커피의 쓴맛을 억제하는 화합물들

 

 

■ Abstract
1. Introduction
2. Materials and methods
	2.1 Chemicals
	2.2 Coffee samples
	2.3 Coffee bitter intensity evaluation
	2.4 Color measurement of coffee grounds
	2.5 Ultra-performance        liquid chromatography–mass spectrometry (UPLC–MS) chemical profiling
	2.6 Multivariate statistical analysis (MVA)
	2.7 Multidimension preparative liquid chromatography        –mass spectrometry (LC/MS) fractionation
	2.8 Quantification by ultra-performance        liquid chromatography–tandem mass spectrometry (UPLC–MS/MS)
	2.9 Sensory recombination model
	2.10 Sensory analysis of individual compounds
	2.11 Nuclear magnetic resonance
3. Results
	3.1 Sensory evaluation of the bitter intensity of coffee brew
	3.2 Multivariate statistical modeling
	3.3 Isolation and purification of negative markers
	3.4 Identification of negatively correlated markers
	3.5 Quantification of negative markers in coffee brew
	3.6 Sensory recombination testing of negative markers on coffee bitterness
4. Conclusions
■ Appendix A Supplementary data
■ References

 

 Abstract

• 커피 추출액(브루, coffee brew)의 쓴맛 지각(bitterness perception)을 억제하는 화합물을 식별하기 위해
  비표적 LC-MS 향미체 프로파일링(Untargeted LC–MS flavoromic profiling)이 활용되었다.
• 14가지 브루 샘플의 화학적 프로파일과, 기술적 센서리 분석에 의해 결정된 그에 상응하는 쓴맛 지각 강도가
  직교 부분 최소자승법(orthogonal partial least squares, OPLS)을 통해 모델링되었으며,
  OPLS는 적합도(R²Y > 0.9)와 예측력(Q² > 0.9)이 우수했다. 
• 예측력이 높고 쓴맛 강도와 陰의 상관관계를 보이는 10가지 화학 마커들을
  다차원 분취 (multi-dimensional preparative) LC-MS로 정제하여,
  센서리 재조합 시험(sensory recombination testing)을 수행하고/하거나
  NMR을 통해 화합물 정체를 확인했다.
• 평가된 10가지 화합물 중
  4-caffeoylquinic acid,
  5-caffeoylquinic acid,
  2-O-β-d-glucopyranosyl-atractyligenin,
  이 세 가지 화합물이 커피에서 쓴맛 조절제(bitter modulators)로 확인되었으며,
  추출액의 지각된 쓴맛 강도를 유의미하게 감소시켰다.
  
  

 

 

 1. Introduction

 

• 커피는 전 세계적으로 가장 인기 있는 음료 중 하나이다.
• 미국의 커피 시장은 151억 달러 규모로 지속적으로 성장하고 있으며, 2024년에는 185억 달러에 이를 것으로 예상된다 (Mintel, 2019).
• 커피의 특징적인 플레이버인 쓴맛(bitterness)은 일반적으로 음식 섭취에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 
• 하지만 커피나 초콜릿과 같은 특정 제품에서는 적절한 수준에서도 쓴맛을 느낄 수 있다 (Harwood et al., 2012).
• 커피 소비 습관은 쓴맛에 대한 선호도와 커피 제품 선호도에 직접적인 영향을 미치는 것으로 보고되었다.
• "순수 커피 애호가"라고 밝힌 사람들은 "커피 블렌드 음용자"나 "일반 커피 음용자"보다 커피 제품에서 더 많은 쓴맛을 선호하는 것으로 나타났다 (Geel et al., 2005).
• 또한, 6-n-propylthiouracil (프로필티오우라실)(PROP) 테이스터 상태와 소비자의 菌狀乳頭 密度(fungiform papillae density)가 커피의 쓴맛 지각에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 菌狀乳頭 密度는 커피 선호도에도 영향을 미치는 것으로 보고되었다 (Masi et al., 2015).
• 커피 소비 습관과 소비자의 유전적 차이가 커피의 쓴맛 지각에 중요한 역할을 하므로, 커피 제조업체는 다양한 소비자 선호도를 충족하기 위해 다양한 쓴맛 강도의 커피 제품을 제공해야 한다. 
• 커피 쓴맛의 분자적 기초를 더 잘 이해하고 다양한 소비자 선호도에 맞게 쓴맛을 조절하는 커피 가공 전략을 개발하는 것은 시장에 새로운 기회를 가져올 것이다.
  
  
• 커피 플레이버는 수십 년 동안 연구되어 왔지만, 커피의 복잡한 감각적 특성을 이해하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다. 
• 쓴맛 속성은 광범위하게 연구되었으며, 커피 원두에 존재하는 잘 알려진 쓴맛 성분인 카페인은 커피 쓴맛의 최대 30%를 차지하는 것으로 보고되었다 (Chen 1979). 
• 또한, 쓴맛 성분으로 알려진 다섯 가지 proline-based 2,5-diketopiperazines의 존재가 로스팅된 커피에서 확인되었다 (Ginz & Engelhardt, 2000). 
• 최근에는 커피에서
  센서리-유도 분획법(sensory-guided fractionation)이라는 표적 접근법(the targeted approach)을
  사용하여 쓴맛을 내는 疏水性 化合物 그룹이 분리되어
  caffeoyl quinides와 feruloyl quinides로 식별되었고,
  물에서 이들의 쓴맛 식역치가 측정되었다 (Frank et al., 2006). 
• 동일한 방법론이 활용되어, 커피 제품에서
  4-vinylcatechol oligomers (Frank et al., 2007),
  methylated benzenes (Kreppenhofer et al., 2011),
  mozambioside (Lang et al., 2015)를 포함한 쓴맛 화합물이 식별되었다. 
• 개별 쓴맛 활성 화합물들의 식별에도 불구하고,
  이러한 화합물의 관능적 관련성과
  커피의 전반적인 쓴맛에 대한 기여도는 맛 식역치(taste threshold value)를 기반으로 보고되었다. 
• 문헌에서 널리 사용되는 기존의 맛-유도 분획(taste-guided fractionation) 방법은
  자체적으로는 맛-활성적이지는 않은 플레이버 조절물질(flavor modulators)과 같은
  주요 화합물의 맥락적 상호작용을 간과할 수 있다. 
• 따라서 맥락적 상호작용(contextual interactions)을 고려하는
  새로운 연구 접근법은 향미 또는 쓴맛 지각에 기여하는 화합물을 정의하는데 더 많은 기회를 제공할 수 있을 것이다.
  
  
• 플레이버로믹스(Flavoromics)는
  다변량 통계 분석(multivariate statistical analysis)을 적용하여,
  시료의 화학적 프로파일과 관심 속성의 센서리 강도 간의 상관관계를 조사하는
  비표적 화학 프로파일링 접근법(an untargeted chemical profiling approach)이다
  (Ronningen et al., 2018, Sittipod et al., 2019, Sittipod et al., 2020). 
• 최근 연구에서는 플레이버로믹스 분석을 성공적으로 적용하여
  감귤류의 오렌지 및 과일 플레이버 (Ronningen et al., 2018)와
  커피 품질(Sittipod et al., 2019, Sittipod et al., 2020)을 크게 변화시키는 화합물을 발견한 바 있다. 
• 플레이버로믹스를 통해
  새로운 이오논 글리코사이드(ionone glycoside)가 감귤류의 오렌지, 꽃, 그리고 녹두 속성의 강도를 조절하는 것으로 밝혀졌다 (Ronningen et al., 2018). 
• 마찬가지로, 로스팅된 커피의 화학적 프로파일을 커피 커핑 점수에 맞춰 모델링함으로써,
  비표적 접근법을 통해
  커피의 플레이버 품질을 향상시키고 진정한 플레이버 조절제로 기능하는
  새로운 클로로겐산 화합물을 발견할 수 있었다 (Sittipod et al., 2019).
  
  
• 본 연구의 목적은
  ■ untargeted flavoromics analysis (비표적 향미체학 분석)을 적용하여
  ■ 커피의 쓴맛을 억제하는 플레이버 조절물질(flavor modulators)을  식별하는 것이었다. 
  ■ 커피(액)의 Untargeted UPLC-QToF-MS 화학적 프로파일링이 쓴맛 강도 평점들에 대해 모델링되었다.
  ■ 예측성이 높은 화합물들을 선별하여 정제하고,
  ■ 센서리 재조합 시험(sensory recombination testing)을 통해 활성(activity)을 확인했다.

 

 2. Materials and Methods

 

2.1 Chemicals

 

• 나노퓨어 여과수는 Barnstead nanodiamond system (Thermo Fisher, Waltham, MA)을 사용하여 정제했다.
• 식품 등급 sodium phosphate monobasic (NaH2PO4), sodium phosphate dibasic (Na2HPO4), hydrochloric acid (염산), 최적 등급 formic acid (포름산), acetonitrile (아세토니트릴), acetone (아세톤), methanol (메탄올)은 Fisher Scientific (Waltham, MA)에서 구입했다.
• 4-caffeoylquinic acid (4-CQA), 5-caffeoylquinic acid (5-CQA), 4,5-dicaffeoylquinic acid (4,5-diCQA)은 BOC Sciences (Shirley, NY)에서 구입했다.
• 카페인, methyl parabens (메틸파라벤), 구연산(citric acid), deuterated methanol‑d4는 Millipore Sigma(Burlington, MA)에서 구입했다.

 

2.2 Coffee samples

 

• 7개 제조업체의 로스팅된 커피 원두(n = 14) 중, 7가지는 미디엄 로스트, 7가지는 다크 로스트이며, 
  지역 식료품점(콜럼버스, 오하이오)에서 구입했다.
• 커피 추출은 분쇄 커피 10g과 물 200mL의 비율로 마련되었으며,
  드립 커피 메이커 (Moccamaster KBT741; Technivorm, Amerongen, 네덜란드)를 사용하여 추출했다.
• 각 커피 샘플은 생물학적 반복 실험을 위해 두 번 추출했다.
• ultra-performance liquid chromatography–mass spectrometry (UPLC-MS) 분석을 위해
  각 커피 추출 샘플(n = 14) 10mL를 혼합하여 QC (quality control) 샘플을 준비했다.

 

2.3 Coffee bitter intensity evaluation

 

• 8명의 훈련된 패널리스트가 World Coffee Research (World Coffee Research Sensory Lexicon, Version 2.0, 2017)에서 발표한 0~15점 척도를 사용하여 커피의 쓴맛 강도를 평가했다.
• 카페인은 0.01%~0.08%(w/v) 농도의 나노퓨어 워터에 용해되어 각각 2.0~9.5의 쓴맛 강도를 나타내는 기준으로 사용되었다.
• 커피 추출 샘플에는 3자리 무작위 코드를 표시하고, 일관된 온도 조절을 위해 평가 전 실온으로 식혔다.
• 카페인의 쓴맛 지각은 21~30℃에서 가장 높은 것으로 보고된 바 있다 (Green and Andrew, 2017).
• 패널리스트들은 후각 반응과의 상호 작용을 방지하기 위해 쓴맛 평가 중 코 클립을 사용했다.
• 패널리스트들은 샘플 채취 사이에 최소 90초 동안 기다렸고, 무염 크래커와 물을 사용하여 입안을 헹구도록 요청 받았다.
• 모든 평가는 Compusense Cloud 소프트웨어(Compusense Inc., Guelph, ON, Canada)를 사용하여 두 번 실시되었다.

 

2.4 Color measurement of coffee grounds

 

• 14개의 분쇄 커피들에 대한 분석은
  Hunter Colorquest XE automatic colorimeter (자동색도계) (Hunterlab, Reston, VA)를 사용하여 이뤄졌다. 
• Color parameters가 색상 전체 범위를 측정하는데 사용되었다.
  ⇒ the brightness L* (from 0 = black to 100 = white),
  ⇒ a* (from –50 = green to 50 = red), b* (from –50 = blue to 50 = yellow), and
  ⇒ dE value는 [(dL*)2 + (da*)2  + (db*)2]의 제곱근과 같다.  

 

2.5 Ultra-performance liquid chromatography–mass spectrometry (UPLC–MS) 
      chemical profiling

 

• Coffee brew (600 μL)가 나노퓨어 워터(400 μL)로 희석되어 
  Oasis HLB 96 well plate (10 mg bed, Waters Corp.)에 적재되었다.
• 다음으로 5% 메탄올:물(v/v) 500 μL를 사용하여 카트리지에서 염과 고극성 화합물을 세척(폐기)했다. 
• 별도의 수집 플레이트에서 95% 메탄올:물 200 μL이 그 카트리지에 남아 있는 화합물들을 용출하는데 사용되었고, UPLC-MS 분석 전에 나노퓨어 워터로 1:4 비율로 추가 희석했다. 
  
  
• 커피 브루의 케미컬 프로파일들은 
  UPLC Waters Acquity H-Class system (Synapt G2S-IMqToF mass spectrometer와 연결)
  (Waters Corp.)을 사용하여 수집되었다. 
• 샘플(5 μL)이 Cortecs C18 + column (2.1×100 mm, 2.7 μm; Waters Corp.)으로 주입되었다.
• 컬럼 온도는 40 ℃로 유지되었다.
• 물, 최고 등급의 acetonitrile, 그리고 5% formic acid 수용액 (v/v)이 화합물들을 분리하기 위해 각각
  솔벤트 A, B, C로 사용되었다. 
• 분리는 다음과 같은 변화도(gradient)로 수행되었다: 0 min, 5% B; 0.5–11 min, 5%–50% B; 11–13 min, 50%–95% B; 13–15 min, holding at 95% B; 15–15.01 min, 95%–5% B; 15.01–17 min, holding at 5% B. 
• 솔벤트 C는 전체 gradient에 대해 2%로 설정되었다. 
• 이동상의 유속은 0.5 mL/min로 세팅되었다. 
• Mass spectrometer의 세팅은 다음과 같았다 : ESI negative ionization, mass scan range = 50 to 1700 Da, scan time = 0.3 s, capillary voltage = 3 kV, cone voltage = 30 V, desolvation temperature = 450 ℃, source temperature = 120 ˚C.
• Leucine-enkephalin (556.2771 m/z)이 분석 전체에 걸쳐 질량 정확도 체크를 위해 레퍼런스 mass로 사용되었다. 
• 요약하면, 2개의 technical replicates, 2개의 biological replicates, 그리고 1개의 QC 샘플을 포함하여 총 56개의 커피 브루 샘플을 UPLC-MS 분석을 위해 준비했다.
• 모든 커피 샘플은 무작위 순서로 분석되었다.
• 장비 성능을 체크하기 위해, 샘플 시퀀스 시작 시와 그리고 매번 10개의 샘플 분석 후에, 空시료, 컬럼 스탠다드 (파라벤 스탠다드들 8종 혼합), 그리고 QC 샘플을 주입하여 분석했다.
  
  

UPLC Waters Acquity H-Class system

 

Waters Synapt G2

 

 

2.6 Multivariate statistical analysis (MVA)

 

• UPLC–QToF-MS로 수집한 화학 프로파일링 데이터는 
  Progenesis QI 소프트웨어(Nonlinear Dynamics, Durham, NC)를 사용하여 수행한 피크 추출(peak picking)을 위해 retention times에 맞춰 조정되었다. 
• 케미컬 features는 이온 강도(ion intensity)를 포함한 time_mass/charge ratio (RT_m/z) 형태로 내보냈다.
• R script version 3.5.2 (R Foundation, Vienna, Austria)를 사용하여
  QC 샘플에서 강도가 750 미만이고 분산 계수(coefficient of variance)가 20%를 초과하는 화학적 특징들은 걸러냈다.
• 마지막으로, 전처리된 화학 프로파일링 데이터와 센서리 데이터로 구성된 데이터세트를
  SIMCA-P+ version 14.1 (Umetrics, Umeå, Sweden)로 가져와
  파레토 스케일링을 사용하여 다변량 데이터 분석, 특히 principal component analysis (PCA) 및 orthogonal partial least square (OPLS) 모델을 수행했다.
• OPLS 모델의 경우,
  화학적 프로파일링 데이터와 커피 브루의 쓴맛 강도 평점들을 각각 x변수와 y변수로 사용했다.
• OPLS의 variable of importance (VIP) 값과 S-plot을 활용하여
  커피 쓴맛 강도(coffee bitterness intensity)를 예측하는 화학적 특징들을 선정했다.

 

2.7. Multidimension preparative liquid chromatography–mass spectrometry (LC/MS) fractionation

 

• 선택된 여섯 가지 화학적 특징들(RT_m/z)
  3.19_353.0697, 4.17_335.0766, 4.32_335.0765, 4.30_367.1022, 그리고 4.88_481.2445를
  커피 브루로부터 분리해냈다.
• 추출 방법은 80% 메탄올(v/v) 3L에 분쇄 커피 300g을 첨가하는 방식으로 최적화했다.
• 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 매트릭스를 원심분리하여 상청액(supernatant)을 수거했다.
• 그 상청액을 5kDa 限外濾過膜 (ultrafiltration membrane) (Millipore Sigma, Burlington, MA)으로 여과했다.
• 샘플 정제는 40mL의 95% 메탄올/물(v/v)과 5% 메탄올/물(v/v)로 컨디셔닝된 Oasis HLB 6g 베드 카트리지(Waters, Milford, MA)를 사용하여 수행했다.
• 각 카트리지에 여과된 커피 추출액(200mL)을 넣고, 100mL의 5% 메탄올을 사용하여 베드를 추가로 세척했다.
• 용출은 200mL의 95% 메탄올을 사용하여 수행했다.
• 마지막으로 Rocket Synergy Purge (Genevac, Ipswich, UK)를 사용하여 용출액의 용매를 제거한 후 동결 건조했다.
  
• 동결 건조된 샘플을 10% 메탄올에 재구성하고,
  0.45μm 필터로 여과한 후,
  50mm×50mm Xbridge Prep C18, 5 μm particle size 컬럼 (Waters Co.)을 사용하여
  분획 수집기 (fraction collector) 2767 (Waters Co.)과 결합된 Preparative LC/MS-TQD에 주입했다. 
• 이때 이 컬럼은 (A) 0.1% 포름산을 물에 녹인 용액과 (B) 0.1% 포름산을 메탄올에 녹인 이원 이동상(binary mobile phase)이다.
• Elution gradient는 다음과 같았다 : 0~0.5분, 5% B 유지; 0.5~2분, 5%~15% B; 2~17분, 15%~40% B; 17~19분, 40%~95% B; 19~21분, 95% B 유지; 21~21.01분, 95%~5% B; 21.01~23분, 5% B로 유지. 
• 용출 유속(Elution flow rate)은 전체 실행 동안 100mL/분으로 설정되었다.
  
  
• 첫번째 차원 분리 과정에서 선택된 6개의 특징이 3개의 개별 분획으로 분리되었다. 
• 분획을 모아 용매를 제거하고 동결 건조시킨 후 10% 메탄올에 재구성하고 0.45 μm 필터로 여과했다.
• 두번째 차원 분획을 위해,
  Xselect CSH Prep Phenyl-Hexyl 5μm OBD 50×100mm 컬럼 (Waters Corp., Milford, MA)을 사용하여,
  feature 4.88~481.2445m/z와 feature 5.98~515.1197m/z가 분리되도록 했다. 
• 이때 이원적 이동상은 (A) 0.1% 포름산을 물에 녹인 용액과 (B) 0.1% 포름산을 메탄올에 녹인 용액을 100mL/min의 유속으로 사용했다.
• Elution gradient는 다음과 같았다: 0~19분, 15% B로 유지; 19~20분, 15%~95% B; 20~23분, 95% B 유지; 23~23.01분, 95%~15% B; 23.01~26분, 15% B 유지.
  
  
• 마찬가지로, 두번째 차원 분획의 경우,
  Atlantis T3 OBD 5 μm 50×250 mm 컬럼을 사용하여, feature 3.19~353.0697 m/z, 4.17~335.0766 m/z, 4.32~335.0765 m/z, 그리고 4.30~367.1022 m/z를 분리했다. 
• 이때, (A) 0.1% 포름산 수용액과 (B) 0.1% 포름산 아세톤 용액을 100 mL/분의 유속으로 이원적 이동상으로 사용했다.
• Elution gradient는 다음과 같았다: 0~1분, 5%~20% B; 1~20분, 20%~30% B; 20~21분, 30%~95% B; 21~23.5분, 95% B 유지; 23.5~23.51분, 95%~5% B.
• 두번째 차원 분획은 첫 차원 분획 제조에 사용된 것과 동일한 풀링, 용매 제거, 동결 건조, 재구성 및 여과 절차를 사용하여 제조했다.
  
  
• 마지막으로, 세번째 차원 분획 과정에서는, 
  Xbridge Prep Shield RP18 5 μm 10×250 mm 컬럼을 사용하여,
  feature 4.17_335.0766 m/z, 4.32_335.0765 m/z, 4.30_367.1022 m/z의 이성질체들(isomers) (첫 차원에서 동시 용출되는 화합물)을 분리하고, feature 4.88_481.2445 m/z를 정제했다.
• (A) 0.1% 포름산 수용액과 (B) 0.1% 포름산 아세톤 용액을 7 mL/min의 유속으로 혼합하는 이원적 gradient는 구조적 이성질체들을 포함하여 각 화합물의 분리를 위해 특별히 최적화되었다.
• 4.17_335.0766 m/z의 isomers를 분리하기 위한 elution gradient는 다음과 같았다:
  0~29분, 12% B 유지; 29~30분, 12%~95% B; 30~33분, 95% B 유지; 33~33.01분, 95%~12% B; 33.01~36분, 12% B 유지.
• 4.32_335.0765 m/z의 이성질체를 분리하기 위한 용출 구배는 다음과 같았다:
  0~22분, 15% B 유지; 22~23분,  15%~95% B; 23~25.5분, 95% B 유지; 25.5~25.51분, 95%~15% B; 25.51~28분, 15% B 유지.
• Feature 4.30_367.1022 m/z의 isomers를 분리하기 위한 elution gradient는 다음과 같았다:
  0~20분, 10%~14% B; 20~21분, 14%~95% B; 21~23.5분, 95% B 유지; 23.5~23.51분, 95%~10% B; 23.51~26분, 10% B 유지.
• Feature 4.88_481.2445 m/z를 정제하기 위한 elution gradient는 다음과 같았다:
  0~19분, 15% B 유지; 19~20분, 15%~95% B; 20~23분, 95% B 유지; 23~23.01분, 95%~15% B; 23.01~26분, 15% B로 유지.
  
  
• Mass spectrometer의 세팅은 다음과 같았다:
  negative ionization mode, capillary voltage = 2.5 kV, cone voltage = 30 V,
  source temperature = 150℃, desolvation gas temperature = 400℃. 
• Time-based collection을 사용하여 표적 화합물들의 retention time 범위 내에서 첫 차원 분획을 수집했다.
• Single ion monitoring (SIR)을 사용하여 표적 화합물들의 최적화된 신호 강도를 갖는 2차원 및 3차원 분획을 수집했다.
  

 

2.8. Quantification by ultra-performance
       liquid chromatography–tandem mass spectrometry (UPLC–MS/MS)

 

• 카페인과 화합물 1~10 (Table 1)의 농도는 
  UPLC Waters Acquity Hclass 시스템과 
  TQS mass spectrometer (Waters Corp.)를 사용하여 커피 브루 샘플에서 측정했다.
• 카페인 정량화를 위해, 샘플 준비 및 분석은 이전에 설명한 대로(Section 2.5) 다음과 같은 수정을 거쳐 수행했다.
• Methylparaben (메틸파라벤)(100mg/L)을 내부 표준으로 첨가했다.
• 분리는 Cortecs UPLC C18+ 1.6μm 2.1×50mm 컬럼에서
  (A) 물 + 0.1% 포름산(v/v) 및 (B) 아세토니트릴 + 0.1% 포름산(v/v)의 이원 용매를 다음 gradient로 사용하여 수행했다: 0분, 5% B;0.5~5분, 5%~40% B;5~5.1분, 40%~95% B; 5.1~6.1분, 95% B에서 유지; 6.1~6.2분, 95%~5% B에서 유지; 6.2~8분, 5% B에서 유지.
• 정량 분석은 표준물질을 첨가하여 수행하였으며, 3회 생물학적 반복 실험을 통해 5-점 검량선을 작성하였고, 모든 화합물들의 경우에서 양호한 선형성을 보였다 (R² > 0.99).
  
• 화합물 1~10(Table 1)의 정량을 위해, 시료 준비 및 분석은
  이전에 설명한 방법(section 2.5)에 따라 다음과 같이 수정하여 수행했다.
• Methylparaben (100mg/L)을 내부 표준으로 첨가하고, 95% 아세토니트릴:물 500μL가 웰 플레이트로부터 분석물을 용출하는데 사용되었다.
  
• 4,5-diCQA를 제외한 모든 화합물은
  Cortecs UPLC T3 1.6 μm 2.1×100mm 컬럼에서 (A) 물과 0.1% 포름산(v/v) 그리고 (B) 아세톤과 0.1% 포름산(v/v)의 이원 용매 혼합물을 사용하여 분리했다.
• Gradient는 다음과 같았다: 0~0.5분, 5% B에서 유지; 0.5~10분, 5%~15% B; 10~10.5분, 15% B에서 유지; 10.50~10.51분, 15%~95% B; 10.51~13분, 95% B 유지; 13~13.01분, 95%~5% B; 13.01~15분, 5% B 유지.
  
• 4,5-diCQA는
  Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm 2.1×50 mm 컬럼에서 (A) 0.1% 포름산(v/v)이 포함된 물과 (B) 0.1% 포름산(v/v)이 포함된 아세토니트릴의 이원 용매 혼합물을 사용하여 분리했다.
• Gradient는 다음과 같이 설정했다: 0~0.5분, 10% B 유지; 0.5~8분, 10%~60% B; 8~9분, 60%~90% B; 9~10.5분, 95% B 유지; 10.5~10.51분, 95%~10% B; 10.51~12분, 10% B에서 평형화.
• 정량 분석은 표준물질 첨가에 의해 수행되었으며, 3회 생물학적 반복 실험을 통해 6점 곡선을 작성하였고, 모든 화합물에 대해 양호한 선형성을 보였다 (R² > 0.99).
  

Waters Xevo TQ-XS - Triple Quadrupole mass spectrometer (Photo @ Waters)

 

 

• 질량 분석기의 세팅은 다음과 같았다 : 
  모세관 전압 = 3 kV, 콘 전압 = 30 V, 탈용매화 온도 = 550 ˚C, 소스 온도 = 150 ˚C, 
  탈용매화 가스 유량 = 1000 L/h, 콘 가스 유량 = 150 L/h, 주입량 = 2 μL.
• 다음 조건에서 multiple reaction monitoring (MRM)을 사용하여 데이터를 수집했다 :
  카페인 m/z 195.3 → 138.5 (ESI positive, cone V, collision 26 V),
  메틸파라벤 m/z 150.95 → 91.85 (ESI negative, cone 20 V, collision 18 V). 
• 화합물 1~10의 MRM mode transitions (ESI negative)는 Table 1에 제시되어 있다.
  

 

2.9. Sensory recombination model

 

• Sensory recombination test의 대조군 샘플로는 높은 쓴맛 강도를 가진 것으로 평가된 커피가 사용되었다.
• 재조합 샘플은 쓴맛 강도가 가장 낮은 커피 샘플에서 정량된 화합물의 농도와 일치하도록 대조군 커피에 1~10까지의 10가지 화합물의 조합을 첨가하여 준비했다 (Table 1 참조).
• 10가지 화합물을 첨가하자 샘플 pH가 5.8에서 5.4로 낮아졌다.
  따라서 pH의 영향을 평가하기 위해 pH를 5.4로 조정한 대조군 샘플도 추가로 평가했다.
• 실온에서 각 샘플 5mL를 3자리 코드가 표시된 1-온스 검은색 컵에 무작위 순서로 담아 패널리스트에게 제공했다.
• 패널리스트들은 후각 반응과의 상호작용을 방지하기 위해 평가 중 코 클립을 사용했다.
• 샘플을 섭취하는 동안 패널리스트들은 최소 90초 동안 기다렸다가 크래커와 물을 사용하여 입안을 헹구도록 요청 받았다.
• 모든 평가는 Compusense Cloud 소프트웨어 (Compusense Inc., Guelph, ON, Canada)를 사용하여 2회에 걸쳐 실시했다.
• 이후 세션에서 패널리스트들은 위에서 설명한 것과 동일한 방법에 따라 각 화합물을 첨가한 대조군 샘플을 평가했다.

 

2.10  Sensory analysis of individual compounds

 

• 세 가지 화합물, 즉 
  4-CQA (4-caffeoylquinic acid), 
  5-CQA (5-caffeoylquinic acid), 
  2-GA (2-O-β-glucopyranosyl-atractyligenin)의 맛 속성은 
  5명의 숙련된 센서리 패널리스트가 합의에 의해 추가 평가했다.
• 각 화합물은 5mL의 나노퓨어 워터와 5mL의 buffer (0.05M sodium phosphate buffer에 0.1 M citric acid을 첨가하여 pH 5.8로 조정)에 저-쓴맛 커피 대조군 샘플 농도로 용해했다.
• 평가 중에는 각 화합물의 맛 속성을 확인하기 위해 코 클립을 착용했다.

 

2.11 Nuclear magnetic resonance

 

• NMR 분석은 Bruker Advance III HD Ascend spectrometer에서
  z-gradients를 갖는 5mm triple resonance observe (삼중 공명 관측) TXO cryoprobe  (냉동 탐침) (¹H nucleus는 700MHz, ¹³C nucleus는 176MHz에서 작동)을 사용하여 수행되었다 (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Germany).
• 각 negative marker의 정제된 분말을 용해하기 위해 Deuterated methanol‑d₄를 용매로 사용했다.
  
  

Campus Chemical Instrument Center, Ohio State University

 

 

2.12 Data analysis

 

• 관능 및 정량화 데이터는 SPSS Statistics 버전 25(IBM, Armonk, NY)를 사용하여 분석했다.
• One-way ANOVA 및 two-way ANOVA 그리고, LSD, Tukey HSD, Dunnett’s test (α = 0.05)을 이용한 사후 분석(posthoc analysis)을 통해 샘플의 쓴맛 강도 평점들을 분석하고 패널 성능을 평가했다.

 

 

 3. Results

 

3.1 Data

 

• 본 연구의 주요 목표는 
  커피 브루의 지각되는 쓴맛 강도에 영향을 미치는 화합물, 특히 쓴맛 지각을 조절하거나 쓴맛 화합물의 전구체일 가능성이 있는 화합물을 조사하는 것이었다.
• 14가지 커피 브루 샘플의 쓴맛 강도를 평가하기 위해 먼저 서술적 센서리 평가를 실시했다.
• 각 샘플 간에는 15점 만점에 5.0점에서 9.4점(Fig. 1)까지 유의미한 차이(p < 0.05)가 나타났다.
• 센서리 데이터 검토 결과, 샘플 간 반복 효과(replicate effect) 또는 반복 효과에 의한 샘플 간 상호작용(p > 0.05)은 나타나지 않았으며, 이는 훈련된 패널리스트의 일관성과 수행 능력이 우수함을 시사한다.
• World Coffee Research의 강도 척도에 따라, 선정된 14가지 커피 샘플은 " identifiable (식별 가능한)" 수준 (bitter intensity 4) 바로 위부터 " intense (강렬한)" 수준(bitter intensity 10)까지 광범위한 쓴맛 강도를 나타냈다.
• 쓴맛 강도 평점들은 다변량 통계 모델을 구축하는 데 필수적인 입력으로 사용되었으며, 광범한 범위의 평점들은 센서리 평가와 기본적인 케미컬 프로필 간의 상관관계를 조사하는 데 효과적이었다.
  
  
• 카페인도 알려진 쓴맛 성분으로서 커피 브루에서 정량화되었으며, 그 결과는 Fig. 1에 나와 있다.
• 모든 샘플에서 카페인 농도는 340.5~587.2mg/L 범위였지만, 카페인 농도와 커피 브루의 쓴맛 강도 평점들 간의 상관 계수는 유의하지 않았다 (R² = 0.07).
• 따라서 카페인 농도가 쓴맛 식역치인 78~155mg/L (McCamey et al., 1990)를 초과하더라도, 카페인만으로는 커피의 쓴맛을 예측할 수 없었다.
• 쓴맛에 기여하는 화합물을 더 자세히 조사하기 위해, 쓴맛 지각에 영향을 미치는 화합물을 식별하기 위해 비표적 화학 프로파일링 분석법(untargeted chemical profiling analytical approach)을 활용했다.

 

 

3.2 Multivariate statistical modeling

 

• 감각적 쓴맛 강도 평점들은 커피 브루의 LC-MS 화학적 프로파일을 포함하는 다변량 통계 모형의 예측 변수로 추가 적용되었다.
• 데이터 처리 후, 커피 브루에서 추출한 1,680가지 화학적 특징들을 활용하여 커피 브루의 화학적 특성과 쓴맛 강도 평점들 간의 상관관계를 조사하는 다변량 통계 모형을 구축했다.
• 非指導(unsupervised) PCA 모형은 샘플 이상치들을 파악하고, 샘플의 자연 클러스터를 시각화하며, 장비 측정의 재현성을 확인하기 위해 처음에 구축되었다 (Fig. 2a).
• 로스팅된 원두의 색상은 일반적으로 로스팅 정도를 예측하고 로스팅된 커피 제품의 일관성을 통제하는 데 사용된다 (SCA, 2018).
• 커피 샘플 간의 화학적 변차(Chemical variation)는 일반적으로 색상별로 클러스터링되는 것으로 관찰되었다.
• 커피 원두의 로스팅 과정이 커피의 화학적 프로파일에 지대한 영향을 미치는 것으로 널리 알려져 있기 때문에(Farah et al., 2005; Mills et al., 2013; Moon et al., 2009), 이러한 관찰은 예측 가능하며, 비표적 화학적 프로파일링 분석이 다양한 로스팅 조건에 따른 변이를 성공적으로 포착했음을 시사한다.
• 로스팅 조건 외에도 커피 품종 (Farah et al., 2005) 및 커피 원두의 원산지 (Campa et al., 2005)와 같은 다른 변수들이 커피의 화학적 조성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이는 L 값이 35-36 및 36-37인 샘플과 같은 색상 그룹 내에서 보고된 변이에 기여했을 가능성이 높다.

 

 

• 커피 추출 시 쓴맛 강도를 예측하는 화합물을 정의하기 위해, 
  커피 브루에서 보고된 1,680가지 화학적 특징들을 바탕으로
  supervised orthogonal partial least square (OPLS) model을 구축했다 (Fig. 2b).
• OPLS 모델은
  미디엄 로스트(파란색) 또는 다크 로스트(빨간색)로 분류된 샘플이 왼쪽에서 오른쪽으로 잘 분리되어 있으며,
  이는 각각 낮은 로스트에서 높은 로스트까지의 쓴맛 강도와 상관관계를 나타냄을 보여주었다.
• 따라서 미디엄 로스트로 분류된 커피 원두는 일반적으로 높은 로스트 제품으로 분류된 원두보다 덜 썼다.
• OPLS 모델 지표는
  높은 적합도(goodness of fit)(R²Y = 0.95)와 예측력(predictive power)(Q² = 0.91)을 나타냈으며,
  총 15점 중 root mean squared error of prediction (예측오차의 평균 제곱근)(RMSEP)는 0.28이었다.
• Q² > 0.5인 PLS 모델은 일반적으로 예측성이 좋은 것으로 간주된다 (Triba et al., 2015).
• 게다가 permutation test에서는 그 모델의 no overfitting을 나타냈다 (R² = 0.41, Q² = –0.55). 
  
  
• 본 연구의 주요 초점은 쓴맛 조절제(bitter modulators)로 작용하고 지각된 쓴맛 강도를 억제하는 화합물을 조사하는 것이었다.
• 따라서 예측성이 높고 쓴맛 강도와 음의 상관관계를 갖는 화합물을 S-플롯(Fig. 3)을 사용하여 선정했다.
• S-plot은 OPLS 모델에서 모델링된 상관관계(modeled correlation)와 공분산(covariance)을 산점도(scatter plot)로 결합한다.
• 구체적으로, Y축은 화학적 특성과 쓴맛 강도 간의 상관관계를 나타내고, X축은 모든 샘플에서 화학적 특성 강도의 변화량(공분산)을 나타낸다.
• 중요도 예측 변수(predictive variable of importance)(VIP)는 X 변수(화학적 특성)가 Y 변수(쓴맛 강도 등급)의 변동을 얼마나 잘 설명하는지, 그리고 X 변수가 직교 성분(orthogonal components)의 변동을 어떻게 설명하는지에 따라 결정된다 (Galindo-Prieto et al., 2014).
• VIP 값이 1보다 큰 화학적 특성은 일반적으로 Y 변수의 예측성이 높은 특성으로 간주된다 (Galindo-Prieto et al., 2014).
• OPLS 모델에서 관심 있는 센서리 속성을 정확하게 예측하는 화학적 특성을 선정하기 위해, 공분산, 상관관계, 그리고 VIP 값을 모두 중요한 지표로 사용했다 (Ronningen et al., 2018; Sittipod et al., 2019).
• 최종적으로, 커피 브루에서의 쓴맛 지각에 대한 높은 공분산 및 음의 상관관계를 가지며 VIP 값이 4 이상인 6가지 화학적 특성들을 추가 평가를 위해 선정했다 (Table 1). 
• 선정된 6가지 features (RT_m/z)은
  3.19_353.1, 4.17_335.1, 4.30_367.1, 4.32_335.1, 4.88_481.2, 그리고 5.98_515.1이다.
  

 

 

3.3 Isolation and purification of negative markers

 

• 선정된 6개의 negative VIP features을 볶은 분쇄커피에서 추출하여
  three-dimensional preparative LC-MS fractionation system에서 정제하여
  순도 90% 이상(1H NMR)을 달성했다.
• 분획 과정에서 선정된 4개의 특징들에 대해 두 개의 이성질체(isomers)가 존재하는 것이 확인되었다.
• 원래의 화학적 features (RT_m/z) 3.19_353.1 m/z, 4.17_335.1 m/z, 4.30_367.1 m/z, 그리고 4.32_335.1 m/z는 각각 화학적 프로파일링을 위한 원래 컬럼 조건을 사용하여 동일한 정밀 질량, MS/MS fragmentation 및 retention time을 보고한 두 개의 이성질체로 분리되었다.
  
  
• 요약하면,
  원래 선정된 6개의 negatively correlated features를 최종적으로 10개의 개별 화합물들로 분리하여
  화합물 1~10으로 명명했다.
• 따라서 다변량 통계 모델과 다차원 분취형 LC-MS 시스템을 결합하여,
  커피 쓴맛과 관련된 복잡한 분자 화학에 대한 보다 강력한 발견이 가능해졌다.

 

3.4 Identification of negatively correlated markers

 

• 세 가지 화합물이 retention time, accurate mass, 그리고 MS/MS fragments를 
  표준물질(authentic standards)과 일치시켜 초기에 동정되었다.
• Feature 3.19_353.1(RT_m/z)의 두 이성질체는 각각
  5-caffeoylquinic acid (compound 1, Table 1)과
  4-caffeoylquinic acid (compound 2, Table 1)로 동정되었다.
• 또한, 특징 5.98_515.1은 4,5-dicaffeoylquinic acid (compound 10, Table 1)로 동정되었다.
• 이 화합물들의 MS fragmentation은  Supplementary Data에 제시되어 있다.
  
  
• 나머지 7개 화합물(Table 1)의 경우,
  상용 표준물질을 구할 수 없어 최종 동정(식별)을 위해 2D NMR 분석이 필요했다.
• m/z 335.1 [M-H]^– 및 C₁₆H₁₆O₈ (Δm/z = 0.3 ppm)의 원소 조성을 갖는 마커 4.17_335.1 (1번째 이성질체, 화합물 3)가 MS/MS fragments 및 NMR 데이터를 통해 동정되었다.
• 첫째, ESI– 모드의 MS/MS ion fragments (m/z 135, m/z 161, m/z 179)은 각각 caffeic acid 및 vinylcatechol 분자 단편과 잘 정렬되었다 (Supplementary Data). 
• NMR 분석 결과, 화합물 3의 주요 화학적 이동(key chemical shifts)과 J coupling가 관찰되었다.
• δ 7.06 ppm (d, J = 2.1 Hz, 1H), δ 6.98 ppm (dd, J = 8.2, 2.0 Hz, 1H), 그리고 δ 6.79 ppm (d, J = 8.1 Hz, 1H)에서 나타난 세 가지 방향족 신호(aromatic signals)는 비닐카테콜 부분(vinylcatechol moie)의 삼치환 고리(trisubstituted ring)를 나타냈다.
• 또한, δ 7.61 ppm (d, J = 15.9 Hz, 1H)과 δ 6.31 ppm (d, J = 15.8 Hz, 1H)에서 나타난 두 가지 올레핀 신호(olefinic signals)는 비닐카테콜基의 이중 결합(double bond)에 E 기하 구조(geometry)가 존재함을 보여주었다.
• δ 5.08 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 4.13 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 2.46–2.06 (m, 4H)에서의 주요 신호(key signals)는 카페산 부분(caffeic acid moiety)을 나타냈다.
• 화합물 3의 모든 NMR 데이터 분석 및 문헌에 보고된 데이터와의 일치를 통해,
  이 화합물은 이전에 문헌에 보고된 4-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (Frank et al. 2006)로 확인되었다. 
  
• 비슷하게, marker 4.17_335.1 (2번째 isomer, 화합물 4)은
  분자 이온(m/z 335.1 [M-H]–), MS fragments 및 NMR spectra를 이전에 보고된 화합물(Frank et al., 2006)과 비교하여 본 결과, 5-O-caffeoyl-epi-δ-quinide로 확인되었다.
• 마찬가지로, feature 4.32_335.1 m/z의 두 isomers는
  MS fragmentation 및 NMR 스펙트럼(표 1)을 Frank et al.(2006)이 보고한 것과 비교하여 각각
  4-O-caffeoyl-γ-quinide (compound 5) 및
  3-O-caffeoyl-γ-quinide (compound 6)로 확인되었다.
• 이 두 카페욜퀴나이드의 이성질체들 모두 커피에서 쓴맛이 나는 화합물로 보고되었다.
• 그러나 전반적인 커피 쓴맛에 대한 이들의 기여도는 조사되지 않았다 (Frank et al., 2006).
• 마찬가지로, feature 4.30_367.1 m/z isomer 1과 2는 
  4-O-feruloylquinic acid (compound 7)과 
  3-O-feruloylquinic acid (compound 8)으로 확인되었다 (Frank et al., 2006).  
  
  
• 원소 조성이 C₂₅H₃₇O₉ (Δ m/z = 1.5 ppm)인 최종 화합물 9 (m/z 481.2 [M-H]^–)는 
  기존 문헌(Lang et al., 2013)에 보고된 ¹H 및 ¹³C NMR 데이터를 비교하여 
  2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin으로 확인되었다.
• δ 5.18 ppm (d, J = 1.4 Hz, 1H)과 δ 5.08 ppm (d, J = 1.2 Hz, 1H)에서 공명하는 ¹H NMR key signals는 δ 109.0 ppm (CH₂)에 위치한 ¹³C NMR 신호와 cross peak를 보였으며, 이는 아글리콘 부분의 exomethylene double bond 특성을 나타낸다.
• 또한, δ 3.77 ppm (d, J = 2.1 Hz, 1H)에서 δ 83.6 ppm (CH)과 δ 4.29 ppm (dd, J = 11.4, 4.5 Hz, 1H)에서 δ 73.6 ppm(CH)에 위치한 두 개의 carbinolic methine groups (카르비놀 메틴基)와 1.02 ppm (s, 3H)~17.2 ppm (CH3)에 위치한 독특한 methyl group (메틸基)는 아트락틸리게닌 핵(atractyligenin nucleus)과 일치했다.
• 글루코피라노실 당(glucopyranosyl sugar)은 δ 4.43 (d, J = 7.8 Hz, 1H, 1′)에서 공명하는 신호에 의해 확인되었으며, 이는 당 스핀 시스템(sugar spin system)의 아노머 양성자(anomeric proton)에 속한다 (δ 3.85 (dd, J = 11.9, 2.2 Hz, 1H, 6′), δ 3.68 (dd, J = 11.9, 5.0 Hz, 1H, 6′), δ 3.36 (t, J = 8.7 Hz, 1H, 3′), 3.29 (m, 1H, 5′), 3.27 (m, 1H, 4′), 3.13 (dd, J = 9.1, 7.8 Hz, 1H, 2′)).
• 확인된 식별에도 불구하고 2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin의 관능적 특성은 문헌에 보고되어 있지 않다.
  
  

3.5 Quantification of negative markers in coffee brew

 

• 화합물 1~10의 농도는 
  Table 1에 나타낸 low (intensity = 5.0, Fig. 1) 그리고 high (intensity = 9.4, Fig. 1) 쓴맛 커피 브루 샘플에서
  정량화되었다.
• 예상대로, 각 화합물의 양은 저(低)쓴맛 커피에 비해 고(高)쓴맛 커피에서 유의미하게 더 낮았으며, 이는 OPLS 모델에서 측정된 커피 쓴맛 강도와의 음의 상관관계와 일치했다.
• 두 가지의 화합물들 4-CQA와 5-CQA는 샘플 간 농도 절대값이 170mg/L 이상에서 큰 차이를 보였다.
• Blumberg  et al. (2010)은 4-CQA와 5-CQA가 생두에 풍부하게 함유되어 있으며, 로스팅 과정에서 농도가 유의미하게 감소한다고 보고했다.
• 따라서 低-쓴맛 (미디엄 로스트) 및 高-쓴맛 (다크 로스트) 커피에서 caffeoylquinic acids의 농도 차이가 큰 것은 예상된 결과였다.
• 마찬가지로, 2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin은 로스팅 온도가 높아질수록 분해되는 것으로 보고되었다 (Lang et al., 2013).
• 본 연구에서 高-쓴맛 커피 샘플은 대체로 다크 로스트로 확인되었기 때문에(Fig. 2b),
  이러한 결과는 선정된 화합물 1~10이 커피의 쓴맛 강도와 음의 상관관계를 나타냄을 뒷받침한다.   
  
  

3.6 Sensory recombination testing of negative markers on coffee bitterness

 

• 화합물 1~10이 쓴맛 지각에 미치는 센서리 영향은
  高-쓴맛 커피를 대조군 샘플로 사용하여 재조합 시험을 통해 평가했다.
• 센서리 테스트에는 세 가지 샘플이 포함되었다:
  a) 고쓴맛 커피(대조군, pH 5.8, Table 1),
  b) 저쓴맛 커피의 농도를 모방하기 위해 화합물 1~10을 첨가한 대조군 샘플(Table 1 참조),
  c) pH 5.4로 조정된 대조군 샘플.
• 전반적으로 대조군 샘플(저쓴맛 재조합 모델)에 화합물 1~10을 첨가했을 때 대조군 샘플에 비해 쓴맛 강도가 1.5포인트 유의하게 감소하는 것으로 나타났다 (p < 0.05)(Fig. 4a).
• 세계 커피 연구(2017)의 쓴맛 강도 척도에 따르면, 10에서 8로 2포인트 감소하면 쓴맛이 "강함"에서 "중간 강도" 수준으로 변했음을 나타낸다.
  
  
• pH 조절된 대조군 커피 샘플(pH 5.4)도 평가했다. 
• 커피 대조군 샘플에 산성 화합물 1~10을 첨가했을 때, pH가 5.8에서 5.4로 약간 떨어졌기 때문이다.
• 따라서 pH가 센서리 쓴맛 강도 평점들에 미치는 영향을 확인하기 위해, pH 조절된 대조군 샘플을 샘플 세트에 포함했다.
• pH 조절된 커피와 대조군의 쓴맛 강도는 유의미한 차이가 없었으며, 이는 커피 쓴맛의 감소가 해당 pH 변화와는 무관한 화합물 1~10의 활성에 의한 것임을 확인시켜 준다.
• 센서리 데이터는 샘플에 대한 반복 효과 또는 반복 상호작용에 의한
  샘플에 대한 반복 효과가 없음을 보고했다 (p > 0.05). 
• 이는 훈련된 패널리스트의 일관성과 성과가 우수함을 나타낸다.
  
  
• 이후 각 화합물 1~10의 쓴맛 억제 활성(bitter suppression activity)을 평가했다.
• 각 화합물은 저-쓴맛 커피에 존재하는 농도로 대조군인 고-쓴맛 커피에 개별적으로 첨가했다 (Table 1).
• 화합물 1~10 중 4-CQA, 5-CQA, 2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin의 세 가지 화합물은
  쓴맛 강도를 각각 0.6~0.8 단위만큼 유의미하게 감소시키는 것으로 나타났다 (Fig. 4b 참조).
• 화합물 1~10 중 혼합물로 첨가된 네 가지 화합물, 특히 caffeoyl-quinides (화합물 3~6)는
  커피 브루에서 쓴맛을 내는 화합물로 보고되었으며,
  쓴맛 식역 범위는 물에서 11.2mg/L에서 60.5mg/L에 이른다 (Frank et al. 2006).
• 흥미롭게도, 대조군 커피에 화합물 3, 5, 또는 6 (Table 1)을 첨가했을 때,
  모두 쓴맛 식역치 이상의 농도였으며 커피 쓴맛의 현저한 증가는 나타나지 않았다. 
  그러나 이는 샘플의 쓴맛 강도가 높았기 때문일 수 있다.
• 따라서, 화합물 1~10의 혼합물로 쓴맛 화합물을 첨가했음에도 불구하고(Fig. 4a),
  4-CQA, 5-CQA, 그리고 2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin의 조절 작용(modulation activity)으로 인해
  쓴맛 억제(bitter suppression)가 여전히 관찰되었다.
• 본 연구 결과는 커피의 쓴맛 화합물과 조절물질들(modulators) 간의 상호작용이 지각되는 쓴맛 강도에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
  
  

 

• 미디엄 로스팅된 로부스타 커피의 쓴맛 강도 감소가 모델 시스템에서 클로로겐산 락톤(chlorogenic acid lactones)의 효소적 가수분해(enzymatic hydrolysis)에 의해 이전에 보고된 바 있다 (Kraehenbuehl et al., 2017).
  그러나 이 효소적 가수분해 방법(enzymatic hydrolysis method)은 에스테라아제(esterase)를 첨가해야 했을 뿐만 아니라, 발효 냄새(fermented), 식물성 냄새(vegetal), 아라비카 향(arabica notes)과 같은 추가적인 플레이버 속성을 생성했다.
• 또한 페놀 화합물들의 혼합물(mixture of phenolic compounds)이
  인공적으로 감미된 음료(artificially sweetened beverage)의
  금속성(metallic) 및 쓴맛(bitter) 잡미(off-tastes)를 조절한다는 보고도 있다 (Chien et al., 2012).
• 그 페놀 화합물들의 혼합물은
  caffeoylquinic acids, feruloylquinic acids, 그리고 caffeoylferuloylquinic acids를 포함하여
  10종 이상의 클로로겐산들로 구성되었다.
• 다른 연구자들은 클로로겐산(chlorogenic acids)이 추출된 커피의 산미(acidity), 떫은맛(astringency), 쓴맛(bitterness)에 영향을 미친다고 한 바 있다 (Farah et al., 2006).
  

4-caffeoylquinic acid

 

5-caffeoylquinic acid

 

• 4-CQA, 5-CQA, 2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin의 맛 속성(taste attributes)은
  저-쓴맛 커피 샘플 (Table 1)에서 측정된 농도로, 5명의 훈련된 센서리 패널리스트가
  나노퓨어 워터와 sodium phosphate buffer (pH 5.8)에서 개별적으로 평가했다.
• 물과 완충액 모두에서 4-CQA와 5-CQA는 매우 약한 신맛(very weak sour taste)을 나타냈지만,
  2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin은 물이나 완충액 모두에서 뚜렷한 맛 특성이 관찰되지 않았다.
• 이 결과는 4-CQA, 5-CQA, 2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin이
  지각을 억제한 쓴맛 조절제(bitter modulators)였다는 확인으로 이끌었다. 
  
  
• 카페욜퀴닉산(Caffeoylquinic acids)은 커피에서 가장 풍부한 클로로겐산이다
  (Farah & Donangelo, 2006; Crozier et al., 2012).
• 콩의 원산지 (Campa et al., 2005),
  로스팅 공정 (Farah et al., 2005; Mills et al., 2013; Moon et al., 2009), 그리고
  추출 조건 (Fujioka and Shibamoto, 2008; Moeenfard et al., 2014)은
  커피 브루의 클로로겐산(chlorogenic acids) 농도에 영향을 미쳤다.
• 커피 種(coffee species)과 추출 방법(brewing methods)에 따라, 4-CQA의 농도는
  12~445mg/L, 5-CQA는 16~409mg/L로 나타났다 (Moeenfard et al., 2014).
• 4-CQA와 5-CQA의 쓴맛 조절 효과(bitter modulation effect)를 고려할 때,
  4-CQA와 5-CQA 농도 차이가 25배 이상일 경우 최종 커피 브루의 쓴맛 강도에 영향을 미칠 수 있다.
• 더 중요한 것은, 이는 커피의 쓴맛 강도를 조절하기 위해
  4-CQA와 5-CQA의 농도를 조절할 수 있음을 시사한다는 것이다. 
  
  
• 카페욜퀴닉산(caffeoylquinic acids)은 널리 연구되어 왔지만, 커피에서 
  2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin에 대한 지식은 제한적이다.
• 커피 생두와 커피 브루 모두에서
  2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin의 존재가 보고되었지만 (Lang et al., 2013, 2015),
  2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin이 커피의 쓴맛에 미치는 관능적 영향은 아직 불분명했다.
• 우리가 아는 한, 본 연구는
  로스팅된 커피 브루에서의 쓴맛 조절제(bitter modulator)로서
  2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin을 최초로 식별했다.  
  
  

 4. Conclusion

 

비표적 LC-MS 프로파일링 방법(untargeted LC–MS profiling methods) (flavoromics)을 적용하여 커피 쓴맛(coffee bitterness)과 음의 상관관계를 갖는 화합물(negatively correlated compounds)을 발견했을 뿐만 아니라, 커피의 쓴맛을 억제하는 특정 쓴맛 조절제(bitter modulators)인 4-CQA, 5-CQA, 2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligeni을 발견했다.
이러한 결과는 커피 브루의 플레이버 지각에 있어 맛 조절제(taste modulators)의 중요성을 뒷받침한다. 

 

 Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129225.

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