人間 쓴맛 受容體의 生化學

 

목차  

1.1 Introduction
1.2 Bitter taste receptors: T2Rs
1.3 T2R signal transduction
1.4 Bitter taste perception and T2R polymorphisms
1.5 Ligand binding and activation mechanisms of T2Rs
1.6 Nutrigenomics of taste
1.7 Bitter taste blockers
1.8 Expression of T2Rs in extraoral tissues
1.9 Conclusion
References

 

 

 

 1.1 INTRODUCTION

 

• 미각 체계(gustatory system)는 진화 과정에서 영양가 있고 유익한 화합물 뿐만 아니라 유해 물질도 감지하도록 선택되어왔다. 
• 인간, 그리고 아마도 다른 포유류도 다양한 화합물의 맛을 느낄 수 있지만, 다섯 가지 기본 맛(five basic tastes)을 구분한다. 
  ■ 단맛(sweet),
  ■ 쓴맛(bitter),
  ■ 신맛(sour),
  ■ 짠맛(salt),
  ■ ​​감칠맛(umami) 
• 신맛과 짠맛은 양이온 채널(cation channels)을 통해 감지되는 것으로 여겨진다 (Heck et al., 1984; Kinnamon et al., 1988; Ugawa et al., 1998).
• 반대로, 쓴맛, 단맛, 감칠맛의 감각은 맛 분자와 G 단백질 결합 수용체(G protein-coupled receptors, GPCR)의 상호작용에 의해 시작된다 (Adler et al., 2000; Gilbertson et al., 2000; Sainz et al., 2001).
• 쓴맛(Bitter taste)은, 모든 맛 중에서도, 잠재적으로 독성이 있는 물질의 섭취에 대한 중추적인 경고 신호로 진화해 온 것으로 여겨진다. 
• 맛 지각의 분자적 과정은 입안의 味蕾(taste buds)에 있는 맛 수용체 세포(taste receptor cells, TRC)의 정단 표면에서 시작된다.
• 미뢰(Taste buds)는 혀(tongue), 口蓋(palate), 그리고 좀 적은 정도로 喉頭蓋(epiglottis), 咽頭(pharynx), 喉頭(larynx)에 위치한 味覺 乳頭(taste papillae)에 존재하며, 각 미뢰는 50~100개의 TRC로 구성된다 (Lalonde and Eglitis, 1961; Miller, 1986; Brouwer and Wiersma, 1978).
• 맛 물질과 TRC 막에 위치한 맛 수용체의 상호작용은 신호 전달 연쇄 반응(signaling cascades)을 일으키고, 이는 감각 구심 신경(sensory afferents)을 통해 뇌로 전달되어 맛으로 지각된다 (Chen et al., 2011).

 

 1.2  BITTER TASTE RECEPTORS: T2Rs

 

• 인간의 경우 쓴맛은 T2R이라고 하는 GPCR 슈퍼패밀리의 25개 구성원에 의해 감지된다.
• T2R은 291~334개 아미노산 길이이다 (Adler et al., 2000, Chandrashekar et al., 2000, Matsunami et al., 2000). 
• 10년 남짓 전에 발견된 이 맛 수용체는 인트론이 없는 유전자를 인코딩하는데, 이를 TAS2R이라고 한다.
• TAS2R의 HUGO 유전자 명명법(gene nomenclature)은 이 유전자가 언급되는 모든 곳에서 사용된다.
• 염색체(chromosome) 5p에 위치한 TAS2R1 유전자를 제외한 다른 모든 TAS2R은 게놈에서 인간 염색체 7q와 12p에 클러스터로 구성되어 있으며, 쓴맛 지각에 영향을 미치는 유전자좌(loci)와 유전적으로 연결되어 있다 (Conte et al., 2002). 
• 또한, TAS2R 유사 유전자(pseudogenes)의 수가 많고, 개별 TAS2R 유전자들 중에는 80개 이상의 single nucleotide polymorphisms (SNP, 단일염기 다형성)이 존재한다 (Conte et al., 2002; Kim et al., 2005).
• GPCR 계열 내에서 T2Rs의 분류는 불분명하며, 일부는 이를 별도의 계열로 기술하고(Horn et al., 2003), 다른 분류 체계에서는 이를 곱슬 수용체(frizzled receptors)와 함께 그룹화한다 (Fredriksson et al., 2003). 
• 국제 기초 및 임상 약리학 연합(The International Union of Basic and Clinical Pharmacology, IUPHAR)은 프리즐드 수용체를 별도의 GPCR 계열인 클래스 F로 분류하며, 이 클래스에는 T2R이 포함되지 않는다 (Sharman et al., 2013). 
• T2R은 비교적 다양하며, 약 25~90%의 아미노산 동일성(amino acid identity)을 보인다 (Adler et al., 2000; Matsunami et al., 2000). 
• 이러한 다양성은 쓴맛과 관련된 화학적으로 다양한 리간드와 상호작용하는 능력과 잘 일치한다.
• 단일 쓴맛 화합물은 여러 T2R들을 활성화할 수 있으며,
  각 T2R은 여러 쓴맛 화합물에 의해 활성화될 수 있다 (Meyerhof et al., 2010). 
• 모든 GPCR과 마찬가지로 T2R은
  ■ 7개의 막관통(transmembranes, TM),
  ■ 3개의 세포외 루프(extracellular loops, ECL), 그리고
  ■ 3개의 세포내 루프(intracellular loops, ICL)를 포함하며,
  ■ 짧은 세포외 N-말단(short extracellular N-terminus)과
  ■ 세포내 C-말단(intracellular C-terminus)을 가지고 있다 (Figure 1.1).

 

 

 

• 단맛 및 감칠맛(umami) 수용체(T1R)를 코딩하는 또 다른 taste GPCRs은 C GPCR 패밀리에 속한다 (Lagerstrom and Schioth, 2008). 
• 단맛과 감칠맛은
  3개의 GPCRs에 의해 매개되며, 이 3개의 GPCRs은 감칠맛 수용체인 T1R1/T1R3과 단맛 화합물 수용체인 T1R2/T1R3의 두 가지 이종이량체 수용체(two heterodimeric receptors)를 형성한다 (Li et al., 2002; Nelson et al., 2001, 2002; Zhao et al., 2003). 
• T2R의 short N-terminus와 달리, T1R은 파리지옥풀(Venus flytrap)이라고도 알려진 a long N-terminus를 특징으로 하며, 이는 주요  또는 오르토스테릭 리간드 결합 부위(primary or orthosteric ligand binding site)를 형성한다 (Pin et al., 2003).
• 단맛 수용체와 감칠맛 수용체에 대해 종 간 리간드 특이성(ligand specificity)의 차이가 보고되었다 (Xu et al., 2004; Li et al., 2002; Nelson et al., 2002). 인간의 T1R1/T1R3은 L-Glu에 특이적으로 반응하는 반면, 마우스의 T1R1/T1R3은 L-Glu보다 다른 L-아미노산에 더 강하게 반응한다.
• 최근 연구에서는 인간 및 마우스-타입 반응에서 아미노산 인식에 중요한 T1R1의 세포외 파리지옥 도메인(the extracellular Venus flytrap domain) 내 잔기가 확인되었다 (Toda et al., 2013).
• N-말단 및 C-말단과 ECL의 낮은 아미노산 동일성(the low amino acid identity)과 대조적으로, T2R의 TM과 ICL에서는 서열 보존성(sequence conservation)이 더 높다. TM과 ECL은 T2R의 리간드 결합이 예상되는 영역이고 ICL은 G-protein 상호작용이 일어나는 영역이다 (Adler et al., 2000).

 

 1.3  T2R SIGNAL TRANSDUCTION

 

• T2R이 발견되기 훨씬 전에, 쓴맛 수용체 매개 전달 메커니즘(bitter receptor mediated transduction mechanism)에 맛 특이적 Gα 단백질(taste-specific Gα protein)인 Gα-gustducin이 관여한다는 것이 입증되었다 (Wong et al., 1996). α-gustducin이 녹아웃된 마우스를 만들자 쓴맛을 느끼는 능력이 극적으로 감소했다. 게다가, T2R은 생체 내에서 transducing(전달체)(He et al., 2002)와 기능적으로 결합하는 것으로 나타났으며, 시험관 내에서는 다른 Gi/Go 단백질과도 결합하는 것으로 나타났다 (Ozeck et al., 2004). 
• 쓴맛을 지각하는 데 관여하는 메커니즘과 T2R 신호 전달 경로의 2차 전달물질 또는 다른 하류 구성 요소도 2000년에 T2R이 발견되기 전에 알려져 있었다 (Kurihara et al., 1994; Spielman et al., 1996; Chandrashekar et al., 2000). 양이온 채널(cation channel)인 일시적 수용체 전위 멜라스타틴 하위 유형 5 채널(transient receptor potential melastatin subtype 5 channel, TRPM5)은 미각 조직에서 다른 맛 신호 전달 분자와 함께 공동 발현되는 것으로 밝혀졌다 (Perez et al., 2002).
• 정식 T2R 신호 전달 경로는 아래와 같다. 
• T2R의 세포외 표면(extracellular surface)에
  쓴맛이 나는 화합물(작용제(agonist)라고도 함)이 결합(binding)하면
  수용체의 구조적 변화(conformational changes)가 일어나고,
  이는 수용체 세포내 표면(intracellular surface)의 이종삼량체 G-단백질 복합체(heterotrimeric G-protein complex)인 α-gustducin, β1/3, 그리고 γ13을 활성화시킨다.
• βγ-서브유닛은 이노시톨 인지질(inositol phospholipid, PIP2)을 가수분해하여
  1,4,5-triphosphate (IP3)과 디아실글리세롤(diacylglycerol, DAG)을 생성하는 효소인
  포스포리파아제 Cβ2(phospholipase Cβ2, PLC β2)를 활성화한다. 
• IP3의 생성은
  소포체(endoplasmic reticulum, ER) 막의 IP3 수용체를 활성화시켜
  칼슘 방출 채널(calcium release channels)을 열고 세포내 칼슘의 일시적인 증가를 유발한다.
• 이는 단가 선택적(monovalent selective) TRPM5 채널을 열어
  나트륨 유입(sodium influx),
  막 탈분극(membrane depolarization), 그리고
  미각 구심성 신경(gustatory afferents)을 활성화하는 신경전달물질인 ATP 방출을 유도한다
  (Finger et al., 2005)(Figure 1.2).
• Gα-gustducin은 포스포디에스테라아제(phosphodiesterases, PDE)를 활성화시켜 cAMP 생성을 감소시킨다 (McLaughlin et al., 1992; Spielman, 1998). 

 

 

 

 1.4   BITTER TASTE PERCEPTION AND T2R POLYMORPHISMS

 

• 일부 쓴맛 화합물의 지각에 대한 인간의 민감도는 매우 다양하다 (Bartoshuk, 2000a, 2000b). 이 가변적인 쓴맛 지각은 구강 감각의 유전적 변이에 대한 가장 잘 알려진 예이다. 구조적으로 다양한 수많은 화합물이 인간에게 쓴맛을 유발하며 많은 쓴맛 물질은 다른 기본 맛을 자극하는 물질보다 약 1000배 낮은 농도에서 감지될 수 있다 (Meyerhof, 2005).
• 페닐티오카바마이드(phenylthiocarbamide , PTC)의 맛 지각 유전학에 대한 연구들은 1930년대 초 A. L. Fox가 PTC 결정(crystals)이 일부 사람들에게는 매우 쓴맛이 나지만 다른 사람들에게는 그렇지 않다는 것을 우연히 발견하면서 시작되었다 (Fox, 1932).
• 따라서 티오시아네이트(thiocyanate)(N—C=S) 부분(moiety)을 공유하는 6-n-propyl-2-thiouracil (PROP)과 PTC는 일부 사람들에게는 쓴맛이 나지만 다른 사람들에게는 맛이 없다 (Fox, 1932).
• PTC/PROP에 대한 민감도는 유전적 특성이며, PROP 민감도는 다른 쓴맛 화합물에 대한 낮은 수용도(lower acceptability) 및 일부 쓴맛 음식에 대한 낮은 선호도(lower reported liking)와 관련이 있었다. 
• PTC/PROP 용액의 검출 역치를 기준으로 사람들을
  초미각자(supertasters), 미각자(tasters), 그리고 비미각자(non-tasters)로 분류했다.
• 마찬가지로, 근친 교배된 마우스 계통은 자당 옥타아세트산(sucrose octaacetate, SOA) 및 시클로헥시미드(cycloheximide)와 같은 특정 쓴맛 자극을 감지하는 능력이 서로 다르다. 인간을 대상으로 한 유전 연구에서 PROP 감지 능력은 염색체(chromosome) 5p15의 유전자좌(locus)에 의해 결정된다는 것이 밝혀졌다 (Reed et al., 1999).
  
• 인간이 다양한 쓴맛 성분에 어떻게 반응하는지는 쓴맛 연구 분야에서 중요한 질문이다. 
• 시클로헥시미드(cycloheximide) 감수성이 결핍된 마우스 종(strains)에서 T2R5 서열의 미스센스 돌연변이(Missense mutations)가 발견되었다 (Chandrashekar et al., 2000). 쓴맛에 둔감한 마우스 종에서 발견된 이러한 유전적 변이는 쓴맛에 민감한 종의 대립유전자에 비해 세포 기반 분석에서 반응성이 낮았다. 이는 맛 수용체의 대립유전자가 쓴맛 성분에 대한 행동 및 세포 반응을 모두 변화시킬 수 있음을 보여준다. 
• 인간에서도 유사한 발견이 이루어졌는데, 염색체 7q에 위치하는 TAS2R38 유전자의 자연 발생 대립유전자가 PTC와 PROP를 미각하는 능력의 개인차를 유발하는 것으로 보고되었다 (Mennella et al., 2005). T2R38의 세 가지 다형성 변이(polymorphic variants) (49번 위치에 프롤린(proline) 또는 알라닌(alanine), 262번 위치에 알라닌 또는 발린(valine), 296번 위치에 발린 또는 이소류신(isoleucine))는 PTC 민감도 분산의 55-85%를 차지하는 다섯 가지 공통 하플로타입(haplotypes)을 생성했다 (Bufe et al., 2005).
• Taster haplotype 또는 PROP-민감 개인들은 하나 또는 두 개의 우성 대립유전자(dominant alleles)(proline-alanine-valine; PAV/PAV) 또는 PAV/AVI(alanine-valine-isoleucine)를 보유하는 반면, 미각이 둔감한 개인들은 AVI/AVI 형질(trait)에 대해 열성(recessive)이다(Bufe et al., 2005). PTC/PROP 미각 능력(ability to taste)은 흡연으로부터 보호할 수 있으며, 음주 감소와도 관련이 있는 것으로 나타났다 (Cannon et al., 2005; Duffy et al., 2004).
  
• 최근까지 TAS2R38은 인간에서 두드러진 표현형 변이(phenotypic variation)를 보이는 유일한 쓴맛 유전자로 여겨졌다. 그러나 쓴맛 수용체 서열(bitter receptor sequence)의 변이는 TAS2R38 유전자좌에만 국한되지 않는다. 인간의 TAS2R은 대부분의 다른 유전자보다 집단 내 및 집단 간에 더 많은 유전적 변이를 보인다 (Kim et al., 2005). 
• 한 가지 가능한 설명은 유전자가 지역적 조건, 특히 음식에 함유된 쓴맛 독소에 적응한다는 것이다. 최근 다른 TAS2R 유전자의 단일염기다형성(SNPs)이 발견되었다. 예를 들어, β-glucopyranoside (글루코피라노시드) 수용체 또는 T2R16을 암호화하는 TAS2R16 유전자의 미스센스 돌연변이는 쓴맛 자극에 대한 수용체의 민감도를 감소시켜 알코올 의존 위험과 관련이 있는 것으로 나타났다 (Bufe et al., 2002; Wang et al., 2007). 
• TAS2R43 유전자 대립유전자의 다형성은 사람들이 천연 식물 화합물인 알로인(aloin)과 아리스톨로크산(aristolochic acid)의 쓴맛에 매우 민감하게 반응하게 만든다 (Pronin et al., 2007). 
• TAS2R43과 TAS2R44 유전자 대립유전자는 인공 감미료인 사카린(saccharin)의 쓴맛 지각과 관련이 있다. 최근 12번 염색체의 T2R 클러스터에서 카페인에 대한 인간의 쓴맛 지각 변이에 기여하는 단일염기다형성(SNP)이 발견되었다 (Ledda et al., 2014). 
• 따라서 단일 맛 표현형(single taste phenotype)보다 여러 맛 표현형(multiple taste phenotypes)을 조사하는 것이 인간의 섭식 행동에 대한 더 완전한 이해를 제공할 가능성이 높다.

 

 1.5   LIGAND BINDING AND ACTIVATION MECHANISMS OF T2Rs

 

• 쓴맛을 내는 화합물은 그 수가 많을 뿐만 아니라 구조적으로도 다양하다. 
• 하이드록시지방산(hydroxy fatty acids), 펩타이드(peptides), 아미노산(amino acids), 아민(amines), N-헤테로고리 화합물(N-heterocyclic compounds), 우레아(ureas), 티오우레아(thioureas), 카르바마이드(carbamides), 에스테르(esters), 락톤(lactones), 페놀(phenols), 알칼로이드(alkaloids), 글리코시드(glycosides) 등이 그 예이다. 
• 반면, T2 수용체는 25개만 확인되어, 이처럼 제한된 수의 수용체로 이처럼 다양한 쓴맛 화합물을 어떻게 감지할 수 있는지에 대한 의문이 제기되고 있다. 
• 많은 T2Rs가 아직 명확히 규명되지 않은 상태이지만, 지난 10년 동안 여러 T2R의 리간드 특이성(ligand specificity)이 연구되었다(Chandrashekar et al., 2000; Bufe et al., 2002, Kim et al., 2003; Behrens et al., 2004; Kuhn et al., 2004; Pronin et al., 2004; Brockhoff et al., 2007; Sainz et al., 2007; Dotson et al., 2008; Maehashi et al., 2008; Upadhyaya et al., 2010; Meyerhof et al., 2010).
• 일부 수용체는 단일 또는 소수의 화합물만 인식하는 반면, 다른 수용체는 여러 화합물에 반응한다.
• T2Rs의 각각의 쓴맛 리간드에 대한 친화도(affinity)는 낮으며, EC₅₀ 값은 높은 마이크로몰(micromole)에서 낮은 밀리몰(millimole)의 범위에 있다 (Meyerhof et al., 2010). 따라서 쓴맛 화합물은 다양한 농도 범위에서 다양한 T2Rs을 활성화시키며, 그 차이는 일반적으로 10배에서 100배에 이른다.
  
• 그러나 T2R의 구조적 결정인자에 대한 지식은 쓴맛 감지의 분자적 기초에 대한 통찰력을 제공하고 새로운 맛 조절제를 설계하는 데 필수적이다. 
• 분자 모델링 및 부위-특이적 돌연변이 연구(Molecular modeling and site-directed mutagenesis studies)는 일부 T2R의 리간드-결합 포켓을 특성화하기 위해 수행되었다. PTC 수용체라고도 하는 T2R38의 3차원 구조는 MembStruk 계산법과 상동성 모델링(homology modeling)(Floriano et al., 2006)을 사용하여 예측했다. 그런 다음 Hierdock 및 ScanBindSite 계산 툴을 사용하여 T2R38에 결합된 PTC 모델을 생성하여 결합 부위와 결합 에너지를 예측했다. 이러한 모델에 따르면 PTC는 변이 아미노산(variant amino acids)인 P49A, A262V 및 V296I와는 거리가 먼 부위에 결합한다 (Floriano et al., 2006).
• 인간이 PTC를 미각하지 못하는 것은 PTC 수용체의 결합 친화도 감소보다는 G-protein 활성화 실패 때문이라는 주장도 있다. 이 연구는 PTC 수용체 기능에서 TM6과 TM7의 역할을 강조한다. 미각 수용체가 아닌 변이체에 더 큰 측쇄를 도입하면 TM6과 TM7의 패킹이 변형되어 TM6의 이동이 더 어려워질 수 있다 (Biarnes et al., 2010).
  
• 최근 한 연구에서는 BiHelix and SuperBiHelix Monte Carlo methods을 사용하여 T2R38의 3차원 구조를 예측했다 (Tan et al., 2012). 
• 이 연구는 262번 residue가 미각자(tasters)(hTAS2R38_PAV, hTAS2R38_AAI, hTAS2R38_PVV)에서 수용체를 안정화하는 나선간 수소 결합 네트워크(interhelical hydrogen bond network)에 관여하지만, 비미각자(non-tasters)(hTAS2R38AVI)에서는 그렇지 않음을 시사한다 (Tan et al., 2012).
  
• Pronin et al.의 연구에서, 리간드 인식에 관여하는 잔기(residues)를 확인하기 위해 T2R43 및 T2R44 키메라 수용체(chimeric receptors)를 생성했다 (Pronin et al., 2004). T2R43은 6-니트로사카린(6-nitrosaccharin)과 사카린의 쓴맛 파생체인 N-isopropyl-2-methyl-5-nitrobenzenesulfonamide (IMNB)에 의해 활성화된다. 반면 T2R44는 데나토늄(denatonium)과 6-니트로사카린(6-nitrosaccharin)에 의해 활성화된다. T2R43과 T2R44의 아미노산 서열은 89% 동일하며, 34개 아미노산 차이 중 15개는 ECL1과 ECL2에 집중되어 있는 반면, ECL3은 완전히 보존되어 있다. T2R43과 T2R44 키메라는 ECL-1과 -2를 교환하여 생성되었다. ECL1에서 T2R43과 T2R44 사이에는 단 4개의 아미노산 차이만 있다. 기능 연구(Functional studies)에 따르면 ECL1은 수용체 활성화에 매우 중요한 것으로 나타났는데, T2R43의 이러한 잔기를 T2R44의 잔기로 대체하는 것만으로도 T2R43이 IMNB에 민감하지 않게 만들기에 충분하기 때문이다. 반면, T2R43의 ECL1과 ECL2를 모두 T2R44 루프로 대체하면 6-니트로사카린에 의한 활성화가 대부분 제거되었다. 
  
  
• 최근, T2R16의 점 돌연변이체(point mutants)를 이용한 리간드 도킹 시뮬레이션(ligand docking simulations)과 기능 분석(functional analysis)을 통해 수용체와 β-글루코피라노사이드(β-glucopyranosides)의 결합 부위를 확인했다 (Sakurai et al., 2010).
• TMs 3, 5, 6의 7개 아미노산 잔기(amino acid residues)가 리간드 인식에 관여했다. 아미노산 잔기 Glu86, Trp94, Gln177은 살리신(salicin) 인식에 관여하는 반면, His181과 소수성 잔기인 Phe93, Phe240, Ile243은 결합 부위 형성에 기여한 것으로 보인다. 키메라 및 돌연변이 수용체를 제작하고 기능 분석을 수행한 결과, T2R46, T2R43, T2R31의 활성화에 중요한 아미노산 잔기가 확인되었다 (Brockhoff et al., 2010). 수용체 키메라를 제작한 결과, 작용제 선택성(agonist selectivity)은 수용체의 TM7 영역에 의해 주로 결정됨이 밝혀졌다. 스트리크닌(strychnine)에 의해 활성화된 T2R46과 아리스토로크산(aristolochic acid)에 의해 활성화된 T2R31 간의 TM7 영역 내 두 잔기 교환은 작용제 선택성을 역전시키기에 충분했다.
  
• 단백질이 풍부한 식품의 발효는 발효 식품의 쓴맛을 담당하는 쓴 펩타이드(bitter peptides)를 생성한다. 
• 쓴맛의 카제인 소화물(Bitter casein digests)은 이종 발현 시스템(heterologous expression system)에서 T2R1, T2R4, T2R14 및 T2R16을 활성화할 수 있었다 (Maehashi et al., 2008). 두 가지 쓴맛의 다이펩타이드(bitter di-peptides)인 Gly-Phe(glycine-phenylalanine)와 Gly-Leu(glycine-leucine)는 T2R1을 더 강하게 활성화했지만, 다른 수용체에서는 반응을 유발하지 않거나 약하게 나타났다. 
• 쓴맛 다이펩타이드와 트리펩타이드(tri-peptides)의 T2R1 활성화 능력이 추가로 시험되었다 (Upadhyaya et al., 2010). 그 결과, 쓴맛 트리펩타이드도 T2R1을 활성화했으며 시험된 다이펩타이드보다 더 강력했다. 시험된 모든 펩타이드 중 Phe-Phe-Phe (phenylalanine-phenylalanine-phenylalanine)가 T2R1 발현 세포를 가장 많이 활성화시켰으며, 0.125~1 mM 농도에서 사람이 쓴맛으로 느끼는 수준까지 증가했다. EC50 값은 370 μM이었다. Phe-Phe-Phe는 소수성 아미노산으로 구성되어 있으며, 펩타이드의 쓴맛은 소수성 아미노산이 C-terminus에 위치할 때 더욱 뚜렷하게 나타난다. 트리펩타이드의 경우, 중간 아미노산 잔기가 C-terminus 및 N-terminus 아미노산보다 더 중요한 것으로 간주된다 (Wu and Aluko, 2007).
• 또한, ACE (angiotensin-converting enzyme, 안지오텐신 전환 효소) 억제 활성을 가진 일부 펩타이드도 T2R1을 활성화할 수 있었다. Homology modeling과 docking studies는 TM 1-3, TM 7, ECL1 및 ECL2의 아미노산 잔류물이 펩타이드 리간드를 위한 T2R1의 리간드 결합 포켓을 형성하는 데 기여한다는 것을 보여주었다 (Upadhyaya et al., 2010). 
  
• T2R1에 대한 또 다른 연구에서, 분자 모델링 및 부위 특이적 돌연변이 연구(molecular modeling and site-directed mutagenesis studies)를 통해 두 가지 아스파라긴(asparagines)인 Asn66 그리고 고도로 보존된 Asn24가 덱스트로메토르판(dextromethorphan DXM)-유도 수용체 신호전달에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다 (Singh et al., 2011). Asn24는 TM1-TM2-TM7을 연결하는 수소 결합 네트워크를 매개하여 수용체 활성화에 중요한 역할을 하는 반면, Asn66은 DXM과의 결합에 필수적이다. 
• T2R에는 LXXSL motif라는 고유한 시그니처 서열이 있다. 이 모티프는 세포질 말단(cytoplasmic end)에서 TM5의 나선 구조를 안정화하는 구조적 역할을 주로 수행하고, ICL3의 구조에 영향을 미치는 기능적 역할을 한다. 이 모티프의 보존된 잔기가 부피가 큰 β-분지 아미노산(β-branched amino acids)으로 치환되면 단백질의 誤접힘(misfolding) 및/또는 비기능적 수용체(non-functional receptor)가 초래된다 (Singh et al., 2011).
  
• 최근, 쓴맛 수용체 T2R4의 퀴닌-매개 활성화(quinine-mediated activation)에서 ICL3의 역할이 알라닌 스캔 돌연변이(alanine scan mutagenesis)를 이용하여 입증되었다 (Pydi et al., 2013). 
• T2R4의 ICL3은 알라닌(alanine)으로 돌연변이된 23개의 아미노산 잔기(amino acid residues)로 구성되어 있다. 23개의 돌연변이(mutants) 중 14개만 농도 의존적으로 퀴닌-유도적 신호전달(quinine-induced signaling)을 보였다. Q216A, T230A 및 V234A의 세 가지 돌연변이는 퀴닌에 대한 반응이 증가했다.
• R213A, Q219A, K220A, Q229A, E231A 및 H233A의 여섯 가지 돌연변이는 세포 내 칼슘 이동에서 검출 가능하거나 통계적으로 유의미한 증가를 보이지 않아 수용체 활성화에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다.
• 반면 I215A, F225A 및 P228A 돌연변이는 수용체 활성화가 변형되거나 리간드 결합에 결함이 있었다. 일부 돌연변이는 통계적으로 유의미한 기저 신호전달 또는 구성적 활성을 보였다. 25개의 인간 T2R 중 24개에 존재하는 H214A는 가장 높은 구성적 활성(constitutive activity) (즉, 작용제 부재 시)을 보였다.
• 최근 연구에서는 T2R의 C-terminus에서 보존된 KLK/R motif를 확인했다. 이 KLK 모티프는 T2R4의 이동 및 활성화와 관련된 중요한 기능적 역할을 수행하는 것으로 제시되었다(Upadhyaya et al., 2015).

 

 1.6   NUTRIGENOMICS OF TASTE

 

• PROP phenotype (表現型)은 쓴맛 지각의 일반적인 지표 역할을 하며, 이는 일반적인 음식 선호도와 식습관에 영향을 미치고, 이는 체중 및 만성 질환 위험과도 관련이 있다. 강한 쓴맛은 독소의 존재와 밀접한 관련이 있으며 혐오감을 준다. 그러나 적당한 쓴맛은 맥주, 와인, 초콜릿, 그리고 여러 치즈를 포함한 다양한 음식에서 매력적이고 기대된다.
• Fischer와 동료들은 PTC tasters는 마른 체형을 보이는 경향이 있는 반면, non-tasters 는 풍만한 체형을 보이는 경향이 있다고 지적했다 (Fischer et al., 1966). 
• 과체중 중년 여성을 대상으로 한 연구에서는 PROP 상태와 체중의 연관성을 뒷받침하는 설득력 있는 증거가 제시되었다 (Goldstein et al., 2005). Goldstein et al.은 non-taster 여성이 supertaster 여성보다 약 6 BMI (체질량 지수)만큼 더 무겁다는 것을 보여주었다. 해부학적 증거에 따르면 PTC/PROP에 대한 맛 민감도가 다른 사람들은 혀 앞쪽 표면(anterior surface of tongue)에 있는 균상미각유두(fungiform taste papillae)의 밀도 또한 다르다는 것이 밝혀졌다 (Bartoshuk et al., 1994; Essick et al., 2003; Tepper and Nurse, 1997). Non-tasters는 菌狀味覺乳頭의 밀도가 가장 낮은 반면, supertasters는 균상미각유두의 밀도가 가장 높다.
  
• 이소티오시아네이트(Isothiocyanates)는, 식물에 널리 분포하는 글루코시놀레이트(glucosinolates)의 분해 산물로서, 갑상선(thyroid gland)의 요오드 흡수(uptake of iodine)를 방해하여 갑상선종(goiter)과 극심한 형태의 크레틴증(cretinism)을 유발한다. 
• 요오드 결핍이 이 질환의 주요 원인이지만, 식품 공급에 함유된 갑상선종 유발 물질이 특히 식이 요오드가 부족할 때 기여할 수 있다. 미국의 임상 집단에서 무갑상선 크레틴(athyroidic cretins)의 상당수가 PTC non-tasters라는 것이 밝혀졌다 (Shepard, 1961). 
• 어린이의 채소 선택 및 섭취에 대한 PROP 상태의 역할에 대한 연구에서는 non-taster 어린이가 taster 어린이보다 전반적으로 쓴 채소를 더 많이 섭취하는 것으로 나타났다 (Bell and Tepper, 2006). PROP status는 또한 어린이의 단맛 선호도와 관련이 있다. Taster 미취학 아동은 non-taster  아동보다 단 것을 더 선호했다 (Keller and Tepper, 2004). 
  
  
• 캡사이신(capsaicin) (고추), 신남알데히드(cinnamaldehyde) (계피), 탄산가스(carbonation)에 대한 구강 자극 지각은 PROP 민감도의 영향을 받는다 (Karrer and Bartoshuk, 1991; Prescott and Swain-Campbell, 2000; Prescott et al., 2004).
• 지방 지각(fat perception)의 개인차는 PROP taster status 및 미뢰 밀도(taste bud density)와 관련이 있는 것으로 나타났다. 대학생을 대상으로 한 연구에 따르면, medium tasters와 supertasters는 고지방 드레싱과 저지방 드레싱을 확실하게 구별했지만, non-tasters는 두 샘플을 구분하지 못했다 (Tepper and Nurse, 1997).
• Keller와 동료들이 미취학 아동을 대상으로 실시한 연구에 따르면, 이러한 표현형은 남아보다 여아의 지방 선호도에 더 큰 영향을 미칠 수 있다 (Keller et al., 2002). 자유 지방 섭취량(Discretionary fat intake)은 taster와 non-taster 남아 사이에서 차이가 없었다.
  
• PROP status와 질병 위험 간의 연관성을 조사한 연구는 거의 없으며, 이 문제를 다루는 데이터는 부족하다. 
• 고령 여성의 T2R38 polymorphisms(다형성)과 cardiovascular risk (심혈관 위험), 또는 유방암(breast cancer) 환자의 PROP status와 lipid profiles 간의 연관성은 보고되지 않았다 (Timpson et al., 2005; Drewnowski et al., 2007). 그러나 大腸 病理檢査(screening for colon pathology)를 정기적으로 받는 고령 남성에서는 PROP에 대한 민감도 증가와 대장 용종(colon polyps) 數 증가 사이에 약간의 聯關性이 發見되었다(Basson et al., 2005).
  
• 齒牙齲蝕症(Dental caries)은 자기-제한적이지 않고 단기 약물 치료로 호전되지 않는 가장 흔한 소아 만성 질환이다 (Edelstein and Douglass, 1995). 효과적인 치과 진료를 위해서는 치아우식증 고위험군 소아를 ​​조기에 진단하여 조기에 집중적인 예방적 개입을 제공하는 것이 필수적이다.
• PROP 민감도의 개인차는 치아우식증과 관련이 있으며, 소아의 치아우식증 경험과 관련된 taster status를 판단하는 중요한 도구로 활용될 수 있다 (Rupesh and Nayak, 2006; Verma et al., 2006; Pidamale et al., 2012; Hedge and Sharma, 2008).
• 식단과 치아우식증의 역할에 대한 포괄적인 고찰을 통해 蔗糖(sucrose)이 치아우식증과 관련된 가장 중요한 식이 항목임을 재확인할 수 있었다 (Habibian et al., 2001).
• Non-taster 아이들은 medium 또는 supertasters인 아이들에 비해 설탕 섭취 농도와 빈도가 더 높을 수 있으며, 따라서 충치 발생 위험이 더 높다 (Anliker et al., 1991). 반면, supertasters와 medium tasters 아이들은 단 음식을 피하는 경향이 더 높아 충치 발생 위험이 낮다. 또한 tasters 아이들에서 non-tasters 아이들로 갈수록 Streptococcus mutans 수치가 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 충치 발생 위험이 더 높다는 것을 의미한다 (Verma et al., 2006).

 

 1.7  BITTER TASTE BLOCKERS

 

• 미각(sense of taste)은 식품 선택, 영양 및 건강에 상당한 영향을 미친다. 따라서 유익한 식품과 의약품의 맛을 더 좋게 만들기 위해 쓴맛 지각과 쓴맛 수용체를 조절하는 것이 매우 바람직하다. 식품 및 건강기능식품 산업에서 중요한 역할을 하는 것 외에도 쓴맛 차단제는 미각 및 비미각 조직에서 T2R 기능의 역할을 조사하는 화학적 프로브로 유익할 수 있다. 
• T2R 길항제(antagonist)인 GIV3727은 사카린(saccharin)과 아세설팜칼륨(acesulfame-K)에 의한 T2R44의 활성화를 억제할 수 있었다 (Slack et al., 2010). 이 화합물은 밀접하게 관련된 T2R43을 포함하여 5개의 추가 T2R도 억제했다. –COOH 부분이 GIV3727의 길항제 활성에 필수적인 것으로 보이는데, 이 그룹을 에스테르(ester) 또는 상응하는 알코올(corresponding alcohol)로 대체하면 활성이 없어지기 때문이다. TM7의 두 잔기는 T2R43/T2R44의 길항제 활성에 중요하다. 이 연구 직후, 다제내성 단백질 1(Multidrug Resistance Protein 1, MRP1) 수송체(transporter)의 승인된 억제제인 ​​프로베네시드(probenecid)가 비경쟁적(알로스테릭, allosteric) 메커니즘으로  T2R16, T2R38 및 T2R43을 억제하는 것으로 나타났다 (Greene et al., 2011).
• 식용 식물에서 유래한 두 가지 천연 세스퀴테르펜 락톤(sesquiterpene lactones)인 3β-하이드록시디하이드로코스투놀리드(3β-Hydroxydihydrocostunolide, 3HDC)와 3β-하이드록시펠레놀리드(Hydroxypelenolide, 3HP)가 T2R46 수용체의 반응을 차단하는 것으로 밝혀졌다 (Brockhoff et al., 2011). T2R46 외에도 3HDC는 T2R30과 T2R40을, 3HP는 T2R30, T2R43, T2R44를 억제했다. 
• 최근 연구에서는
  γ-아미노부티르산(aminobutyric acid, GABA), 아브시스산(abscisic acid), Na-bis (carboxymethyl)-L-lysine (BCML)과 같은 새로운 쓴맛 차단제가 발견되었다.
• 이들은 퀴닌(quinine)에 의해 활성화된 인간 T2R4의 경쟁적 억제제(competitive inhibitors)로 작용하며, 작용제(agonist)인 퀴닌(quinine)과 동일한 오르토스테릭 부위(orthosteric site)를 공유한다 (Pydi et al., 2014, Pydi et al., 2015). 
• T2R에 대한 쓴맛 작용제는 매우 다양하게 알려져 있지만, 쓴맛 차단제(bitter taste blockers) 또는 T2R 길항제(antagonists)와 역작용제(inverse agonists)에 대한 지식은 제한적이다. 따라서 건강한 쓴맛 식품의 섭취를 늘리고 약물 순응도를 높이기 위해 T2R에 대한 천연 또는 합성 차단제를 더 많이 개발해야 할 시급한 필요성이 있다.

 

 

 1.8  EXPRESSION OF T2Rs IN EXTRAORAL TISSUES

 

• 맛 GPCR의 분자적 식별을 통해 맛 신호전달이 미뢰(taste buds)에만 국한되지 않고 구강 외 여러 조직에서 발생하며, 맛 외에도 다양한 기능을 수행한다는 것이 분명해졌다.
• 미각 조직에서 T2R이 발견된 직후, 설치류와 인간의 위장관(gastrointestinal tract, GIT) 및 장내분비 (enteroendocrine) STC-1 세포에서 발현이 확인되었으며 (Wu et al., 2002; Rozengurt, 2006), 이들은 영양소의 화학적 감각에 관여한다. Gα-gustducin과 Gα-transducin 또한 이들 조직에서 발현되었는데, 이는 GIT에도 맛 감지 기전이 존재할 가능성을 시사한다.
• 데나토늄(denatonium), PTC, PROP, 카페인, 시클로헥시미드(cycloheximide)와 같은 쓴맛 화합물을 STC-1 세포 배양액에 첨가하면 [Ca2+]i 반응이 빠르게 촉진되었다 (Wu et al., 2002; Masuho et al., 2005). 또한, T2 수용체의 활성화는 미각(gustatory) G-protein인 α-gustducin을 통해 공복 호르몬인 그렐린(ghrelin)의 분비를 자극했다 (Janssen et al., 2011).
  
  
• 기도 상피(airway epithelium)에서 T2Rs는 비강 상피(nasal epithelium)의 화학감각 수용체 세포(chemosensory receptor cells)에서 그리고 섬모 상피 세포(ciliated epithelial cells)에서 발현되는 것으로 나타났다 (Shah et al., 2009; Tizzano et al., 2011; Masuho et al., 2005). 비강 상피에 쓴맛 물질을 도포하면 삼차신경(trigeminal nerve)이 활성화되어 무호흡(apnea)과 같은 보호 반사가 유발되어 박테리아가 호흡기로 더 이상 흡입되지 않도록 하고, 재채기(sneezing)와 기침(coughing)을 통해 비강에서 박테리아를 배출하도록 유도되었다. 
• 인간 기도 상피세포의 運動纖毛(motile cilia)에 있는 T2Rs에 쓴맛 화합물을 노출시키면 섬모 박동 빈도(ciliary beat frequency)가 자극되어(Shah et al., 2009), 해당 물질을 제거하는 기계적인 방어 기전이 시작되었다. 인간의 기도 평활근(airway smooth muscle, ASM)에서 T2Rs는 ASM 이완 및 기관지 확장을 유발한다 (Deshpande et al., 2010). 데나토늄(denatonium), 사카린(saccharin), 클로로퀸(chloroquine)과 같은 쓴맛 물질은 마우스에서 분리된 ASM 제제(preparations)의 이완(relaxation)을 유발하고, 현재 사용되는 β-작용제(agonists)보다 3배 더 큰 기도 확장(dilation of airways)을 유발했다. T2Rs에 의한 이러한 이완은 [Ca2+]i 증가에 기인하며, 이는 큰 전도도 칼륨 채널(large conductance potassium channels)(BKCa)을 활성화하고 세포막의 과분극(hyperpolarization)을 유발하는 것으로 추정된다. 
• 추가 연구에서는 T2R 작용제(agonists)의 기관지 확장 효과(bronchodilatory effects)가 β2-AR 탈감각(불감지화, desensitization)에 의해 저해되지 않는다는 것이 밝혀졌다 (An et al., 2012). 이러한 결과는 천식 약물 치료(asthma pharmacotherapy)에서 T2Rs가 잠재적인 새로운 표적이라는 것을 다시 한번 강조한다.
• 25종의 인간 TAS2Rs 발현은 폐동맥 평활근 세포(pulmonary artery smooth muscle cells)에서도 확인되었으며, 이 세포들은 쓴맛이 나는 화합물에 의해 기능하고 활성화된다 (Upadhyaya et al., 2014). 이 연구는 혈관 내 T2Rs가 혈관 긴장도(vascular tone) 조절에 관여할 수 있음을 시사한다(Upadhyaya et al., 2014).
• 최근 T2R38의 활성화에 의한 인간 및 생쥐 상기도 상피세포(upper respiratory epithelium)의 점막 선천적 방어 조절(Regulation of the mucosal innate defense)이 입증되었다 (Lee et al., 2012, 2014). 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)과 같은 그람-음성 호흡기 병원균은 개체 밀도(쿼럼 센싱 quorum sensing) 신호로 아실호모세린 락톤(acyl-homoserine lactones, AHL)을 생성한다. AHL은 쓴맛이 나는 세스퀴테르펜 락톤(sesquiterpene lactones)과 화학적으로 연관되어 있으며 상기도 상피세포에서 T2R38을 활성화한다. 수용체 활성화는 칼슘 및 산화질소(NO) 신호전달을 유발하여 흡입 병원균에 대한 주요 물리적 호흡기 방어 작용인 점액섬모 청소(mucociliary clearance)를 자극한다. T2R38의 유전적 변이는 호흡기 감염에 대한 개인차와도 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

 

 1.9  CONCLUSION

 

• T2Rs의 탈고아화(deorphanization)로 인해, T2Rs와 쓴맛 작용제 간의 상호작용 메커니즘에 대한 연구를 통해 이 수용체들이 이처럼 다양한 쓴맛 성분을 어떻게 감지하는지 밝혀지기 시작했다. 리간드 결합 구조에 대한 이해는 쓴맛 차단제(bitter blockers)와 같은 맛 조절제(taste modulators)의 식별 및 설계에 더욱 도움이 될 것이다. T2R 차단제(blockers)는 항산화제(antioxidant) 및/또는 영양 강화 식품 및 음료, 그리고 제약 및 건강기능식품 산업에서 광범위하게 활용될 수 있다.
• 쓴맛 신호 전달의 생화학적 機轉을 규명하는 것은 인간의 쓴맛 지각에 관한 이해에 중요한 역할을 한다. 다음 단계는 맛 신호가 어떻게 종료되는지를 밝히는 것이다. 
• Robinette et al.의 연구에서는 퀴닌 전처리(quinine pretreatment)와 기도 평활근(airway smooth muscle)에서의 노출을 통해 T2R 기능이 30% 불감지화(desensitization)되었음을 보였다 (Robinett et al., 2011).
• 분자 및 약리학적 기법을 사용한 또 다른 연구에서는 T2R4가 작용제 노출 시 내재화되지 않는다는 것을 보여주었다 (Upadhyaya et al., 2016). 오히려 쓴맛 화합물인 퀴닌(quinine)으로 처치했을 때 브레펠딘 A에 민감한(Brefeldin A-sensitive) T2R4의 표면 발현이 두 배 증가했다. 퀴닌 전처리는 대조군 무처치 세포에 비해 후속 칼슘 반응을 35 ± 5% 감소시켰다. 따라서 이 연구는 퀴닌의 새로운 약리학적 샤페론 역할(pharmacochaperone role)을 밝혀내고 T2R 탈감지화의 가능한 기전에 대한 통찰력을 제공한다 (Upadhyaya et al., 2016).
• 그러나 T2R 탈감지화에 대한 데이터는 매우 부족하며, 수용체 내재화, 해당 키나아제에 의한 인산화, β-arrestin 결합, 그리고 수용체-G 단백질 복합체의 분리와 같은 탈감지화에 관여하는 잠재적인 분자 기전은 아직 충분히 규명되지 않았다. T2Rs을 새로운 치료 표적으로 도입하기 전에, 탈감지화 기전을 상세히 규명하는 것이 매우 중요하다.
• T2Rs은 각 리간드에 대한 친화도가 낮다. 최근 연구에서는 T2R 작용제를 β-agonists 보다 50~100배 높은 농도로 사용했다 (An et al., 2012; Pulkkinen et al., 2012). 따라서 T2Rs 하류에서 활용되는 신호 전달 메커니즘을 밝히면 더욱 구체적이고 강력한 쓴맛 화합물 및/또는 차단제의 합성이 가능해질 수 있다.

 

 

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