 있다. - earliest stages of growth에서는
cellulose와 arabinogalactan이 이전의 지배적 다당류와의 세포벽 합성(cell wall synthesis)의 주요 산물들인 것으로 보인다 (Fischer et al., 1999). - middle stages of growth에서는
cellulose synthesis이 멈추는 것으로 보이며 - 곡물이 성숙에 다가감에 따라
다른 세포벽 다당류에 비해 상대적으로 mannan synthesis의 점진적인 증가가 있다. - cellulose와 mannan의 가까운 입체구성 (close stereochemistry)이
cellulose synthesis로 이끄는 동일한 촉매 막(catalytic membranes)도
GDP-mannose-2-epimerase와 같은 GDP-mannose와 GDP-glucose를 상호 전환시킬 수 있는 효소의
추가적 개입과 함께
내배유(endosperm)의 성장에서 나중에 mannan synthesis에 개입되는 것이 아닌가하는 추측을 자아낸다.
3. Molecular and biochemical characterisation of
polysaccharide modifying enzymes
- 커피 다당류의 생합성과 분해를 담당하는 효소의 기능과 발현이 일단 이해가 되면, 커피 콩의 형태적 특성들의 의도적 조작이 현실적인 제안이 된다.
- 지금까지는 커피 콩의 다당류 대사를 관장하는 내생 효소의 생화학적 또는 분자적 특징 분석에 관하여 발표된 데이터는 적다.
- 목표가 되었던 것들에는 갈락토만난들로의 변화를 매개하는 2가지 효소들이 포함된다.
endo-β-mannanase and
α-galactosidase - 커피의 내생 효소들(endogenous enzymes)을 포함하는 생화학적 연구들, 특히 아라비노갈락탄(arabinogalactans)으로의 대사적 변화들을 촉진하는 효소들에 관한 것들은 보고된 바가 없다.
- Galactomannans는 커피 곡물의 생화학적 특성들에서 지배적인 역할을 하며
산업적 추출가능성(industrial extractability)에 영향을 미치는 주요 요인이다. - Galactomannans의 수정에 관계되는 2가지 주요 효소들은
α-galactosidase와
β−(1→4) endo-mannanase이다. - 두 가지 모두 그것들의 생화학적 특성 및 분자적 특성들에 관하여 매우 잘 정리되어져 왔다.
- Zhu and Goldstein (1994)의 연구
cDNA encoding coffee bean α-galactosidase의 복제와
기능적 발현(cloning and functional expression)에 관해 보고.
그 효소가 α-1,3- and 1,4-glycosidic linkages를 선호한다는 것을 보였다. - 만일 Redgwell et al. (2003)의 결과가 제시한 바와 같이,
α-galactosidase가 커피 배유 갈락토만난의 최종적 갈락토오스 함유율의 결정에 개입한다면,
α-galactosidase gene (알파-갈락토시다아제 유전자)의 하향조절(down regulation)로 유전자 변형된 커피나무는
잠재적으로, 야생 타입보다 더 높은 대체정도(degree of substitution)로 galactomannans을 함유할 수 있을 것이다. - 그 반대 효과는 이미 Joersbo et al. (2001)에 의해 보여진 바 있다.
그들은 덜 익은 세나 씨앗들(immature senna seeds)에서 발현된 α-galactosidase gene를 복제하고
guar (Cyamopsis tetragonoloba)의 종으로 변형했다.
거의 30%의 guar transformants (변형체들)가
galactose 함유율이 유의하게 줄어든 galactomanns를 가진 endosperm을 생산하였다. - 최근까지 커피 알갱이들 내의 endo-β-mannanase activity에 관한 보고는 두 연구들에 한정되었다.
- Dirk et al., (1995)의 연구
▨ 마르고 흡입된 씨앗들(dry and imbibed seeds)에 있는 효소의 다중동질효소(multiple isozymes)를 보고했고 - Giorgini and Comoli (1996)의 연구
▨ 발아(germination) 동안의 그 효소의 활성도(activity)에 대한 성장 조절자들(growth regulators)의 효과를
측정했다. - Marraccini et al. (2001)의 연구
▨ 최초의 분자 특성분석이었는데
▨ 발아하는 커피 곡물들(germinating coffee grains (Coffea arabica L.))로부터
2개의 endo-β-mannanase cDNAs (man A and man B)를 복제하여 서열화하였다.
▨ man A- and man B-specific probes를 가진 북부의 교배들은
두 cDNAs 모두의 mRNA transcripts(전사효소들)이 동일한 콩 발아의 기간들 동안에 있었으며
수분의 흡수(imbibition of water) 20일 후에 발현 절정에 달했다.
▨ Activity(활성도)와 mRNA levels는 밀접하게 조율되는 것으로 나타났으며
▨ Dirk et al. (1995)의 보고와 달리
그들은 효소 활성도(enzyme activity)는 발아 이전에는 곡물 내에 존재하지 않았다고 말했다.
▨ 따라서, 그 효소의 transcripts(전사효소들)은 곡물 성숙 동안에 또는
그 식물의 다른 조직들(뿌리, 잎, 줄기, 꽃)에서 검출되지 않았다.
▨ 그 효소는 mannotriose 또는 mannobiose와의 acitivity를 보이지 않았고
최대 효율성(efficiency)을 위해서는 적어도 5 이상의 units를 가진 oligomers을 필요로 했다. - 커피 곡물 세포벽의 다당류 구조를 바꿀 수 있는 변형기술 사용의 커피 콩 생화학적 특성 조작의 분명한 잠재력에도 불구하고, 그 어푸로치는 단기에서 중기적으로 커피 산업에 어떠한 유의미한 효익을 낳을 것으로 보이지 않는다.
- 이는 주로 유전학적으로 유도된 변화들과, 그 커피 콩의 생화학, 생리학, 품질 특성 간의 관계가 설명되고 있는 것과는 멀기 때문이다.
- 게다가 최초로 과일 전체를 유전학적으로 조작한 FLAV SAVR tomato가 상업적으로 구입가능하게 된 이후로, 농업에서의 바이오테크놀로지 적용은 집중적으로 논의되어져 왔고, 그리고 소비자 여론조사는, 특히 유럽에서는, 일반적인 반대감정병존(ambivalence)과 어느 정도의 적개심 태도를 보여왔다 (Schibeci et al., 1997).
4. Chemistry of the polysaccharides
- 지난 5년 동안 커피 콩 다당류의 화학에 관한 우리 지식의 발전들은
arabinogalactans 및 (galacto)-mannans의 상세한 구조적 특징들을 정교화하는데 주로 집중되었다. - pectic polysaccharides 및 hemicellulosic polysaccharides의 구조적 특징들에 관해서도 추가적인 정보들이 밝혀져왔다.
- 다당류의 어떤 epitopes (抗原決定基)에 구체화된 일정한 범위의 면역학적 조사들(immunological probes)의 이용가능성으로, 커피 콩 세포벽의 구조학에 관한 추가적인 정보를 밝히는 국부화 연구들(localisation studies)이 가능해졌다. 지금까지 커피 셀룰로오스의 특징들에 관해 발표된 연구는 없다.
Arabinogalactans:
몇몇 구조적 연구들이 커피 콩 내의 type II arabinogalactans는 arabinosyl and galactosyl residues의 여러 조합들을 가진 0-6 position에서 구간들에서 치환된, β−(1→3)-linked galactosyl residues의 백본의 가장 큰 부분을 이룬다는 것을 밝혀왔다. (Bradbury, 2001).
Redgwell et al., (2002a)의 연구 ⇒ 두 가지 중요한 구조적 정보들을 보고했다.
[1] 첫째, 그 다당류는 구조의 10%까지 glucuronosyl residues로 존재하기 때문에
음전하(negative charge)을 가지고 있었다는 것이며,
이는 a 1→6 linked galactosyl side chain 상에서 non-reducing terminal units으로 발생했다.
[2] 둘째, 모든 또는 일부의 arabinogalactans이 사실 arabinogalactan-proteins (AGPs)이다.
arabinogalactan moiety와 protein 사이의 공유연결(covalent link)의 존재가
다음과 같은 것들의 전제가 된 것이었다.
⊙ 탄수화물과 단백질의 지속적 연합(continued association),
⊙ β-glucosyl-Yariv reagent에 대한 양성반응,
⊙ hydroxy-proline이 풍부했던 protein moiety의 아미노산 조성,
⊙ 많은 보고된 AGPs의 특징(Clarke et al., 1979)
아라비카 Yellow Caturra에서 분리되어진 3가지 다른 AGP fractions의 단백질 함유율은
0.4%, 1.1%, 1.9%이었다.
AGPs는 아라비카와 로부스타 커피 콩들 모두의 몇 가지 품종들에 존재하는 것으로 보였다.
선행연구들은 커피 arabinogalactans의 특징을 분석했고 그것은 전체 세포벽 폴리머의 한 부분만을 나타냈다. 이는 세포벽 폴리머들과 AGPs가 일반적으로 수용성이 매우 강함에도 불구하고, arabinogalactans이 커피 생두로부터 쉽게 추출할 수 없는 것이라는 사실에 기인할 수 있다.
Bradbury and Halliday (1990)의 연구
커피 생두로부터 arabinogalactan을 추출하기 위해 100°C에서 20 % NaOH (소금물)을 사용했다.
그 결과 불용성 부분으로 45%가 남았다는 것을 보고했다.
Fischer et al. (2001a,b)의 연구
8M KOH and NaClO2를 포함한 일련의 추출용제들(extractants)을 사용했는데 비슷한 결과가 나타났다.
Oosterveld et al., (2003)의 연구
물, EDTA, 그리고 4 M NaOH를 사용했는데, 그 다당류의 10% 미만이 나타났다(추출 됬다).
Bradbury (2001)의 연구
커피 arabinogalactan의 불용성은 그것이 가용성이 적은 세포벽의 성분(예, cellulose 또는 mannan)과
공유적으로 연결되어 있다는 증거였다고 추측했다.
그러나 두 번째 가능성은 대부분 셀롤로오스와 마낸과 같은 불용성 폴리머들로 이루어진 커피 세포벽의 치밀한 구조(compact structure)가 많은 AGP를 그 구조 내에 가두고 있어서(entraps) 효과적으로 불용적이도록 한다는 것이다.
이 아이디어의 증거가 Redgwell et al. (2002a)에 의해 제공되었는데
이들은 cellulase 및 mannanase 효소들의 혼합체로 8 M KOH treatment한 후에
남아있는 불용성 잔여물들을 처치함으로써 생두 내의 거의 모든 AGPs를 녹일 수 있었다.
그 8 M KOH treatment는 mannan/cellulose 폴리머들이 효소에 더욱 민감하도록 만들 필요가 있었고,
아마 이것을 cellulose/mannan fibrils(원섬유들)이 부풀어 올라
더욱 접근하기 쉬운 기질(substrates)로 만들게 함으로써 했을 것이다.
Redgwell et al., (2002a)의 연구
- AGPs가 ⇒ 6-10 % 사이의 glucuronic acid를 함유하고,
⇒ ~650 kDa의 Mw average를 가지는 극도로 이질적인 혼합물로 존재했음을 보고했다. - 그 이질성(heterogeneity)은 특히 그들의 degree of branching와
그들의 측쇄들의 monosaccharide composition에 관계되었다. - Gal/Ara ratios가 현저하게 다른 5개의 다른 AGP fractions가 분리되었다.
- Arabica Caturra, Catimor 그리고 Sarchimor의 경우에는,
Gal/Ara ratios가 각각 0.9~3.1, 1.5~3.2 and 1.2~3.0 사이였다. - Robusta Indes, Conillon 그리고 Ivoire의 경우에는,
Gal/Ara ratios가 각각 0.9~3.1, 1.1~3.0 and 0.9~3.1 사이였다. - Figure 1에
Arabica Yellow Caturra로부터 분리되어진 CWM의 불용성 잔기의 효소 처리만 이루어진
해리된 주요 arabinogalactan fraction의 추정되는 구조적 특징이 나와 있다. - 커피 arabinogalactans의 광범한 이질성은
Robusta가 Arabica에서 발견된 것 보다 더 많은 branch points와 더 연장된 side chains를 가진
고도로 가용적인 arabinogalactan을 함유했다는
앞선 Fischer et al. (2001a,b)의 연구 결과를 지지했고
이것이 Robusta의 arabinogalactans가
Arabica 보다 더 쉽게 용해될 수 있는 이유가 될 수 있다는 것을 입증했다.
Galactomannans :
- galactomannans
galactomannans는 ⇒ polysaccharides의 50%를 차지하는 커피 콩 세포벽의 지배적 성분들이다.
최근 연구는
┌ mannans의 갈락토실화 정도(degree of galactosylation)
├ 다른 치환물들(e.g., acetyl groups)의 분포(distribution of other substituents)
├ 다른 당 잔기들(e.g. arabinose and glucose)이 그 분자의 주요 구조에 존재하는 가능성
└ 그리고 세포벽의 배유(endosperm)에서의 mannans의 위치(location)에 관한 정보를
제공해왔다. Coffee bean mannan의 구성 - 커피 콩 mannan은
⇒ a mannosyl residue의 C-6에서 α-linked 된 single galactose units를 가진
β1→4-mannosyl residues의 대부분을 구성한다. - 문헌은 광범한 치환 정도(degrees of substitution)를 보고하고 있다.
47:1 (Wolfrom and Patin, 1961),
130:1 (Bradbury and Halliday, 1990),
30:1 (Fischer et al., 2001a),
1:7 and 1:40 (Redgwell et al., 2003) and
3:1 and 9:1 (Oosterveld et al., 2004). - 커피 내의 mannan 분자들이
치환된 및 치환되지 않은 폴리머들의 이질적 혼합물을 구성할 수 있지만,
이 혼합물의 정확한 성격에 관한 명확한 데이터는 구할 수 없다.
이것의 한 가지 이유는 커피 mannans에 대한 대부분의 linkage 분석들이 total wall mannan의 플랙션들에 대해서만 이뤄져 왔기 때문인데, 그것은 보통 다양한 형태들의 솔벤트 추출에 의해 용해될 수 있는 것들이다. 변함없이 그들은 불용성 잔기에 남아 있는 덜 치환된 분자들보다 더 쉽게 용해 가능한 more galactosylated galactomannan 플랙션들을 구성한다. - 이는 Redgwell et al., (2003)의 연구에 의해 확인되는데,
거의 모든 mannan이 화학 및 효소적 처치의 조합에 의해 mature grains로부터 용해되었다.
화학적으로 용해된 polymers(8 M KOH)는 7:1의 Man/Gal ratios를 가졌었다.
동시에 용해되었던 arabinogalactan은 결정되어져야 하는
불용성 잔기로부터 파생된 galactomannan fragments의
Man/Gal ratio (40:1)를 허용하면서 투석(dialysis)에 의해 쉽게 제거되었다. - A pure mannan
순수 mannan은 ⇒ 사슬간 수소 결합 때문에 마치 셀룰로오스와 같이 단단한 불용성 구조를 형성할 수 있다.
⇒ galactose 치환의 주 효과들 중 하나는 사슬간 수소 결합을 깨뜨리는 것이고, 이는 가용성 증가로 이끌 수 있다.
⇒ 그러나 galactose는 그런 효과를 유도할 수 있는 유일한 치환물은 아니다.
⇒ 다른 부분들(e.g., acetyl groups)의 존재도 역시 사슬간 수소 결합을 붕괴시킬 수 있고,
분명히 낮은 정도의 galactose 치환을 가진 일부 galactomannans가
비교적 가용적인 이유에 대한 설명일 수 있다. - Oosterveld et al. (2004)
⇒ 이들은 아라비카 생두로부터 추출된 galactomannans가 acetylated 되었음을 보고한 바 있다.
⇒ 이 연구에서 galactomannans는 90°C 물에서 1 h 동안 추출되었다.
⇒ 그 galactomannans는 분자량과 같은 다른 메커니즘들도 그 분리에서 부분 역할을 했을 것임을 제시 한
anion-exchange chromatography에 의해 2개의 neutral fractions으로 분리되었다.
⇒ 평균 분자량 2000 kDa의 한 neutral fraction은
높은 galactosylation (30 %) 및 acetylation (9 % of the mannose groups were acetylated) 정도를
모두 가졌다.
⇒ 두번째 neutral fraction은 평균 분자량이 20 kDa이었고,
galactosylation 및 acetylation 정도가 훨씬 더 낮았다 (각각 11 % and 4 %). - Nunes et al. (2005)
⇒ Oosterveld et al.의 연구 결과들은 Nunes et al. (2005)의 스터디에서 강화되었는데,
이들은 생두의 뜨거운 물로 우린 액의 galactomannans가
11 mole %의 레벨에서 acetylated 된다고 보고했다.
⇒ 그들은 acetyl groups가 그 mannose residue 상의 O-2와 O-3 positions (가끔 둘 다)에
붙어 있다는 증거를 제공했다.
⇒ 계속적으로 acetylated mannosyl residues도 역시 발견되었다.
⇒ interchain hydrogen bonding 붕괴의 또 다른 가능성은
┌ glucose residues로 mannan backbone의 interruption and/or
└ galactose 이외의 sugar residues로 mannan backbone의 substitution일 수도 있다.
⇒ Navarini et al., (1999)는 galactomannans가 arabinose로 치환되었다는 가능성을 보고한 바 있다.
⇒ 이 구조적 특징들은 Oosterveld et al. study (2004)에서 기대되었지만 발견되지 않았다.
⇒ 그러나, Nunes et al. report (2005)는
terminally linked arabinosyl residues (2 mole %)가
mannose residues의 O-6에 붙여졌다는 증거를 제공했다.
⇒ 추가적으로, 그들은
β-(1→4)-linked glucosyl residues (6 mole %)가 main backbone에 존재했다고 했으며,
hot water로 추출된 생두 mannans가
acetylated arabinogalactoglucomannans를 함유했다고 결론 내렸다.
5. Cytochemical and immunolabelling
of cell wall polysaccharides
화학적 분석이 커피 세포벽 폴리머들의 증가하는 복잡한 그림을 밝혀왔다. 이 다른 타입들의 polysaccharides와 그리고 같은 타입의 polysaccharides의 다른 구조적 형태들이 어떻게 세포벽 구조에 공헌하는지는 최근까지 크게 알려진 바 없다. Sutherland et al. (2004)은 커피 생두(Coffea arabica L.Yellow Caturra) 배유의 세포벽 내 arabinogalactan-proteins, galactomannans 그리고 pectic polysaccharides의 공간 배열을 밝히기 위해 일단의 cytochemical and immunological probes를 사용했다.
Arabinogalactan-proteins:
AGPs는 AGP-specific β-glucosyl Yariv 시약과 그리고 glucuronic acid을 함유한 탄수화물 항원결정기(carbohydrate epitope)를 인식하는 단일 클론의 항체(monoclonal antibody) LM2 (Sutherland et al., 2004)로 라벨링함으로써 위치가 파악되었다. Glucuronic acid이 coffee AGPs의 측쇄들 중 일부의 terminal positions을 점유하는 것으로 보인 바 있다 (Redgwell et al., 2002a). 라벨링의 두 형태들 모두가 그 세포벽에 걸친 AGP의 광범한 분포를 보인 바 있다. 그러나, 세포 내강(cell lumen)에 인접한 지역에 더욱 강렬한 Yariv reagent로의 착색(staining)이 있었다. 몇 가지 연속적인 arabinosyl residues에 대해 특유한 단일클론 항체(monoclonal)인 LM6의 라벨링 패턴은 LM2의 경우와 매우 달랐다. LM2는 전체 벽에 걸쳐 표시된 반면에, LM6는 2곳의 특정한 위치들에서 발견되었다 (figure 2). LM6는 세포 벽의 전체 너비에 걸쳐 표피 세포들(epidermal cells)의 강렬한 라벨링을 주었는데, 이는 이 세포들이 배유 세포들에 비해 1,5-α-arabinan이 풍부했다는 것을 가리킨다. 두 번째 위치는 배유 세포들의 세포벽 내강에 인접한 촘촘한 밴드 내에 있었다. 세포벽의 주요 body에서는 아무 라벨이 발견되지 않았다.
이는 다른 구조적 형태의 arabinan polymer가 세포벽 내강에 인접한 지역에 존재함을 가리켰고, 이는 세포벽의 나머지에는 없었다. Yariv reagent가 이 위치에서의 증가된 착색을 보였기 때문에, 하나의 설명은 이 지역의 AGPs가 그들의 측쇄들에 포함된 더 많은 1,5-α-arabinosyl residues를 가지고 있다는 것일 수 있다.
그러나, 모든 항체 데이터는 주의해서 해석되어야 하는데, 항체 LM6가 완전히 무관한 분자들 (e.g. rhamnogalacturonans and AGPs)에 대한 비슷한 항원결정기(epitopes)와 반응하고 있을 가능성이 있기 때문이다. 한 가지 다른 설명은, LM6가 1,5-α-arabinosyl residues의 측쇄들을 carried한 rhamnogalacturonan type molecule을 라벨링라고 있었다는 것이다.
보통 량의 1,5-α-arabinosyl residues를 함유하는 커피 빈 세포벽들 내의 rhamnogalacturonans의 존재가 보여진 바 있었다 (Redgwell et al., 2002a). 어떤 pectic polysaccharides의 구조적 특징들이라는 arabinosyl residues에 대한 주장이, LM6가 gum acacia 내에 있는 AGP와 교체 반응(cross react)하지 않는다는 사실에 의해 서포트된다.
한편 커피 빈에 대한 화학적 분석이 그들의 1,5-arabinosyl residue 함량에 있어 다분산적(polydisperse)인 AGPs의 혼합물의 존재를 가리킨다. 추가적으로 커피로부터의 pure 1,5 arabinan과 a pectin-depleted AGP fraction의 유사한 농축에 의한 LM6 라벨링의 억제가 coffee AGPs가 LM6와 교차 반응한다는 것을 서포트 했다.
Mannans:
Mannans가 β-1,4-mannan-specific monoclonal antibody BGM C6로 라벨되었을 때, 그 항체는 전체 세포에 걸쳐 라벨 되었다.
- 그러나, 그 세포의 내강(lumen)과 중엽(middle lamella)에 인접한 곳에서는 더욱 강렬한 착색으로, 그 벽 전체에 걸쳐 라벨링 강도에 차이가 있었다.
- 이 두 구역은 중간 정도의 염색 강도만 나타나는 영역으로 구분되었다 (Sutherland et al., 2004).
- 갈락토실化(galactosylation) 정도가 다른 galactomannans가 세포벽의 다른 부위에 위치한다는 증거는, terminal α-galactose에 특이적인 BS-1 lectin을 사용하여 제공되었다 (Hayes and Goldstein, 1974).
- BGM C6 단일클론 항체(monoclonal antibody)와 달리, 렉틴은 세포벽을 균일하게 표지하지 않았다.
- 렉틴은 표피 세포(epidermal cells)의 단일 층과 배유 세포(endosperm cells)의 내부 구역에서 세포벽 內腔에 인접한 콤팩트한 띠에 농축되어 있는 것으로 보였다.
- 렉틴은 BGM C6처럼 벽 전체에 걸쳐 표지 되지 않았다.
- 모든 α-galactose가 galactomannans와 연관되어 있고 염색 강도가 mannan backbone의 갈락토스 치환 빈도와 관 련이 있다고 가정하면, 이 결과는 치환 정도가 다른 galactomannan의 구조적 형태가 벽에서 차별적으로 위치한다는 것을 시사한다.
Pectic polysaccharides :
펙틴성 다당류(pectic polysaccharides)의 위치는 호모갈락투로난 타입 펙틴성 다당류 (homogalacturonan type pectic polysaccharides)에 특이적인 단일 클론 항체(monoclonal antibodies) JIM 5 및 JIM 7을 사용하여 결정했다. 단일 클론 항체 JIM 7은 배유의 중간 라멜라(lamella, 서로 접하는 세포를 접착시키고 있는 층, 펙틴산염(酸)이 주성분) 영역만 표시했다. JIM 5는 그 벽 내부의 어떤 부위에도 결합하지 않았다. 에스테르化(esterification) 정도의 차이는 15~80% 범위에서 JIM 7 결합에 큰 영향을 미치지 않는 반면, JIM 5 결합은 최대 40%까지 에스테르화 수준에 따라 현저하게 증가한다 (Willats et al., 2000).
6. Roast coffee
로스팅 과정은 플레이버 발달과 솔루블 커피 생산을 위한 커피콩의 후속 추출가능성(extractability) 모두에서 중심적으로 중요하다. 이 두 영역이 커피 산업에 미치는 관련성은 로스팅과 로스팅 과정에 수반되는 커피콩의 당(sugars)과 세포벽 다당류(cell wall polysaccharides)의 변화 사이의 관계를 이해하기 위한 지속적인 연구를 장려했다 (Clarke and Vitzthum, 2001).
저분자량 당(low molecular weight sugars)은 거의 완전히 분해되고 로스팅 후 콩에 최소한의 양이 남아 있다는 것은 잘 알려져 있다. 반면에 세포벽 다당류의 구조적 특징은 어떤 경우에는 변형되지만, 다른 경우에는 대체로 그대로 유지되나 상당한 양의 분해가 발생한다 (Clarke and Vitzthum, 2001). 지난 5년 동안의 연구는 로스팅으로 인한 다당류 변화의 특성과 다양한 로스팅 시간에 따른 분해 정도에 대한 자세한 정보를 제공하는데 중점을 두었다. 이러한 연구는 두 가지 범주로 나눌 수 있다. 볶은 콩의 水溶性 抽出物(water soluble extracts)에서 다당류 프로필을 살펴보는 것과, 로스팅이 커피 세포벽의 total polysaccharide 함량에 미치는 영향을 특성화하려는 것. 추가적으로 로스팅으로 인해 세포벽 구조와 그 안의 다당류 분포가 변화하는 것을 미시적 방법(microscopic methods)과 면역 표지법(immunolabelling)을 통해 세포 수준에서 연구했다.
Nunes and Coimbra (2001, 2002a,b)의 연구
Nunes와 Coimbra (2001, 2002a,b)는 그린 커피와 볶은 커피에서 뜨거운 물 침출액(hot water infusions)으로 추출한 고분자량 물질의 화학적 특성을 설명하는 일련의 보고서를 작성했다. 그들은 galactomannans의 중합도 (degree of polymerisation)와 분지화 정도(degree of branching)가 배전도 증가에 따라 감소한다고 보고했다. arabinogalactans의 말단 연결된 아라비노실 잔류물(terminally linked arabinosyl residues)의 양은 로스팅 중에 감소했고, 중합체 (polymers)의 평균 분자량도 감소했다.
Redgwell et al. (2002b) and Oosterveld et al. (2003)
Redgwell et al. (2002b)과 Oosterveld et al. (2003)은 로스팅 중 아라비카 커피 콩들의 총 세포벽 다당류(total cell wall polysaccharide) 함량의 변화에 대한 연구를 보고했다. Redgwell et al. (2002b)은 다당류의 최대 40%가 장시간 로스팅 후 분해되었다고 보고했으며, 이러한 결과는 Oosterveld et al. (2003)에 의해 확인되었다. 후자는 연결 데이터를 기반으로 로스팅 중 galactomannans의 분자량이 감소했다고 보고했다. 동시에 그들은 로스팅된 커피의 추출물이 생두 추출물보다 더 큰 분자 크기의 galactomannans를 함유하고 있다고 언급했다. 이는 로스팅 과정에서 분자량이 더 큰 galactomannans의 용해가 가능했기 때문일 수 있다. 이 아이디어는 8M KOH로 생두와 배전두에서 추출한 galactomannans의 분자량에 변화가 없다고 보고한 Redgwell et al. (2002b)의 연구 결과를 뒷받침할 것이다.
커피 아라비노갈락탄(arabinogalactans)은 로스팅 동안 폴리사카라이드 중에서 분해되기 쉬운 것으로 알려져 있으며, 특히 열에 더 불안정한 아라비노푸라노실 잔류물(arabinofuranosyl residues)의 경우 그렇다. 그 중합체들은 라이트 로스트 후 분자량이 급격히 감소하는 것을 보여주는 탈중합되어 분자량이 최소 10배 감소했다 (Redgwell et al., 2002b). 더 긴 로스팅 시간이 중합체를 계속 분해했지만, 추가 구조적 변형의 정도는 그 첫 로스트 후에 비해 적당했다 (Redgwell et al. 2002b). 분자량 감소의 규모는 측쇄(side chains)로부터 아라비노실 잔류물(arabinosyl residues)이 손실되어 예측할 수 있는 것보다 더 컸으므로 갈락탄 백본(galactan backbone)의 분열(fission)로 인해 발생했을 것이다. Ooosterveld et al. (2003)은 아라비노스 측쇄(arabinose side chains)의 탈분기(debranching)가 갈락탄 백본(galactan backbone)의 가수분해(hydrolysis)보다 더 빨리 발생한다고 보고했다.
AGP의 탄수화물-단백질 연결은 어느 정도 온전한 것으로 나타났다. 다크 로스트 후에도 로스트된 원두에서 정제된 AGP는 여전히 Yariv 테스트에서 명확한 양성 결과를 보였다 (Redgwell et al., 2002b).
로스팅 중 AGP의 운명은 연속된 5-linked arabinosyl residues에 특이적인 단일 클론 항체 LM6을 사용하여 면역 표지를 통해 추적되었다. 아라비카와 로부스타 콩들은 모두 가장 라이트한 로스팅 후에도 LM6에 대한 표지 감소 패턴을 보였다. 미디엄 로스트에서는 표피층만 표지되었다. 라이트 로스트에서는 1,5- arabinan에 대한 표지가 세포벽의 내부 영역과 점액 세포(mucilage cells) 근처에서 먼저 감소한 것이 분명했다 (Redgwell et al., 2004). 로스팅 중에 벽의 내부 세포에서 1,5-arabinan이 더 빨리 분해되는 이유는 콩 표면이 훨씬 더 빨리 온도가 상승하는데도 불구하고 명확하지 않다. 한 가지 가능성은 내부 구조에 더 많은 갇힌 자유수가 있어 가열하면 아라비난 측쇄를 가수분해하는데 더 효과적인 작용제가 된다는 것이다.
의심할 여지 없이 세포벽 다당류의 분해는 커피 다당류의 용해도 증가에 중요한 역할을 한다. 이 분해는 두 가지 형태로 나타난다. 다당류 백본의 가수분해로 분자량이 상당히 감소하고 측쇄 당이 제거되어 중합체가 선형화된다. 결과적으로 AGP, galactomannans 및 mannan/cellulose matrix 간의 얽힘 정도(degree of entanglement)가 크게 나타나지 않아, 수성 추출(aqueous extraction)로 더 쉽게 용해할 수 있다. 그러나 로스팅 조건도 다세포 수준에서 콩의 구조적 특성에 큰 영향을 미친다.
Schenker et al. (2000)은 체적 측정(volumetry), 수은 기공 측정법(mercury porosimetry) 및 전자 현미경 (electron microscopy)을 사용하여 구조적 산물 특성을 연구했다. 로스팅 후 콩은 생두 또는 저온 로스팅 커피에 비해 콩 부피가 더 크고 세포벽에 더 큰 미세 기공이 나타났다. 따라서 세포벽 중합체가 추출제(extractant)에 더 쉽게 접근할 수 있어 다당류의 용해도가 더 높아진다.
7. Conclusion
- 지난 5년 동안 커피콩 세포벽의 복잡한 화학을 이해하는데 꾸준한 진전이 있었다.
- 아라비노갈락탄(arabinogalactans)이 AGPs이고,
갈락토만난(galactomannans)이 어떤 경우에는 갈락토스(galactose)와 만노스(mannose) 이외의 당 잔류물(sugar residues)을 포함할 수 있다는 발견은
커피 탄수화물의 구조적 특징을 정의하려는 지속적인 노력에서 중요한 진전이다. - 그러나 이 작업의 대부분은 분리된 다당류에 대해서만 집중되었다.
- 로스팅 과정에서 발생하는 커피콩의 탄수화물 부분(carbohydrate fraction)과 다른 분자(단백질, 멜라노이딘) 간의 복잡한 상호작용과 이러한 상호작용이 콩의 플레이버 발달과 추출가능성(extractability)에서 어떤 역할을 하는지 밝히기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.
- 생리학적 측면에서는 수확 직전과 수확 후 단계에서 커피 탄수화물의 대사에 대한 지식이 극적으로 부족하다. 이러한 발달 단계에서 콩의 탄수화물 상태는 최종 커피 음료 품질에 중요한 역할을 할 수 있다. 로스팅 단계 이전에 커피콩은 살아 있고 역동적인 구조이다. 생두의 탄수화물 상태가 커피 품질에 영향을 미치는 요인이라면, 수확 후 처치가 이 상태를 조절하는 정도는 추가 연구가 필요한 중요한 영역이 된다.
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