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Coffee Chemistry

커피 모잠비오사이드 로스팅産物들과 쓴맛 受容體 活性化

by mjcafe 2025. 5. 29.

 

• 아라비카 커피 特有의 쓴맛을 내는 모잠비오사이드가 커피 로스팅 過程에서 分解된다.
• 以前에는 알려지지 않았던 더 강한 쓴맛을 가진 熱分解 産物들이 生成된다.
• 그 새로운 化合物들의 構造가 NMR과 HR-MS를 통해 糾明되었다.
• 그 새로운 化合物들은 TAS2R43 및 TAS2R46 (HEK 293T-Gα16gust44)에 대한 强力한 作用劑이다.
• 分子 도킹 시뮬레이션을 통해 쓴맛 受容體 內에서의 配列을 確認할 수 있다.

 


Contents
 

■ Abstract
■ 1. Introduction
■ 2. Materials and methods
  2.1 Pyrolysis of mozambioside
  2.2 Ultra-high-performance liquid chromatography-photo-diode array detection (UHPLC-PDA)
  2.3 Fractionation of roasting products by preparative high-performance
       liquid chromatography (HPLC)
  2.4 Purification of roasting products by semi-preparative high performance
       liquid chromatography (HPLC)
  2.5 Formation of 11-hydroxycafestol-2-on (8) 
       by enzymatic hydrolysis of 17-O-β-D-glucosyl-11-hydroxycafestol-2-on (2)
  2.6 Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)
  2.7 Ultra-high-performance liquid chromatography-time-of-flight-mass-spectrometry
       (UHPLC-ToF-MS)
  2.8 Functional calcium mobilization assay
  2.9 Molecular modeling and in silico calculations
■ 3. Results & discussion
  3.1 Bitter receptor screening of the mixture of mozambioside roasting products
  3.2 Model roasting of isolated mozambioside to generate degradation products
  3.3 Structure elucidation of 17-O-β-D-glucosyl-11-hydroxycafestol-2-on (2)
  3.4. Structure elucidation of 11-O-β-D-glucosyl-16-desoxycafestol-2-on (3)
  3.5 Structure elucidation of 11-O-β-D-glucosyl-(S)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on (4)
       and 11-O-β-D-glucosyl-(R)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on (6)
  3.6. Structure elucidation of 11-O-β-D-glucosyl-15,16-dehydrocafestol-2-on (5)
  3.7 Identification of bengalensol (7)
  3.8 Generation of 11-hydroxycafestol-2-on (8) for structure–activity relationships
  3.9 Detection of mozambioside and its roasting products in roasted Arabica coffee
  3.10 Characterization of bitter taste receptor activation
  3.11 Investigation of putative binding modes
■ 4. Conclusions
■ Appendix A Supplementary data
■ References

 

 Abstract

  • 아라비카 커피 生豆에 含有되어 있는 쓴맛을 내는 디테르펜 글리코사이드(diterpene glycoside)인 모잠비오사이드는 커피 로스팅 過程에서 分解되어 아직 알려지지 않은 構造的으로 關聯된 分解 産物들을 生成하는데, 이 産物들은 쓴맛 受容體 活性化 特性과 유사할 可能性dx이 있다.
  • 本 硏究는
    모잠비오사이드의 個別 熱分解 産物들의 生成, 分離 및 構造 糾明과
    HEK 293T-Gα16gust44 細胞에서의 in vitro 分析을 통한 쓴맛 受容體 活性化 特性을 糾明하는 것을 目標로 했다.
  • 새로운 化合物인
    17-O-β-D-glucosyl-11-hydroxycafestol-2-on,
    11-O-β-D-glucosyl-16-desoxycafestol-2-on,
    11-O-β-D-glucosyl-(S)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on,
    11-O-β-D-glucosyl-15,16-dehydrocafestol-2-on, and
    11-O-β-D-glucosyl-(R)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on가
    熱分解된 모잠비오사이드로부터 HPLC에 의해 分離되었고, NMR과 UHPLC-ToF-MS에 의해 識別되었다.
  • 로스팅 産物
    11-O-β-D-glucosyl-(S)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on,
    11-O-β-D-glucosyl-15,16-dehydrocafestol-2-on, and
    11-O-β-D-glucosyl-(R)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on은
    모잠비오사이드에 비해 쓴맛 受容體 活性化 識閾値가 낮았다.
  • 分子 도킹 시뮬레이션을 통해 두 同族 受容體인 TAS2R43과 TAS2R46에서
    化合物 11-O-β-D-glucosyl-15,16-dehydrocafestol-2-on 및
              11-O-β-D-glucosyl-(R)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on 그리고
              이들의 아글리콘 11-hydroxycafestol-2-on의 結合 方式이 밝혀졌다.
  • 새롭게 發見된 로스팅 生成物인
    17-O-β-D-glucosyl-11-hydroxycafestol-2-on,
    11-O-β-D-glucosyl-(S)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on,
    11-O-β-D-glucosyl-15,16-dehydrocafestol-2-on, and
    11-O-β-D-glucosyl-(R)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on은
    UHPLC-ToF-MS를 통해 진짜 볶은 커피에서 檢出되었으며, 이는 커피의 쓴맛에 影響을 미칠 수 있다.

 

 1. Introduction

  • 커피는 世界 經濟에서 상당한 重要性을 지닌 作物이다 (유엔 식량농업기구, FAO).
  • 2020년, 상업적으로 중요한 두 種인 코페아 아라비카(Coffea Arabian L.)와 코페아 카네포라(Coffea canephora)의 最大 生産國(비율 약 53:47)은 브라질(36.3%), 베트남(17.3%), 인도네시아(7.4%), 콜롬비아(8.1%)였다 (FAO, 2023년 3월).
  • 2022/23년에 약 10.2 × 106톤의 生커피가 收穫되었다 (미국 농무부 [USDA], 2023년 6월).
  • 유럽(24.4%), 미국(15.7%), 브라질(13.4%)이 가장 重要한 市場이다. 이 세 나라를 합치면 全 世界 生産量의 약 53.5%를 消費했다 (USDA, 2023년 12월).

  • 커피 生豆는 일반적으로 220℃ 이상의 溫度에서 乾式 加熱을 통해 볶은 커피(roasted coffee)로 가공된다 (Illy & Viani, 2005, 4장).
  • 로스팅은 生産 過程에서 중요한 段階로 간주된다.
  • 완두콩과 같은 플레이버가 매혹적인 토스트 香(toasty notes)으로 바뀌고,
    커피 콩들은 부서지기 쉽고 짙은 褐色으로 변한다 (Clarke & Mcrae, 1987, Chapter 4; Parliament, 2000, Chapter 20).
  • 대부분의 로스팅은 유럽에서 이루어진다.
    2022년 이탈리아(295×103톤), 독일(251×103톤), 스위스(107×103톤)는 로스팅된 커피 輸出量 기준 世界 主要 生産國이었다 (FAO, 2023년 12월).

  • 원리상, 커피 브루(coffee brew)는 粉碎하고 볶은 커피 씨앗의 물 抽出物이다 (Parliament, 2000, 20장).
  • 이 음료는 전 세계적으로 소비되며 콜드브루, 필터 커피, 에스프레소 등 다양한 형태로 提供된다.
  • 이러한 인기의 일부는 含有된 알칼로이드 카페인의 藥理學的 特性과 關聯이 있다.
  • 卽刻的인 效果(예: 覺醒 및 集中力 向上, 기분 改善, 疲勞 減少)와
    長期的인 效果(예: 認知機能 低下 豫防)가 보고되었다 (Nehlig, 2018).
  • 그러나 快樂的 價値(hedonic value)가 커피 消費의 核心 動因이며,
    구운 香(toasty notes), 酸味(acidity), 쓴맛(bitterness)은
    플레이버 프로파일의 중요한 特徵이다 (Batali et al., 2022).
  • 카페인이 가장 잘 알려진 쓴맛 커피 成分이다.
  • 카페인은 人間의 쓴맛 受容體인 TAS2R7, -R10, -R14, -R43, -R46을 活性化하며(Meyerhof et al., 2010), 상업용 로스팅 커피에는 약 600~700mg/l의 카페인이 含有되어 있다 (Weiss et al., 2010).
  • 그러나 카페인 含量이 減少된 커피도 마찬가지로 쓴맛이 나는 것으로 판단되어(Šeremet et al., 2022), 追加的인 쓴맛 化合物들의 存在를 强調한다.

  • 로스팅 프로세스는 前驅體들(precursors)로부터 여러 종류의 새로운 쓴맛 化合物들을 生成하여 커피의 전반적인 맛에 寄與하는 것으로 알려져 있다.
  • 클로로겐酸(Chlorogenic acids, CGA)은
    퀴닌酸(quinic acid)과, 그리고 페룰酸(ferulic acid), p-쿠마르酸 (p-coumaric acid), 카페酸(caffeic acid)과 같은 hydroxycinnamates의 에스테르(esters)이다.
  • CGA는 乾燥 重量의 6~10%를 차지하며 生豆에 매우 풍부하게 含有되어 있다 (Clifford, 1999).

  • Frank et al. (2006, 2008)는
    "taste-dilution analysis"라는 센서리 分析 槪念을 적용하여 로스팅된 커피에서 필수적인 쓴맛 化合物로 caffeoyl-quinides ("chlorogenic acid lactones", CQLs)를 識別했다.
  • CQL은
    quinic acid moiety의 熱-誘導 락톤化(heat-induced lactonization)에 의해 CGA로부터 形成되며,
    3-caffeoylquinic-1,5-lactone 및
    4-caffeoylquinic-1,5-lactone이 주요 派生物質들이다 (Farah et al., 2005).
  • Caffeic acid(카페酸)의 熱分解는
    tetraoxygenated phenylindanes를 形成하는데(Guillot et al., 1996),
    Frank et al.(2007)은 이를 "harshly bitter"한 것으로 묘사했다.
  • CGA에서 유래하는 이러한 쓴맛 化合物은
    뜨거운 물에 溶解되기 때문에 커피 抽出液에 抽出된다 (Blumberg et al., 2010).
  • 또 다른 쓴맛 化合物群으로, Ginz & Engelhardt (2000, 2001)는
    커피의 단백질 分劃을 로스팅할 때 形成되는 디케토피페라진 (diketopiperazines, DKP)이
    커피 브루에 抽出되어 맛에 影響을 미친다고 報告했다.
  • Stark and Hofmann (2005)이
    볶은 코코아닙의 쓴맛에 대해 조사한 資料는 DKP가 커피의 쓴맛에 影響을 미칠 수 있다는 假定을 뒷받침한다.

  • Mozambioside (Fig. 1, D의 1)는 
    아라비카 커피에 존재하는 디테르펜 配糖體(a diterpene glycoside)로,
    카페인보다 대략 2배 높은 쓴맛을 誘發한다 (Richter & Spiteller, 1979).
  • 모잠비오사이드 1은
    카페인-프리 커피 種, 예를 들어 Coffea pseudozanguebariae Bridsen에서 특히 풍부하게 發見되었기 때문에, 植物의 防禦 機轉으로 카페인을 대체하는 役割을 했을 것이라는 假說이 提起되었다 (Prewo et al., 1990).
  • 이 化合物은
    쓴맛 受容體인 TAS2R43과 TAS2R46을 活性化하며 (Lang et al., 2020),
    보고된 인간의 쓴맛 識閾値는 60 ± 10 μM이다 (Lang et al., 2015).
  • 定量的 硏究에 따르면,
    커피 로스팅 중에 1의 약 80%가 熱分解 되어
    커피 브루에 ~10μM의 모잠비오사이드가 殘溜하는 것으로 나타났다 (Lang et al., 2015). 
  • 커피 디테르펜 配糖體(diterpene glycoside) 모잠비오사이드(1)는 
    커피의 쓴맛에 寄與할 수 있는, 
    아직 알려지지 않은 構造的으로 關聯된 熱分解 生成物 그룹의 前驅體로 推定된다.

  • 따라서, 本 硏究의 目的은 다음과 같다. 
    1) 1의 모델 熱分解 및 非揮發性 熱分解 産物들의 分離; 
    2) Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) 및 
        Ultra-high-performance liquid chromatography-Time-of-Flight-mass
        spectrometry (UHPLC-ToF-MS)을
        使用하여 非揮發性 熱分解 産物들의 構造 糾明; 
    3) 26가지 人間 쓴맛 受容體의 活性化 스크리닝, 活性化 識閾値 및 用量-反應 데이터 收集; 
    4) 규명된 構造의 分子 도킹 分析을 통한 가능한 
        化合物-受容體 結合 方式(compound-receptor binding modes)에 관한 調査; 
    5) 진짜 커피 브루에서 1의 규명된 熱分解 産物들의 檢出.

 

 2. Materials and methods

 

2.1 Pyrolysis of mozambioside 

 

  • Mozambioside (1, 80mg)를 밀리포어 워터(~10ml)에 溶解시키고, 結晶化 접시에서 하룻밤 동안 공기 乾燥시켰다.
  • 그런 다음 乾燥된 物質을 히팅 플레이트 (220℃, 4.5분)에서 加熱하고 室溫으로 冷却시켰다.
  • 그 物質을 물/메탄올(50/50, ~10ml)에 녹이고 超音波 處理(30분)한 후,
    멤브레인 필터(0.45μm, Ø 25mm, Rotalibo®, Carl Roth, Karlsruhe, Germany)를 使用해 濾過했다.
  • 로스팅 生成物들을 含有하고 있는 맑은 濾過液을
    ⇒ UHPLC-PDA (2.2)로 分析하고,
    ⇒ 分取用 (preparative) HPLC(2.3)로 分獲한 후,
    ⇒ 個別 化合物들을 semi-preparative HPLC(2.4)로 精製했다.

 

2.2. Ultra-high-performance liquid chromatography-photo-diode array detection (UHPLC-PDA)

 

  • UHPLC 시스템 (Shimadzu, Duisburg, Germany)은 Nexera XS 모델로,
    LC-40D XS 펌프 2개, 오토샘플러 (SIL-40C-XS), 컬럼 오븐 (CTO-40S), 그리고 190~500nm의 스펙트럼을 기록하도록 설정된 PDA 검출기(SPD-M40)를 使用했다.
  • 試料(5 μl)를 C18 컬럼 (Kinetex C18, 100×2.1 mm, 1.7 μm, Phenomenex,  Aschaffenburg, Germany)에 注入했다. 流速은 400 μl/min였다. 
  • 鎔離液 A는 0.1% 포름산을 물에 녹인 溶液이고, 鎔離液 B는 0.1% 포름산을 아세토니트릴에 녹인 溶液이었다.
  • 그 binary gradient는 2분 동안 5% B로 시작하여 12분 동안 30%로 增加시키고, 1분(1.5분 等溶媒) 동안 100%까지 增加시킨 후, 0.5분 동안 5%로 낮추고 3분간 維持했다. 總 分析 時間은 20분이었다.

Shimadzu Nexera-XS-inert UHPLC System

 

 

2.3. Fractionation of roasting products by preparative high-performance liquid chromatography (HPLC)

 

  • 로스팅 生成物들은 Büchi PurePrep 시스템 (Büchi, Flawil, Switzerland)을 使用하여
    分取用 HPLC로 分獲했다.
  • 이 시스템은 PFP 컬럼(Luna PFP(2), 21.2 mm × 250 mm, 5μ, Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)에서
    ELSD 기능 및 UV detection (280 nm) 기능을 갖추었다.
  • Millipore water (0.1 % 포름산, eluent A)와 acetonitrile (0.1 % 포름산, eluent B)으로
    binary gradient을 적용했다.
  • Gradient elution은 100 % A(2분간 等溶媒)에서 20 ml/min의 流速으로 始作했다. 이후, B는 10분 이내에 10%, 25분 이내에 27%, 2분 이내에 80%(1분간 等溶媒)로 增加했고, 1.5분 이내에 始作 條件으로 돌아왔다(6분간 等溶媒).
  • 피크는 유리관 당 2ml씩 分獲 收集器에 모아서 UHPLC-PDA와 UHPLC-ToF-MS로 分析했다.

 

Büchi PurePrep system - Chromatography system - Pure C-850 FlashPrep

 

 

 

2.4. Purification of roasting products by semi-preparative high-Performance liquid chromatography (HPLC)

 

  • 個別 로스팅 生成物들을 含有하는 分取物들(fractions)을
    Jasco system (Pfungstadt, Germany) coupled to a UV/VIS detector (280 nm)에서
    semi-preparative HPLC에 의해 精製했다. 
  • 그 試料들(100 μl)을
    Hyperclone C18 컬럼 (250 mm×10 mm, 5 μm, Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)에
    手作業으로 注入했다.
  • 溶出液은 millipore water에 0.1% 포름산을 첨가한 溶液(eluent A)과 아세토니트릴에 0.1 포름산을 첨가한 溶液 (eluent B)이었다 ; flow rate은 4.7 ml/min였다.
  • Binary gradient는 5% B(等溶媒, 5분)로 시작하여, 20분 이내에 30%(等溶媒, 4분)로 增加시키고, 3분 이내에 100%(等溶媒, 3분)로 增加시킨 후, 5분 이내에 5%(等溶媒, 5분)로 낮추었다.
  • 피크들은 手動으로 收集하여 凍結乾燥로 말렸다.

  • 17-O-β-D-glucosyl-11-hydroxycafestol-2-on (2). 
    Retention time in UHPLC-ToF-MS (cf. 2.6): 10.67 min,
    ToF-S (ESI+) found m/z 531.2215 (C26H36O10 + Na, [M+Na]+]);
    cf. Table 2 (13C data) and Table 3 (1H data).
  • 11-O-β-D-glucosyl-16-desoxycafestol-2-on (3).
    Retention time in UHPLC-ToF-MS (cf. 2.6): 13.33 min,
    ToF-MS (ESI+) found m/z 515.2258 (C26H36O9 + Na, [M+Na]+]);
    cf. Table 2 (13C data) and Table 3 (1H data).
  • 11-O-β-D-glucosyl-(S)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on (4).
    Retention time in UHPLC-ToF-MS (cf. 2.6): 14.00 min,
    ToF-MS (ESI+) found m/z 513.2103 (C26H34O9 + Na, [M+Na]+]);
    cf. Table 2 (13C data) and Table 3 (1H data).
  • 11-O-β-D-glucosyl-15,16-dehydrocafestol-2-on (5).
    Retention time in UHPLC-ToF-MS (cf. 2.6): 14.17 min,
    ToF-MS (ESI+) found m/z 513.2105 (C26H34O9 + Na, [M+Na]+]);
    cf. Table 2 (13C data) and Table 3 (1H data).
  • 11-O-β-D-glucosyl-(R)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on (6).
    Retention time in UHPLC-ToF-MS (cf. 2.6): 14.42 min,
    ToF-MS (ESI+) found m/z 513.2105 (C26H34O9 + Na, [M+Na]+]);
    cf. Table 2 (13C data) and Table 3 (1H data).

 

 

Jasco SemiPrepSFC

 

 

 

 

2.5. Formation of 11-hydroxycafestol-2-on (8) by enzymatic hydrolysis of
        17-O-β-D-glucosyl-11-hydroxycafestol-2-on (2)

 

  • 17-O-β-D-glucosyl-11-hydroxycafestol-2-on (2, 12 mg, 23.6 μmol)을 
    sodium acetate (아세트산나트륨) buffer (5 g/100 ml, pH 4.8, 5 ml)에 溶解시키고, 
    β-glucuronidase (Helix pomatia, 500 μl)와 함께 攪拌하였다(12시간, 37℃).
  • 아세토니트릴(10 ml)을 添加한 후,
    沈澱物을 圓心分離(4℃, 5분, 4000 rpm)하여 除去하고, 上淸液을 공기 흐름 속에서 蒸發시켰다.
  • 殘留物을 물(3 ml)에 녹이고 semi-preparative HPLC(2.4 참조)로 精製하였다. 
  • 11-hydroxycafestol-2-on을 회백색의 거품 형태로 얻었다.

  • 11-hydroxycafestol-2-on (8).
    Retention time in UHPLC-ToF-MS (cf. 2.6): 11.18분,
    ToF-MS(ESI+) 測定 結果 m/z 369.1675(C20H26O5 + Na, [M+Na]+]);
    Table 2 (13C 데이터) 및 Table 3 (1H 데이터) 參照.

 

2.6. Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)

 

  • 1D and 2D nuclear magnetic resonance (NMR) 데이터는
    AV500 NMR spectrometer (500 MHz, Bruker Avance III, Bruker, Rheinstetten, Germany)를
    使用하여 記錄했다. 
  • ROESY 스펙트럼은 AV600 NMR spectrometer에서 記錄되었다.
  • 데이터는 Topspin 소프트웨어(버전 4.1.3, Bruker, Rheinstetten, Germany)와
    MestReNova 소프트웨어(버전 14.2.1; Mestrelab Research S.L., Santiago de Compostella, Spain)를
    使用하여 처리했다.
  • Proton signals (陽性子 信號)는 信號가 상당히 겹치므로 1H and 1H, 13C-HSQC spectra로부터 推論했다.
     주석이 달린 스펙트럼들이 Supporting Information (Supporting Figs. 7-42)에 정리되어 있다.

 

Bruker NMR spectrometer models

 

 

2.8. Functional calcium mobilization assay

 


Functional screening. 
 

  • Functional screening experiment가 이전 論文(Lang et al., 2020; Ziegler & Behrens, 2021)과 동일하게 遂行되었다.
  • 간략히 설명하면, HEK 293T-Gα16gust44 細胞를 96-웰 플레이트에서 일반적인 條件(DMEM, 10% FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 글루타민; 37℃, 5% CO2, 포화 습도)으로 培養하고, 리포펙타민(lipofectamine) 2000을 使用하여 26개의 機能的 人間 TAS2R(Meyerhof et al., 2010; Lang et al., 2023)을 코딩하는 cDNA 構造體로 일시적으로 形質 感染시켰다.
  • 빈 벡터는 陰性 對照群(mock)으로 形質 感染시켰다.
  • 24시간 후, 細胞를 프로베네시드(probenecid)(2.5 mM) 존재 하에 Fluo4-AM 染料로 1시간 동안 處理한 후,
    C1 buffer (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 10 mM 포도당, 10 mM HEPES; pH 7.4)으로 洗滌하고,
    螢光 이미징 플레이트 判讀機(fluorometric imaging plate reader)(FLIPRTetra, Molecular Devices, San Jose, USA)에 넣었다.
  • 볶은 모잠비오사이드를 C1 buffer에 溶解하고 C1 buffer로 1:10으로 稀釋했다.
  • 細胞에 試驗 物質을 適用한 후, 螢光 變化(510 nm 勵起 波長 및 488 nm 放出 波長)를 測定했다. 
  • 이어서 소마토스타틴(somatostatin) 14(100 nM)를 細胞에 첨가하여 細胞 生存率을 試驗했다.


Receptor activation threshold and dose response. 
 

  • HEK 293TGα16gust44 細胞에 스크리닝 實驗과 마찬가지로 TAS2R43, TAS2R46 및 빈 벡터를 形質感染시켰다.
  • 試驗 物質(2~6, 8)을 C1 buffe로 稀釋하고 스크리닝 實驗과 유사하게 測定하였다.
  • 결과는 세 번의 독립적인(n = 3) 測定을 기반으로 하며, 각각 重複 測定하였다.
  • 化合物-特異的 螢光 變化(Δ F/F)를 計算할 때, 동일하게 처리한 模擬 對照群의 데이터를 빼고 背景 螢光을 기준으로 正規化하였다.
  • Dose-response curves (用量-反應 曲線)은 信號 振幅을 log 化合物 濃度에 대해 그래프로 표시하여 確立하였다.
  • 半最大有效濃度(half maximal effective concentration)(EC50)는
    y = (max – min)/[1 + (x/EC50)-Hillslope] + min 방정식을 使用한 非線型 回歸 分析을 통해 確認하였다.
    여기서 x는 物質 濃度이다.
  • 플롯은 SigmaPlot 14.0을 使用하여 生成하였다.


Statistics. 
 

  • 識閾 濃度는 對照群보다 쓴맛 受容體 反應이 유의하게 큰 最低 濃度로 定義했다 (Student’s t-test, P < 0.05, Table 1).
  • 로스팅 前後 모잠비오사이드의 EC50 값은 Student’s t-test (unpaired, two-tailed, Table 1)으로 比較했다.
  • 로스팅 産物들의 效能 差異(Emax, ΔF/F, 표 4)는
    多重 比較에서 誤發見率(False Discovery Rate)을 補整한
    Brown-Forsythe and Welch ANOVA (no equal SDs)를 使用하여 分析했다 (Benjamini, Krieger 및 Yekutieli의 two-step-up method).
  • 統計는 Windows용 GraphPad Prism 9.3.0 (GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 샌디에이고, https://www.graphpad.com) 을 使用하여 遂行했다.

 

 

 

2.9. Molecular modeling and in silico calculations.

 

  • 化合物 1~8의 構造는 
    Maestro (Schrödinger Release 2023-2: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2023)에서
    제공하는 2D Sketcher와 BUILD 툴을 使用하여 수동으로 構築했다.
  • pH 7 ± 1에서의 3D 構造와 陽性子化 狀態(protonation state)는
    LigPrep (Schrödinger Release 2023-2: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2023)을
    使用하여 生成했다.
  • TAS2R46 (PDB ID: 7XP6)의 受容體 構造는
    Prime (Schrödinger Release 2023-2: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2023)을
    使用하여 TAS2R43의 構造를 모델링하는 템플릿으로 使用되었다.
  • TAS2R43과 모델링된 領域의 템플릿 間의 序列 同一性(sequence identity)은 88%이다.
  • 以前 硏究에 따라, ECL2 없이 構造를 選定하였고, TAS2R43은 ECL2 없이 모델링되었다 (Ziegler et al., 2023).
  • 모든 리간드의 도킹 시뮬레이션은 TAS2R46의 CryoEM 構造와 生成된 TAS2R43 모델을 기반으로 遂行되었다. 

Maestro (Schrödinger Release 2023-2: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2023) 2D Sketcher, BUILD, LigPrep https://www.schrodinger.com/

 

 

  • 受容體 結合 部位는 實驗 構造 PDB ID: 7XP6에 의해 주어진 리간드 SY9의 중심 내에서
    "Receptor Grid Generation" 툴을 使用하여 준비되었다.
  • 도킹 硏究에는 Glide Standard Precision (Schrödinger Release 2023-2: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2023)을 使用했다.
  • 리간드당 20개의 포즈가 貯藏되었다.
  • Glide 點數가 가장 낮은 化合物 5, 6, 8의 도킹 포즈는 Prime (Schrödinger Release 2023-2: Prime, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2023)을 이용한 ligand-receptor refinement의 입력으로 使用되었다.
  • TAS2R43 및 TAS2R46 內 化合物 5, 6, 8의 2D 및 3D 표현은 Maestro (Schrödinger Release 2023-2: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2023)를 使用하여 생성되었다.
  • TAS2R43 모델과 1, 2, 3, 4, 7의 도킹 포즈, 그리고 5, 6, 8의 精製된 포즈는
    https://github.com/dipizio/TAS2R-models에서 確認할 수 있다.

 

 3. Results & discussion

 

3.1. Bitter receptor screening of the mixture of mozambioside roasting products

 

  • 쓴맛을 내는 아라비카 커피 化合物인 mozambioside (11-O-β-D-glucosyl-cafestol-2-on, 1)의 濃度는 커피 로스팅 중 초기 ~1 μmol/g에서 ~0.2 μmol/g로 減少하여 새로운 生成物을 生成할 可能性이 있다 (Lang et al., 2015).
  • 진짜 커피 로스팅과 유사한 모델 條件에서 모잠비오사이드를 熱分解하면 構造的으로 關聯된 여러 가지 새로운 分解 生成物이 生成된다.
  • 이러한 새로운 化合物이 쓴맛 受容體도 活性化하는지 알아보기 위해 HEK 293T-Gα16gust44 세포에서 발현되는 26가지 다른 人間 TAS2R을 使用하여 分解 生成物 混合物을 機能性 쓴맛 受容體 스크리닝에 適用했다 (Meyerhof et al., 2010; Lang et al., 2023).
  • 스크리닝 결과 대부분의 TAS2R에서 反應이 나타나지 않는 것으로 나타났다 (Supporting Fig. 1). 
  • 그러나 두 개의 모잠비오사이드 反應 受容體인 TAS2R43과 TAS2R46 (Lang et al., 2020)은 化合物 混合物에 의해 상당한 活性化를 보였다(Fig. 1A, Table 1).

 

 

  • 모잠비오사이드 로스팅 産物들의 混合物 濃度를 增加시키면서 
    TAS2R43 및 TAS2R46을 發現하는 HEK 293T-Gα16gust44 細胞의 用量-反應 關係를 測定한 결과, 
    두 反應性 受容體 간에 상당한 敏感度 差異가 있는 것으로 나타났다.
  • TAS2R43은 3 μM (초기 로스팅 시 모잠비오사이드 濃度 기준)의 識閾値 濃度를 보인 반면,
    TAS2R46을 發現하는 細胞는 대조군에 비해 統計的으로 有意味한 活性化에 到達하기 위해 300 μM이 必要했다 (Student’s t-test, P < 0.05, Table 1). 
  • 이러한 濃度를 볶지 않은 모잠비오사이드(1)에 대해 以前에 發表된 데이터와 비교했을 때, 볶은 1은 TAS2R43에서 10배 더 강력했고 (3μM 對 30μM [Lang et al., 2020]) TAS2R46에서도 비슷한 강력함을 보였다 (300μM).
  • TAS2R43의 EC50 濃度는 26.6 ± 13.1 μM인 반면, 
    1은 50.6 ± 13.8 μM을 나타냈다 (Table 1, Student’s t-test, P = 0.09). 
  • 1을 가지고 얻은 이전 結果와 유사하게, TAS2R46 發現 細胞는 信號 포화를 나타내지 않았으므로 EC50 濃度를 계산할 수 없었다.
  • 受容體 데이터는 1의 熱分解가 TAS2R43 活性化에 대한 活性化 識閾 側面에서 效能을 有意味하게 增加시켰음을 보여준다 (Table 1, P < 0.05).
  • 이러한 觀察은 새롭고 더욱 강력한 化合物의 生成을 示唆한다.

  • 이러한 初期 實驗 結果는 로스팅 프로세스가 모잠비오사이드(1)를 더욱 강력한 쓴맛 受容體 活性化 産物들로 전환시켰음을 示唆한다.
  • 構造를 규명하고 쓴맛 活性化 特性을 分析하기 위해, 1번 物質을 分取 規模로 熱分解하였다. 
  • 個別 로스팅 産物들을 分離하여 UHPLC-ToF-MS 및 NMR spectroscopy를 통해 構造를 규명하고, TAS2R43과 TAS2R46에서의 쓴맛 受容體 活性化 特性을 分析하였다.

 

3.2. Model roasting of isolated mozambioside to generate degradation products

 

  • 모잠비오사이드(1)를 220℃에서 4.5분간 로스팅하여 分解産物들을 生成했다.
  • UHPLC-PDA 分析 結果(281 nm)의 피크 面積을 기준으로, 1의 약 70%가 分解産物들로 轉換되었다.
  • 이 分解産物은 PFP material (2.3)에서 preparative HPLC로 分離한 후, C18 (2.4, Fig. 1B 참조)에서 半分取 精製(semi-preparative purification)를 遂行했다.
  • 純粹 分離物들은 構造 糾明을 위해
    UHPLC-PDA(2.2), NMR spectroscopy (2.6), UHPLC-ToF-MS(2.7)로 分析했다.
  • 1의 각 데이터와 分離物들의 데이터를 비교하여 새로운 構造 2~6을 ​​確認했다. 
  • 3.3-3.6절(아래 참조)에 자세히 說明된 바와 같이, 5개의 새로운 化合物이 確認되었다. 즉,
    ■ 17-O-β-D-glucosyl-11-hydroxycafestol-2-on (2),
    ■ 11-O-β-D-glucosyl-16-desoxycafestol-2-on (3),
    ■ 11-O-β-D-glucosyl-(S)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on (4),
    ■ 11-O-β-D-glucosyl-15,16-dehydrocafestol-2-on (5), and
    ■ 11-O-β-D-glucosyl-(R)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on (6)이다.
  • 또한, 알려진 로스팅 産物인 벵갈렌솔(bengalensol)(7, Hasan et al., 1994; Lang et al., 2020)을 동정하고 精製하였다(3.7).
  • 더 나아가, 化合物 1-6의 아글리콘(11-hydroxycafestol-2-on)은 化合物 2의 酵素的 切斷(enzymatic cleavage)을 통해 얻어졌으며(3.8), 쓴맛 受容體 活性化 與否를 確認하였다.

  • Fig. 1의 C는 母化合物 모잠비오사이드(1)에 대한 2D NMR 스펙트럼(HSQC)의 유의미한 相關關係와 變化를 보여주며, 이를 통해 로스팅 産物들의 構造를 명확하게 確認할 수 있었다.
  • NMR 데이터는 1의 熱分解가 수산화된 5원자 고리(hydroxylated five-membered ring) C13-C16의 脫水 過程(dehydration processes)을 주로 開始함을 보여주었다.
  • 3.3-3.6절(아래 참조)에 자세히 설명된 바와 같이, 5개의 새로운 化合物 2-6이 確認되었다.
  • 탄소 C16에서 물 분자 하나가 損失되면서 양적으로 우세한 다음의 세 가지 새로운 化合物들을 生成하였다.
    ■ 11-O-β-D-glucosyl-(S)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on (4),
    ■ 11-O-β-D-glucosyl-15,16-dehydrocafestol-2-on (5), and
    ■ 11-O-β-D-glucosyl-(R)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on (6). 
  • 17-O-β-D-glucosyl-11-hydroxycafestol-2-on (2)이 微量 生成物로 分離되었으며, 글루코실 部分(glucosyl moiety)이 C11에서 C17로 分子 內 移動(intramolecular migration)에 의해 形成된 것으로 推定된다.
  • 11-O-β-D-glucosyl-16-desoxycafestol-2-on (3)이 두 번째 副生成物인데, C16의 3차 水酸基(tertiary hydroxyl)가 제거되었다.
  • 葡萄糖의 완전한 損失과 물의 除去를 동반한 分子 內 에테르化 反應으로 벵갈렌솔(bengalensol)로도 알려진 化合物 7이 生成되었으며, 이는 Hasan et al.(1994)에 의해 처음 보고되었다.
  • 새로운 構造들은 Fig. 1D에 提示되어 있다

 

 

 

3.3. Structure elucidation of 17-O-β-D-glucosyl-11-hydroxycafestol-2-on (2)

 

  • 로스팅 生成物 2는 UHPLC-PDA에서 10.2분 후 溶出되었으며, UV 최대값은 219nm와 281nm였다.
  • UHPLC-ToF-MS 分析에서 ESI+ 모드의 前驅體 이온은 m/z 531.2204였으며, 豫測된 合 化學式은 C26H36O10Na ([M+Na]+)였다.
  • m/z 329.1757의 자이온(daughter ion)(C20H24O4, [M-hexose-H2O + H]+, Δ-2.5 ppm)은 온전한 헥소스 부분(–C6H12O6, 180 Da)의 切斷을 나타냈다.
  • NMR은 총 6개의 4차 탄소(C2, C3, C4, C8, C10, C16), 11개의 CH基(C5, C9, C11, C13, C18, C19, C1′, C2′, C3′, C4′, C5′), 8개의 CH2基(C1, C6, C7, C12, C14, C15, C17, C6′), 그리고 1개의 CH3基(C20)를 나타냈다.
  • 2의 NMR 스펙트럼과 educt 1의 NMR 스펙트럼을 비교했을 때, CH-11과 CH2-17 이동을 제외하고는 信號와 相關關係가 중첩되는 樣相을 보였으며, 이 두 移動은 서로 바뀌었다.
  • 로스팅 生成物 2에서 CH-11과 CH2-17 信號는 각각 64.8ppm과 74.0ppm에서 공명하는 반면, 化合物 1에서는 CH-11과 CH2-17 信號가 각각 74.4ppm과 67.6ppm에서 공명했다.
  • 이러한 觀察 結果는 헥소스가 化合物 1의 C11에 있는 하이드록실基에서 化合物 2의 C17로 分子 內 移動했음을 示唆한다.
  • 이러한 假定은 HMBC 스펙트럼에서 確認되었는데,
    4.36ppm(d, J = 7.9Hz)의 글리코시드 陽性子 H-1'이 탄소 C17(74.0ppm)과 相關關係를 보였다 (Fig. 12-15 참조).
  • 따라서 로스팅 生成物 2는 17-O-β-D-glucosyl-11-hydroxycafestol-2-on (Fig. 1D의 2)으로 確認되었다.
  • 13C와 1H NMR 데이터는 Table 2와 Table 3에 정리되어 있다. 

 

3.4. Structure elucidation of 11-O-β-D-glucosyl-16-desoxycafestol-2-on (3)

 

  • 로스팅 産物 3은 UHPLC-PDA 分析에서 12.8분 후 溶出되었으며, 1과 유사하게 221nm와 280nm에서 UV 최대값을 나타내어 發色團의 變化가 없음을 示唆한다.
  • UHPLC-ToF-MS(ESI+)에서 유사 분자 이온의 m/z 값은 493.2461([M+H]+)로,
    이는 sum formula C26H36O9(Δ+5.9 ppm)에 해당하며, 이는 酸素 1개의 손실을 나타낸다.
  • m/z 값이 313.1822인 daughter ion (C20H24O3, [M-hexose-H2O + H]+)은 온전한 헥소스(-C6H12O6, -180 Da)의 切斷을 보였으며, 이는 아글리콘 內의 構造的 變化를 나타낸다.
  • 따라서 우리는 3을 1의 脫酸素化 産物이라고 假定했다.
  • NMR 스펙트럼은 로스팅 産物 3의 信號가 몇 가지 例外를 除外하고 1과 거의 중첩됨을 보여주었다.
  • 1과 비교했을 때, 6개가 아닌 5개의 4차 炭素(quaternary carbons)와 1개의 추가 CH2 基만 檢出되었는데, 이는 4차 炭素 하나가 메틴基으로 환원되었음을 나타낸다. 
  • 실제로 1의 83.5ppm에서 hydroxylated carbon C16 信號는 3의 2.16ppm에서 공명하는 陽性子를 가진 37.3ppm의 새로운 信號로 대체되었다.
  • HMBC 스펙트럼에서 이 새로운 CH 信號는 C11, C13, C17과 相關關係를 보였으며, 이는 脫酸素化된 C16이 새로운 CH 信號를 유발했음을 確認시켜 준다. 
  • 나머지 11개의 CH基(C5, C9, C11, C13, C18, C19, C1′, C2′, C3′, C4′, C5′), 8개의 CH2基(C1, C6, C7, C1′, C12, C14, C15, C17, C6′), 그리고 1개의 메틸기(C20)는 1의 CH2基와 유사하여 추가적인 構造的 變化가 없음을 確認했다 (Fig 16-19 참조).
  • 요약하면, 로스팅 産物 3은 C16의 하이드록실基가 脫酸素化되면서 形成되어
    11-O-β-D-glucosyl-16-desoxycafestol-2-on (Fig. 1D의 3)을 生成했다.
  • 13C와 1H 데이터는 Table 2와 Table 3에 정리되어 있다.   

 

3.5. Structure elucidation of 
       11-O-β-D-glucosyl-(S)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on (4) and 
       11-O-β-D-glucosyl-(R)-16-desoxy-17-oxocafestol-2-on (6)

 

  • 로스팅 産物 4와 6은 UHPLC-PDA 分析에서, 각각 13.3분과 13.7분 후에 溶出되었다.
  • UV 스펙트럼은 각각 219nm와 280nm(4) 및 196nm와 280nm(6)에서 최대값을 보였다.
  • UHPLC-ToF-MS(ESI+)에서 유사 분자 이온의 m/z는 491.2311(4, [M+H])+ 및 491.2303(6, [M+H]+)이었으며,  각각은 sum formula C26H34O9 (4: Δ + 7.2 ppm, 6: Δ + 5.6 ppm)에 해당한다.
  • 계산된 sum formula는 유리체(educt) 1에 비해 물 分子 1개(-18 Da)의 損失을 나타냈다.
  • 4와 6의 生成 이온은
    m/z 311.1658(4, C20H22O3, [M-hexose-H2O + H]+, Δ + 5.2 ppm)과
    m/z 311.1654(6, C20H22O3, [M-hexose-H2O + H]+, Δ + 3.9 ppm)로 유사했다.
  • 두 로스팅 産物들 모두에서, 자이온(daughter ions)은 온전한 헥소스의 切斷(cleavage)을 나타냈다.
  • 따라서 아글리콘에서 물 分子 1개가 損失되었을 것으로 예상했다.
  • NMR에서 4와 6의 信號는 거의 포개 놓을 수 있었다. 
  • 두 스펙트럼 모두 1의 기준 信號와 약간 달랐지만, 세 가지 중요한 예외가 있었다.
  • 가장 두드러진 것은 두 로스팅 産物 모두에서 수산화된 4次 炭素 C16 信號가 CH2基로 대체되었다는 것이다
    (4: 52.4ppm/3.17ppm, 6: 51.6ppm/2.68ppm).
  • 또한, 4와 6 모두에서 새로운 카르보닐(알데히드)基 信號가 각각 204.4ppm/9.59ppm(4)과 207.4ppm/9.80ppm(6)에 나타났다.
  • 4에서 알데히드 양성자 H17은 이중선(J = 1.1Hz)인 반면, 6에서는 단일선으로 나타났다.
  • 4번과 6번에서는 CH2-17 信號가 사라졌기 때문에 새로운 카르보닐이 수산화된 메틸렌 C17을 대체했다.
  • 마지막으로, 두 로스팅 産物 모두에서 메틸렌 C15는 1번에서 약 52ppm에서 각각 39.0ppm(4)과 39.4ppm(6)으로 상향 이동했다.
  • 4와 6 모두 5개의 4차 炭素(C2, C3, C4, C8, C10), 13개의 CH基(C5, C9, C11, C13, C16, C17, C18, C19, C1′, C2′, C3′, C4′, C5′), 7개의 CH2基(C1, C6, C7, C12, C14, C15, C6′), 그리고 1개의 CH3基(C20)가 스펙트럼에 나타났으며, 언급된 偏差를 제외하면 1의 경우와 유사했다(Fig. 1C, D 및 Supporting Figs. 20-24 and 29-33 참조).
  • Retention time의 차이, 아글리콘에서 水分 損失을 나타내는 MS의 類似性, NMR에서 나타나는 알데히드 信號 등을 고려할 때, 우리는 두 가지 로스팅 産物인 4와 6이 hydroxylated carbon C16에서 水分이 除去되어 에놀(enol)이 生成되고, 이어서 (R)- 및 (S)-aldehydes 4와 6으로 호변이성질화(tautomerized)되는 것으로 예상했다 (Supporting Fig. 4).
  • C16에 새로운 키랄 중심(chiral center)이 形成되었으므로, 로스팅 産物 4와 6에 대해 ROESY 실험을 遂行했다.
    입체화학(stereochemistry) 分析을 위해 키랄 炭素(chiral carbons) C16과 C11, 그리고 알데히드基 C17에 초점을 맞추었다.
  • 로스팅 産物 4의 경우, ROESY는 H11과 H16 또는 H17 사이에 相關關係를 보이지 않았지만, H16과 H17의 명확한 相關關係 信號가 나타났다 (Supporting Fig. 24).
  • H16과 H15 사이에도 또 다른 뛰어난 相關關係가 발견되었다.
  • H11과 H20 또는 H5와 H9 사이의 다른 주요 相關關係와 H11과 H5 또는 H9 사이의 누락된 相關關係를 고려하여, Supporting Fig. 42-B에 나타낸 바와 같이 4의 공간 배열을 (S)-isomer로 分解했다.

  • 6에서는, CH-5, CH-9, CH-11, CH3-20과의 臨界 相關關係(critical correlations)는 4와 일치했지만, H16과 H12, H13과의 相關關係는 달랐다 (Supporting Fig. 33).
  • 알데히드基 CHO-17을 고려할 때, 4와의 차이는 H12와의 相關關係 信號였으며, 이는 Supporting Fig. 42C에서 볼 수 있듯이 C16에서 (R)- 배열을 나타낸다.
  • 4와 6의 構造는 Fig. 1D에 나와 있다. 
  • 13C 및 1H NMR 데이터는 Table 2와 Table 3에 정리되어 있다.

 

3.6. Structure elucidation of 11-O-β-D-glucosyl-15,16-dehydrocafestol-2-on (5)

 

  • UHPLC-PDA 分析에서, 로스팅 産物 5는 13.5분 후에 溶出되었으며, 219nm와 280nm에서 최대값을 보이는 1과 동일한 UV 스펙트럼을 나타내어 發色團(chromophore)에 變化가 없음을 示唆했다.
  • UHPLC-ToF-MS(ESI+)에서 유사 분자 이온의 m/z 값은 491.2250([M+H]+)이었다.
  • 이 관찰 결과는 合 化學式 C26H34O9 (Δ-5.2 ppm)을 示唆하며, 遊離體(educt) 1에 비해 물 分子 1개(-18 Da)가 損失되었음을 나타낸다.
  • m/z 311.1630 (C20H22O3, [M-hexose-H2O + H]+, Δ-3.8 ppm)의 뚜렷한 子이온이 단편 스펙트럼에 나타났으며, 이는 아글리콘에서 온전한 헥소스 분자(-C6H12O6, 180 Da)가 切斷되었음을 確認시켜 주었다.
  • NMR은 6개의 4차 炭素(C2, C3, C4, C8, C10, C16), 12개의 CH2基(C5, C9, C11, C13, C15, C18, C19, C1′, C2′, C3′, C4′, C5′), 7개의 CH2基(C1, C6, C7, C12, C14, C17, C6′), 그리고 1개의 메틸基(C20)의 信號를 보였다.
  • 5의 NMR 데이터는 遊離體(educt) 1의 데이터와 거의 포개어질 수 있지만, 5에서는 CH2-15 信號가 사라지고 새로운 CH2基가 나타났다 (5.36 ppm/136.2 ppm).
  • 그 ToF-MS 데이터는 아글리콘에서 물 分子 하나가 損失되었음을 示唆했고, C17의 hydroxylated methylene (61.7 ppm)은 온전했기 때문에(로스팅 産物 4와 6 참조), 물 제거 시 이중 결합이 形成될 것으로 예상했다.
  • 눈에 띄는 새로운 CH基는 1H 스펙트럼에서 5.36 ppm, 13C 스펙트럼에서 136.2 ppm에서 이중선(J = 0.9 Hz)으로 공명했으며, 이는 C15에서 새롭게 形成된 CH基에 해당한다.
  • 또한, 4차 炭素 C16의 信號는 1초 동안 83.5 ppm에서 낮은 磁氣場으로 150.2 ppm으로 이동했는데, 이는 4차 二重 結合 炭素임을 示唆한다.
  • 이는 C15와 C16 炭素 사이의 물 제거와 二重 結合 形成에 대한 명확한 단서였다(Fig. 5 참조).
  • HMBC 스펙트럼에서 陽性子 H15와 炭素 C7 및 C9 사이의 相關關係를 통해,
    構造가 11-O-β-D-glucosyl-15,16-dehydrocafestol-2-on임을 確認했다 (Fig. 1D의 5, Supporting Figs. 25-28 참조).
  • 13C 및 1H NMR 데이터는 Table 2와 Table 3에 정리되어 있다.

 

3.7. Identification of bengalensol (7)

 

  • UHPLC-PDA 分析에서, 로스팅 産物 7은 14.4분 후 溶出되었으며, 
    211nm와 220nm에서 최대값을 갖는 UV 스펙트럼 1과 유사한 값을 나타내어 동일한 發色團 構造 (chromophore structures)를 나타냈다. 
  • UHPLC-ToF-MS(ESI+)에서 7은 m/z 329.1759([M+H]+)의 유사 分子 이온을 나타냈으며,
    이는 合 化學式 C20H24O4(Δ + 3.5 ppm)과 일치했다.
  • 따라서 이 分子는 11-hydroxycafestol-2-on의 脫水 派生體일 것으로 예상되었다.
  • 이러한 假定은 NMR 데이터를 통해 確認되었으며, 이는
    디테르페노이드 벵갈렌솔(diterpenoid bengalensol)(Fig. 1, D의 7)에 대해 이전에 보고된 데이터(Hasan et al., 1994; Lang et al., 2020)와 일치했다.
  • 13C 및 1H NMR 데이터는 Table 2와 Table 3에 정리되어 있다.

 

3.8. Generation of 11-hydroxycafestol-2-on (8) for structure–activity relationships

 

  • 配糖體(glycoside) 1은 酸이나 加水分解 酵素 處理로 切斷될 수 없다 (Richter & Spiteller, 1979).
  • 그러나 分離된 로스팅 産物 2 (17-O-β-D-glucosyl-cafestol-2-on)는
    헬릭스 포마티아(Helix pomatia)의 β-glucuronidase(β-글루쿠로니다아제)에 의한 酵素 切斷에 敏感하여
    아글리콘 11-hydroxycafestol-2-on (8)을 生成했다.
  • 이 化合物은 UHPLC-PDA 分析에서 10.4분에 溶出되었으며, 220nm와 281nm에서 UV 최대값을 나타내 發色團에 變化가 없음을 나타낸다.
  • UHPLC-ToF-MS 分析(ESI+) 결과, m/z 347.1889([M+H]+)의 유사 분자 이온이 관찰되었으며,
    예측된 合 化學式은 C20H26O5(Δ-3.5 ppm)였다.
  • 6개의 4차 炭素(C2, C3, C4, C8, C10, C16)의 總 信號에서 6개의 CH基(C5, C9, C11, C13, C18, C19), 7개의 CH2基(C1, C6, C7, C12, C14, C15, C17), 그리고 1개의 메틸렌基(C20)가 檢出되었다.
  • 이러한 信號의 移動들은 化合物 1의 아글리콘의 移動과 잘 일치하여 명확하게 分類되었다.
  • 化合物 8은 모델 로스팅 實驗에서 분리 가능한 양으로 생성되지 않았지만, 構造-受容體-活性 硏究를 위해 酵素的으로 製造되었다.
  • 構造는 Fig. 1D에 提示되어 있다. 
  • 13C 및 1H NMR 데이터는 Table 2와 Table 3에 정리되어 있다.

 

3.9. Detection of mozambioside and its roasting products in roasted Arabica coffee

 

  • 純粹 모잠비오사이드의 모델 로스팅 결과, 새로운 化合物들 2~6과 벵갈렌솔(7)이 生成되었다.
  • 로스팅된 커피 브루의 진짜 샘플에서 이러한 化合物의 生成을 調査했다.
  • 분취량을 稀釋하여 UHPLC-ToF-MS 시스템에 注入했다.
  • 그 분리물의 溶液이 retention times와 정확한 質量 데이터를 比較하기 위한
    레퍼런스 標準으로 使用되었다 (Fig. 2, A).
  • 로스팅된 커피 브루에서 1, 2, 4~7을 識別했다.
  • 모잠비오사이드(Fig. 2, B)는 풍부한 protonated molecular ions ([M+H]+)을 形成하는 반면,
    등중원소 파생물(isobaric derivative) 2는 나트륨화된 종(sodiated species)([M+Na]+, Fig. 2, C)만을 形成했다.
  • 로스팅 生成物 3과 아글리콘 11-hydoxycafestol-2-on (8)은 발견되지 않았다.
  • 로스팅 産物들 4~6은 풍부했지만, 선택된 條件에서 기준선 분리는 이루어지지 않았다 (Fig. 2, D).
  • 마지막으로, 벵갈렌솔(7)이 커피 브루에서 發見되었으며, 15.3분 후반에 溶出되었다 (Fig. 2, E).
  • 진짜 커피 샘플에 이러한 쓴맛 受容體 活性劑가 존재한다는 것은
    맛 프로파일에 寄與할 可能性을 示唆한다.
  • 그러나 이 가설을 명확히 하기 위해서는 정량적 데이터가 필요하다.

 

 

 

3.10. Characterization of bitter taste receptor activation

 

  • 모잠비오사이드(1)의 熱處理로 形成된 새로운 構造들 2~6과 그리고 그들의 아글리콘 11-hydroxycafestol-2-on (8)에 대해 그들의 쓴맛을 매개하는 맛 受容體를 識別하기 위한 機能 硏究가 遂行되었다.
  • 볶은 모잠비오사이드 混合物이, 그 前驅體인 모잠비오사이드(1)와 같이, 두 受容體인 TAS2R43과 TAS2R46의 反應을 誘導했고, 受容體 TAS2R43에서 受容體 活性化 識閾値의 측면에서 效能(potency)이 유의미하게 增加함을 確認한 후(P < 0.05, Table 1), 그 個別的인 精製된 産物들의 活性化 特性을 調査했다.
  • 로스팅 産物들 2~6과 11-hydroxycafestol-2-on (8)에 대해 각각 0.3~300 μM 濃度 範圍에서 TAS2R43과 TAS2R46의 活性化를 調査했다 (Fig. 3). 
  • 로스팅 産物 3은 熱分解 過程에서 收率이 매우 낮았기 때문에 0.3~30 μM 濃度에서만 調査했다 (Fig. 1B).

 

 

  • Fig. 3에서 볼 수 있듯이, 로스팅 産物들 2~6과 아글리콘 8은 機能的 受容體 分析(functional receptor assays)에서 廣範圍한 活性을 나타냈다.
  • 2는 TAS2R46에 대해서만 소량의 活性化를 보였다.
  • 대조군 실험과 비교했을 때, 로스팅 産物 3은 TAS2R43과 TAS2R46에 대한 反應을 誘導하지 않았다.
  • 그러나 나머지 네 가지 化合物인 4~6과 8은 異質的인 活性化 프로파일을 보였다 (cf. Table 2).
  • 2와 4는 TAS2R43보다 TAS2R46에 대한 活性化 閾値가 낮은 유일한 로스팅 産物들이었다.
  • 4의 效能은 受容體 間에 유사했다.
  • 이와 대조적으로, 5, 6, 8은 TAS2R46보다 TAS2R43에 대해 유의미하게 더 강력했다.
  • 두 쓴맛 受容體 間에 가장 두드러진 차이는 化合物 6에서 나타났으며, TAS2R43의 敏感度는 TAS2R46보다 10배 더 높았다.
  • 그 物質들의 效能은 서로 달랐으며, 活性化된 受容體에 따라서도 차이를 보였다.
  • 化合物 6은 信號 振幅이 가장 크게 增加했으며, TAS2R43에서 TAS2R46보다 약 4배 높은 效能을 보였다 (Table 2).
    적용된 物質 濃度가 信號 飽和에 도달하지 않았기 때문에 EC50 濃度는 계산하지 않았다.
  • 로스팅 産物 4는 前驅體 1과 비교했을 때, TAS2R46에 대한 作用劑(agonist)로서 더 우수했고,
    5와 6은 TAS2R43에 대한 더 나은 活性劑였다.
  • TAS2R43의 個別 識閾 濃度(각각 30 및 10 μM, Table 2)는 로스팅 混合物(3 μM, Table 1)보다 높았다.
  • 識閾 濃度가 3 μM으로 보고된(Lang et al., 2020) 미량 물질인 벵갈렌솔(7)이 混合物의 우수한 效能에 크게 기여했을 가능성이 있다.
  • 로스팅 産物 混合物의 效能 增加에 대한 다른 추측 가능성으로는 混合物 내 아직 確認되지 않은 高效能 活性劑의 존재 또는 確認된 化合物의 相乘效果 등이 있다.
  • 그러나 쓴맛 化合物의 相乘效果(Synergism)는 아직 보고되지 않았다.
  • 로스팅 産物 混合物을 시험했을 때, TAS2R46 活性化 識閾 濃度는 300 μM이었다 (Table 1).
  • 2와 3의 더 낮은 效能은 로스팅 産物들 4~6 및 7의 效能보다 더 강한 것으로 나타났으며, 결과적으로 이 쓴맛 受容體의 活性化 閾値에는 관찰 가능한 變化가 없었다 (Table  2).
  • Fig. 1B에서 피크 面積 기준으로 볼 때 상대 濃度는 낮지만, 混合物에 존재하는 化合物 2와 3은 TAS2R46에 결합할 가능성이 있지만 뚜렷한 活性化를 유도하지는 못했다.
  • 이러한 競爭的 效果는 TAS2R43 發現 細胞에 강력한 作用劑인 모잠비오사이드와 部分 作用劑인 카웨올을 병용 투여하는 동안, 이전에 관찰되었다 (Lang et al., 2020).

 

3.11 Investigation of putative binding modes

 

  • 機能 分析(functional assays) 結果, 
    5, 6, 8이 TAS2R43에 대해 가장 강력한 化合物들이었지만, 
    TAS2R46도 活性化시키는 것으로 나타났다.
  • 따라서 도킹 ​​시뮬레이션을 使用하여 TAS2R43 및 TAS2R46 構造 모델의 오르토스테릭 結合 部位(orthosteric binding sites) 내에서 이들 化合物의 結合 方式을 조사했다.

  • TAS2R46의 構造는 최근 밝혀졌다 (Xu et al., 2022).
  • 쓴맛 受容體는 G protein-coupled receptors (GPCR) 上科(superfamily)에 속한다.
  • 쓴맛 受容體는
    細胞 내 카르복실 꼬리(carboxyl tail)와
    細胞 外 아미노 末端(extracellular amino terminus)을 가진
    7개의 膜貫通(transmembrane)™ α-螺線을 포함하여 클래스 A GPCR과 유사한 構造를 가지고 있다.
  • TM 螺線(helices)은
    3개의 細胞內 루프(intracellular loops)(ICL1, ICL2, ICL3)와
    3개의 細胞外 루프(extracellular loops)(ECL1, ECL2, ECL3)로 戀結되어 있다(TAS2R46의 3D 표현은 Supporting Fig. 43 참조).
  • 이 構造를 템플릿으로 使用하여 TAS2R43의 受容體 構造를 모델링했다.
  • 스트리크닌(strychnine)과 複合體를 이루는 TAS2R46 (PDB ID: 7XP6)의 構造는 細胞外 루프 2 (ECL2)를 제외하고 해석되었다.
  • 非活性 受容體 모델(inactive receptor model)(PDB ID: 7XP5)에서만 ECL2가 解釋되었지만, 이 構造에서는 루프가 오르토스테릭 結合 部位 내 潛在的 리간드의 位置와 겹치게 된다.
  • 이전 연구에서 지적했듯이, ECL2의 柔軟性과 모델링 不確實性이 높은 경우, ECL2를 使用하지 않는 GPCR에 대한 分子 도킹 시뮬레이션이 더 나은 성능을 보일 수 있다 (de Graaf et al., 2008; Born et al., 2013; Jaiteh et al., 2020).
  • 따라서 本 硏究에서는 ECL2를 使用하지 않는 모델을 使用했다.

 

 

Fig. 4. TAS2R43 및  TAS2R46에서의 化合物들 5, 6, 8의 豫測 結合 모드.
(A) 8/TAS2R43: 化合物 8과 相互作用하는 잔기는 빨간색 볼과 막대기로 표시되고, 受容體는 회색 밑그림으로 표시되며, 水素 結合은 점선으로 표시된다. 
(B) 8/TAS2R46: 化合物 8과 相互作用하는 잔기는 빨간색 볼과 막대기로 표시되고, 受容體는 연한 녹색 카툰으로 표시되며, 水素 結合은 점선으로 표시된다.
(C) 5 and 6/TAS2R43: 化合物 5와 6과 相互作用하는 잔기는 베이지색과 청록색 볼과 막대기로 표시되고, 葡萄糖 부분은 분홍색으로 강조 표시된다. 受容體는 회색 카툰으로 표시되며, 水素 結合은 점선으로 표시된다. 
(D) 5 and 6/TAS2R46: 化合物 5와 6과 相互作用하는 잔기는 베이지색과 청록색 볼과 막대기로 표시된다. 葡萄糖 부분은 분홍색으로 강조 표시되어 있으며, 受容體는 연한 카툰으로 표시되어 있다. 水素 結合은 점선으로 표시되어 있다. (이 그림의 색상 참조에 대한 해석은 본 논문의 웹 버전을 참조.)

 

  • 모잠비오사이드의 構造的으로 연관된 일련의 로스팅 産物들의 핵심 아글리콘 部分을 나타내는 化合物 8의 結合 方式을 特性化하는 데 중점을 두었다.
  • 그 결과, 두 受容體 모두에서 一貫된 結合 方式이 관찰되었다: 그 리간드는
    TAS2R43의 경우에는 TM5 (T180과 水素 結合)와
    TM7(R268과 水素 結合)에,
    TAS2R46의 경우에는 TM5 (T180과 水素 結合) 및 TM6 (S248)에 고정되어 있다(Fig. 4A 및 4B).
  • 化合物 8은 두 受容體 모두에서 동일한 指向性(orientation)을 보였으며, 아글리콘 부분의 하이드록시메틸基(hydroxymethyl group) C17-OH는 TM5 쪽으로, 헤테로고리 푸란基(heterocyclic furane group)는 TM3 쪽으로 향했다.
  • 化合物 8과 관련하여, 化合物 5는 C15에 二重 結合을 가지고 있는 반면, 化合物 6은 C17에 하이드록시메틸基 C17-OH 대신 알데히드를 가지고 있다.
  • 이러한 差異는 受容體와의 相互作用에 影響을 미치지 않았다.
  • 化合物 5와 6에 글루코실 部分(glucosyl moiety)을 첨가했을 때, 아글리콘 부분의 위치는 두 受容體 모두에서 유지되었지만, 글루코실 置換基는 서로 다른 하위 포켓에 受容되었다.
  • TAS2R43 내에서, 化合物 5와 6은 TM3, TM4, TM5 사이에 위치한 하위 포켓의 글루코오스 부분과 水素 結合을 形成하여 잔기 R81과 Y85, K156, N176의 極性 側鎖(polar side chains)에 도달했다.
  • 이러한 相互作用으로 인해 化合物이 8보다 더 높이 끌어올려졌고,
    化合物은 R268과의 水素 結合을 잃었지만(Fig. 4A) S248과는 相互作用했다 (Fig. 4C).
  • TAS2R46 (Fig 4D) 내에서 글루코실 部分(glucosyl moiety)은 受容體 코어의 subpocket을 가리키며, 
    이는 TM3의 W88 및 N92 잔기, TM7의 E265 잔기와의 水素 結合으로 安定化된다.
  • 또한, L58, N62 및 F269 잔기는 疏水性 subpocket을  形成하여 受容體 內 化合物의 位置를 ​​安定化한다.
  • Bengalensol (7)은 化合物 8과 유사한 結合 方式을 보인 반면,
    化合物들 1~4는 위에서 설명한 5와 6의 結合 자세를 變形할 수 없었다
    (모든 도킹 자세는 https://github.com/dipizio/TAS2R-models/tree/main/roasting-products에서 確認할 수 있다).

 

 4. Conclusions

 

  • 결론적으로, 커피 化合物 모잠비오사이드의 모델 熱分解로부터 
    5개의 새로운 化合物들 2~6과 
    알려진 벵갈렌솔(7)을 分離하였다.
  • 이들의 構造가 instrumental techniques를 통해 규명되었다.
  • 4개의 새로운 로스팅 産物들 2와 4-6, 그리고 이들의 아글리콘 8은
    인간의 쓴맛 受容體인 TAS2R43과 TAS3R46을 活性化시켰다.
  • 1과 生成된 새로운 化合物 2와 4~7은
    UHPLC-ToF-MS를 통해 로스팅된 커피에서 檢出되었고 명확하게 識別되었다.
  • 새로운 化合物들 5와 6은
    母化合物 1보다 10배 낮은 濃度에서도 쓴맛 受容體를 유의미하게 活性化시켰다.
  • 도킹 시뮬레이션 결과, skeleton 8은
    TAS2R43과 TAS2R46 結合 部位 모두에서 유사한 方向으로 結合할 수 있음이 밝혀졌다.
  • 그러나 結合 部位의 構成과 부피의 差異는 글루코실化된 派生體들의 위치에 影響을 미친다.

  • 이러한 새로운 化合物들은 커피 브루 內에서 필요한 濃度로 存在할 경우 커피 맛에 寄與할 수 있으며,
    經口 生體利用率(oral bioavailability)이 보장될 경우 經口 外 發現되는 TAS2R43 및 46과 相互作用할 수 있다.
  • 單一 物質의 熱分解로 生成되는 놀랍도록 복잡한 쓴맛 分子들는
    커피 브루 內에 存在하는 수많은 쓴맛 물질들과 그들의 쓴맛 受容體-活性化 特性의 극히 一部만을 보여줄 뿐이다.
  • 향후 實驗을 통해 쓴맛 受容體를 活性化할 수 있는 다양한 커피 成分들이 追加될 것이다.
  • 이러한 연구를 통해
    커피의 快樂的 價値(hedonic value)에 寄與하는 쓴맛 化合物의 構成에 대한 知識이
    지속적으로 增加할 것으로 예상되지만,
    진정한 課題는 個別 化合物들의 섭취 후 生理的 影響을 評價하는 것이다. 

 

 Appendix A. Supplementary material

본 연구의 Supplementary data (Supporting Information - Identification of mozambioside roasting products and their bitter taste receptor activation)는 at https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.138884 에서 온라인으로 찾아 볼 수 있다. 

 

 

 References

Batali, M. E., Lim, L. X., Liang, J., Yeager, S. E., Thompson, A. N., Han, J., Ristenpart, W. D., & Guinard, J.-X. (2022).
Sensory analysis of full immersion coffee: Cold brew is more floral, and less bitter, sour, and rubbery than hot brew.
Foods, 11 (16), Article 2440. https://doi.org/10.3390/foods11162440

Blumberg, S., Frank, O., & Hofmann, T. (2010).
Quantitative studies on the influence of the bean roasting parameters and hot water percolation on the concentrations of bitter compounds in coffee brew.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 3720–3728. https://doi.org/10.1021/jf9044606

Born, S., Levit, A., Niv, M. Y., Meyerhof, W., & Behrens, M. (2013).
The human bitter taste receptor TAS2R10 is tailored to accommodate numerous diverse ligands.
The Journal of Neuroscience, 33(1), 201–213. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3248-12.2013

Clarke, R. J., & Macrae, R. (Eds.) (1987). Coffee – Volume 2: Technology. Dordrecht: Springer. doi: 10.1007/978-94-009-3417-7.

Clifford, M. N. (1999).
Chlorogenic acids and other cinnamates – nature, occurrence and dietary burden.
Journal of the Science of Food and Agriculture, 79(3), 362–372.
https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0010(19990301)79:3<362::AIDJSFA256>3.0.CO;2-D

De Graaf, C., Foata, N., Engkvist, O., & Rognan, D. (2008).
Molecular modeling of the second extracellular loop of G-protein coupled receptors and its implication on structure-based virtual screening.
Proteins, 71, 599–620. https://doi.org/10.1002/prot.21724

Illy, A., & Viani, R. (Eds.) (2005). 
Espresso coffee – The science of quality (2nd ed.).Elsevier Academic Press, ISBN: 0-12-370371-9.

 

Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO (2024). https://www.fao.org/markets-and-trade/commodities/coffee/en/, accessed 26. January 2024.

Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO (24. March 2023).
Erntemenge der führenden Anbauländer von Kaffee weltweit in den Jahren 2020 und 2021 (in 1.000 Tonnen) [Graph].
In: Statista, accessed 29. January 2024,
https://de.statista.com/statistik/daten/studie/216872/umfrage/kaffeeproduktion-fuehrender-laender/.

FAO. (21. December 2023).
Exportmenge der führenden Exportländer von geröstetem Kaffee weltweit im Jahr 2022 (in Tonnen) [Graph].
In: Statista, accessed 29. January 2024,
https://de.statista.com/statistik/daten/studie/224989/umfrage/fuehrende-exportlaender-von-geroestetem-kaffee/. 

Farah, A., De Paulis, T., Trugo, L. C., & Martin, P. R. (2005).
Effect of roasting on the formation of chlorogenic acid lactones in coffee.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 1505–1513. https://doi.org/10.1021/jf048701t

Frank, O., Blumberg, S., Krümpel, G., & Hofmann, T. (2008).
Structure determination of 3-O-caffeoyl-epi-γ-quinide, an orphan bitter lactone in roasted coffee.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56, 9581–9585. https://doi.org/10.1021/jf802210a

Frank, O., Blumberg, S., Kunert, C., Zehentbauer, G., & Hofmann, T. (2007).
Structure determination and sensory analysis of bitter-tasting 4-vinylcatechol oligomers and their identification in roasted coffee by means of LC-MS/MS.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 1945–1954. https://doi.org/10.1021/jf0632280

Frank, O., Zehentbauer, G., & Hofmann, T. (2006).
Bioresponse-guided decomposition of roast coffee beverage and identification of key bitter taste compounds.
European Food Research and Technology, 222, 492–508. https://doi.org/10.1007/s00217-005-0143-6

 

Ginz, M., & Engelhardt, U. H. (2000).
Identification of proline-based diketopiperazines in roasted coffee.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 3528–3532. https://doi.org/10.1021/jf991256v

Ginz, M., & Engelhardt, U. H. (2001).
Identification of new diketopiperazines in roasted coffee.
European Food Research and Technology, 213, 8–11. https://doi.org/10.1007/s002170100322

Guillot, F. L., Malnoë, A., & Stadler, R. H. (1996).
Antioxidant properties of novel tetraoxygenated phenylindan isomers formed during thermal decomposition of caffeic acid.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, 2503–2510. https://doi.org/10.1021/jf9508155

Hasan, C. M., Huda, Q., Lavaud, C., Connolly, J. D., & Haque, M. E. (1994).
Bengalensol, a new 16-epicafestol derivative from the leaves of Coffea bengalensis.
Natural Product Letters, 5, 55–60. https://doi.org/10.1080/10575639408043935

Jaiteh, M., Rodriguez-Espigares, I., Selent, J., & Carlsson, J. (2020).
Performance of virtual screening against GPCR homology models: Impact of template selection and treatment of binding site plasticity.
PLoS Computational Biology, 16, Article e1007680. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007680

Lang, R., Klade, S., Beusch, A., Dunkel, A., & Hofmann, T. (2015).
Mozambioside is an arabica-specific bitter-tasting furokaurane glucoside in coffee beans.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63(48), 10492–10499. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.5b04847

Lang, T., Di Pizio, A., Risso, D., Drayna, D., & Behrens, M. (2023).
Activation profile of TAS2R2, the 26th human bitter taste receptor.
Molecular Nutrition & Food Research., Article 2200775. https://doi.org/10.1002/mnfr.202200775

 

Lang, T., Lang, R., Di Pizio, A., Mittermeier, V. K., Schlagbauer, V., Hofmann, T., & Behrens, M. (2020).
Numerous compounds orchestrate coffee’s bitterness.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 68(24), 6692–6700. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.0c01373

Meyerhof, W., Batram, C., Kuhn, C., Brockhoff, A., Chuboda, E., Bufe, B., Appendino, G., & Behrens, M. (2010).
The molecular receptive ranges of human TAS2R bitter taste receptors.
Chemical Senses, 35, 157–170. https://doi.org/10.1093/chemse/bjp09

Nehlig, A. (2018).
Interindividual differences in caffeine metabolism and factors driving caffeine consumption.
Pharmacological Reviews, 70, 384–411. https://doi.org/10.1124/pr.117.014407

Parliament, T. H. (2000). An overview on coffee roasting.
In: T. H. Parliament, C.-T. Ho, and P. Schieberle (Eds.), Caffeinated beverages – Health benefits, physiological effects, and chemistry. ACS Symposium Series, ISBN 0-8412-3654-2. 

Prewo, R., Guggisberg, A., Lorenzi-Riatsch, A., Baumann, T. W., & Wettstein-Bättig, M. (1990).
Crystal structure of mozambioside, a diterpene glycoside of coffea pseudozanguerbariae.
Phytochemistry, 3, 990–992. https://doi.org/10.1016/0031-9422(90)80065-O

Richter, H., & Spiteller, G. (1979). Über ein neues furokauranglycosid aus grünen kaffeebohnen.
Chemische Berichte, 112, 1088–1092. https://doi.org/10.1002/cber.19791120403

Šeremet, D., Fabecic, P., Vojvodic Cebin, A., Mandura Jaric, A., Pudicc, R., & Komes, D. (2022).
Antioxidant and sensory assessment of innovative coffee blends of reduced caffeine content.
Molecules, 27(2), 448. https://doi.org/10.3390/molecules27020448

 

Stark, T., & Hofmann, T. (2005). 
Structures, sensory activity, and dose/response functions of 2,5-diketopiperazines in roasted cocoa nibs (Theobroma cacao).
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(18), 7222–7231. https://doi.org/10.1021/jf051313m 

USDA Foreign Agricultural Service. (22. June, 2023).
Erntemenge von Kaffee weltweit in den Jahren 2011/12 bis 2023/24* (in 1.000 Säcken á 60 Kilogramm) [Graph].
In: Statista, accessed 29. January 2024,
https://de.statista.com/statistik/daten/studie/319733/umfrage/erntemenge-von-kaffee-weltweit/.

USDA Foreign Agricultural Service. (22. Juni, 2023).
Konsum von Kaffee in den wichtigsten Absatzmärkten weltweit in den Jahren 2021/2022 bis 2023/2024* (in 1.000 Säcken `a 60 Kilogramm) [Graph]. In Statista (accessed 07/19/2023) https://de.statista.com/statistik/daten/studie/216868/umfrage/kaffeeverbrauch-fuehrender-laender/.

Weiss, C., Rubach, M., Lang, R., Seebach, E., Blumberg, S., Frank, O., Hofmann, T., & Somoza, V. (2010).
Measurement of the intracellular pH in human stomach cells: A novel approach to evaluate the gastric acid secretory potential of coffee beverages.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58(3), 1976–1985. https://doi.org/10.1021/jf903614d

Xu, W., Wu, L., Liu, S., Liu, X., Cao, X., Zhou, C., Zhang, J., Fu, Y., Guo, Y., Wu, Y., Tan, Q., Wang, L., Liu, J., Jiang, L., Fan, Z., Pei, Y., Yu, J., Cheng, Y., Zhao, S., Hao, X., Liu, Z.-J., & Hua, T. (2022).
Structural basis for strychnine activation of human bitter taste receptor TAS2R46.
Science, 377(6612), 1298–1304. 10.1126/science.abo1633.

Ziegler, F., & Behrens, M. (2021).
Bitter taste receptors of the common vampire bat are functional and show conserved responses to metal ions in vitro.
Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 288, Article 20210418.
https://doi.org/10.1098/rspb.2021.0418

Ziegler, F., Steuer, A., Di Pizio, A., & Behrens, M. (2023).
Physiological activation of human and mouse bitter taste receptors by bile acids.
Communications Biology, 6(1), 612. https://doi.org/10.1038/s42003-023-04971-3

 

 

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