커피의 쓴맛 성분 : 클로로겐산 락톤

 

 

 INTRODUCTION

 

• Phenolic acids는 esters, ethers, 또는 free acids의 mixtures로 천연에서 널리 발생한다.
• Caffeic acid, ferulic acid, 그리고 p-coumaric acid는
  ⇒ cinnamic acid로부터 도출되는 phenolic compounds이며
  ⇒ (-)-quinic acid의 aliphatic alcohols를 가진
       monoester 또는 diester (다이에스터)의 형태로 천연적으로 존재하며,
  ⇒ 일반적인 이름은 chlorogenic acid로 불린다 [1].
• 클로로겐산 =  카페익산과 퀸산의 에스테르결합으로 구성된 천연 화합물!!
                      (※ 본 블로거의 메모)
• Chlorogenic acids의 주요 subgroups는
    ◎ caffeoylquinic acids (CQA),
    ◎ dicaffeoylquinic acids (diCQA),
    ◎ feruloylquinic acids (FQA), and
    ◎ p-coumaroylquinic acids (pCoQA)이다 [2, 3].
• Green coffee beans는 
  ⇒ 식물에서 발견되는 가장 많은 양의 CGA를 함유하며 6~12%에 이른다 [4-10].
• 이 화합물에 관한 연구들은 이들이 몇 가지 약리적 특성들을 가지고 있는 것을 밝혀왔다.
  ⇒ antioxidant activity (항산화 작용) [11-13],
  ⇒ ability to increase hepatic glucose utilization (간의 포도당 이용증가 능력) [14-18],
  ⇒ inhibition of the HIV-1 integrase (에이즈 바이러스 인테그라아제의 억제) [19-21],
  ⇒ antispasmodic activity (鎭痙劑 작용) [22], and
  ⇒ inhibition of the mutagenicity of carcinogenic compounds
       (발암성 화합물의 돌연변이 유발 억제) [23]
• CGAs의 상응하는 chlorogenic acid lactones (CGL)는
  ⇒ 로스팅 프로세스 동안에 quinic moiety (퀴닉 부분)로부터
       loss of water molecule (물분자를 잃고)와 
       intramolecular ester bond (분자내 에스테르 결합)의 형성에 의해 형성되는데 [24], (Figure 1)
  ⇒ caffeine의 pharmacological effects (약리학적 효과)와
       독립된 brain function에 대한 잠재적 효과 때문에 특별한 주의를 받아왔다 [25-31].
• Chlorogenic acid and lactones nomenclature (명명법):
  ⇒ 저자들은 chlorogenic acids에 대해 IUPAC numbering system를 적용했다 [36].
  ⇒ 비록, IUPAC가 다루는 lactones의 넘버링 시스템이 그 acids의 것과 다르지만,
  ⇒ 혼동을 피하기 위해, 본 논문에서 저자들은
       lactones에 대해 acid precursors와 carbon atoms와 같은 넘버링을 사용했다.
  ⇒ 다른 저자들을 인용할 때에는, 그들의 넘버링은 일관성을 위해 변경되었다.
  
  
• De Paulis et al.(2002)는
  ⇒ 3,4- dicaffeoylquinic-1,5-lactone (3,4-diCQL)이
      human adenosine transporter (인간의 아데노신 수송체)를 억제하고
  ⇒ 따라서 잠재적으로 뇌에서의 카페인의 자극 효과를 중화한다(counteract)고 보고했다 [29].
• Boublick et al.(1987)은
  ⇒ rat brain preparations를 사용하여,
  ⇒ 커피가 opiate antagonists (阿片 拮抗体)와 비슷한 특징을 가진
  ⇒ opiate receptor binding activity (阿片 受容體 結合作用)을 나타냈다고 보고했다 [26]. 
• Wynne et al.(1984)는
  ⇒ isomeric feruloylquinic acid lactones (FQL)을 함유하는 an active fraction을 분리해냈는데
  ⇒ 나중에 그들의 spectra에 기초하여 1-FQL, 3-FQL, and 4-FQL인 것으로 식별되었다 [27].
• Clifford (1997)는
  ⇒ CQL and FQL을 함유하는 것으로 알려진 fractions로부터
  ⇒ opioid receptors(阿片類似受容體)에서 agonist(作用劑)와 antagonist(拮抗体) behavior 모두를 관찰했다 [28].

 

 

Figure 1. 클로로겐산으로부터 락톤의 형성.

5번 위치에 치환기가 없는 CGA들만 (즉, 4-CQA와 3-CQA) 카페욜-1,5-퀴나드를 형성할 수 있다.

equatorial conformer의 axial position에 있는 에스테르基의 입체장애 때문에,

3-CQA로부터 락톤 형성이 4-CQA에 비해 더 잘된다.

 

• de Paulis et al. (2004) [31]는
  ⇒ 인간의 µ opioide receptor (MOR-1)를 발현하는 cell homogenates(세포 균질액)를 이용한 연구에서
  ⇒ MOR-1에 대한 synthetic 3-FQL and 4-FQL의 친연성(affinities)을 확인했다.
  ⇒ 또한 그들은 다른 synthetic CGL, 특히 4-position of the quinide의 
       cinnamoyl substituent(치환기) (i.e., 4-CQL, 3,4-diCQL, 3,4-diFQL, and 3,4- di-pCoQL)을 가진 것들이
       그렇지 않은 FQL 보다 MOR-1에 대한 더 강한 친연성(affinities)을 가진다는 것을 발견했다.
  ⇒ 사실, 인스턴트 디카페인 커피 추출물(extract)이
      쥐에서 morphine-induced analgesia (모르핀-유도된 통각상실증)
      naloxone(낼럭손, 몰핀 등의 마약에 대한 拮抗劑)의 경우에 보고된 것보다
      분량에서(at doses) 한 자릿수(1 order of magnitude) 덜  강력하게 뒤바꿀 수 있었다(reverse) [31]. 
• 주요 CGA인 5-caffeoylquinic acid가
  ⇒ 적어도 부분적으로 생물학적으로 이용가능한(bioavailable) 것으로 나타난 반면 [32-34],
  ⇒ CGL과 같은 다른 CGA 성분들이 커피 소비 후에 변하지 않고 흡수되는지 여부를 가리키는 데이터는 없다.
  ⇒ 더욱이, µ opioid receptor(오피오이드 수용체)와
      the adenosine transporter(아데노신 수송체)에서의
      이 화합물들의 in vitro affinities (생체외 친연성)이 비교적 약하다는 관점에서,
      중추신경계에서의 예리한 약리작용은
         보통의 커피 소비로부터 취해지는 CGL에 의해 만들어지지 않는 것으로 보인다.
  ⇒ 그러나, 그런 커피 성분들을 nutraceuticals(약효식품)으로 사용할 가능성은 버려져서는 안 된다. 
• 센서리 측면에서는,
  ⇒ CGL은 커피 품질의 중요한 속성인 커피 음료의 쓴맛(bitterness)에 상당히 공헌하는 것으로 발견되었다
      (35, Ginz & Enhelhardt 1995).
• 커피에서의 CGL 형성과 보급에 대한 로스팅의 효과에 관한 데이터는 제한적이다.
  상업적 표준의 결여로 그것들의 식별과 계량화를 어렵게 만든다.
  
  
• 본 논문에서 우리는 
   ┌ C. arabica cv. Bourbon; 
   ├ C. arabica cv Longberry; and 
   └ C. canephora cv. Robusta로 대표되는 두 가지 주요 種들에서
       로스팅 프로세스 동안의 CGL의 형성과 출현(prevalence)을 연구했다. 

 

 MATERIALS AND METHODS

 

 Coffee Samples.

 

• C. arabica cv. Bourbon from Brazil;
  C. arabica cv. Longberry from Ethiopia; and
  C. Canephora cv. Robusta from Uganda, 2002 crop이 commercial sources로부터 구입되었다.

 

 Roasting.

 

• 샘플들의 로스팅은
  ⇒ a Commercial Air Stream Roaster (Model 40001, Hearthware, Gumee, IL)에서 2가지로 이뤄졌음.
  ⇒ 최대 가동 온도는 230 °C.
• 로스팅 時間은
  ⇒ very light (5 min),
  ⇒ light (6 min),
  ⇒ light medium (7 min),
  ⇒ dark medium (8 min),
  ⇒ dark (9 min), and
  ⇒ very dark (10-15 min)로 나눠서 이뤄졌음.
• 焙煎度는
  the Brazilian Coffee Industries Association(ABIC)에 의해 사용되는 표준을 따라
  the Roast Color Classification System (Agtron-SCAA, 1995)과의 비교로 결정되었음.
  ⇒ disk #95 = very light roast;
  ⇒ disk #85 = light roast;
  ⇒ disk #65 = light medium roast;
  ⇒ disk #45 = dark medium roast;
  ⇒ disk #35 = dark roast; and
  ⇒ disk #25 = very dark roast.

 

 Extraction.

 

• 추출 방법
  [1] 생두를 분쇄 전에 -80 °C로 냉동.
  [2] 0.046 mm sieve를 통과하도록 분쇄.
  [3] Ky et al. [38]에 의해 최근에 검증된 Trugo and Macrae [37]의 방법을 수정한 것에 따라
       3회(in triplicate) 추출.
  [4] 분쇄커피 0.5 gram을 60mL의 40% 메탄올 수용액에 띄우고
  [5] 상온에서 300 rpm 속도로 20 min 동안 상온에서 흔들어줌.
  [6] 그 혼합물을 filter paper (Whatman No.1)로 여과시키고 물 30mL로 헹굼.
  [7] proteins와 다른 고분자화합물들의 침전을 위해,
       1mL의 Carrez’s solutions을 더해줌 - K₂Fe(CN)₆ (0.3 M) and Zn(OAc)₂ (1.0 M)
  [8] 물로 부피를 100mL로 만들어줌.
  [9] 그 혼합물을 5초간 흔들었다가 10 min 동안 세워둠.
  [10] 콜로이드 침전물들을 걸러내고(Whatman No.1), 여과된 액체를 HPLC 분석에 직접 사용. 

 

 

 Water Content.

 

• CGA and CGL per weight of dry matter의 양을 표현하기 위해,
  갓 분쇄한 콩들의 함수율이 AOAC에 따라 결정되었다 [39].

 

 Weight Loss.

 

percentual weight loss (%WL)가 다음 등식에 따라 계산되었다. 

 

 

Where, WBR = weight before roasting
             WAR = weight after roasting

 

 

 Standards.

 

• 5-Caffeoylquinic acid (5-CQA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입.
• A mixture of 3-CQA, 4-CQA, and 5-CQA를
  Trugo and Macrae [37]의 isomerization method를 사용하여 준비.
• 3-CQL, 4-CQL, 3-FQL, 4-FQL, 3-pCoQL, 4-pCoQL, and 3,4-diCQL standards를
  Wynne et al. [41] 방법의 low-temperature modification [40]를 사용하여 합성,
  hydroxyl-protected quinide와 적합한 p-coumaric, caffeic, and ferulic acid chlorides로 시작함.
• Melting points는 a Haake Buchler apparatus에서 취해졌음.
• ¹H and ¹³C NMR spectra가 CDCl₃-DMSO-d₆ (2:1) with tetramethylsilane에서 기록되었는데,
  각각 300 MHz와 75 MHz에서 가동하는 a Bruker instrument로 internal standard로 기록.
• Proton coupling constants of the cyclohexane ring는
  MestRe-C, v 2.3 (courtesy of Dr. J. C. Cobas, University of Santiago de Compostela, Spain)를 이용한
  proton spectra의 시뮬레이션에 의하여 확인되었음.
• Optical rotations는
  589 nm and a 10 cm cell (1.8 mL)에서 the sodium emission line를 사용하여
  a Rudolph Autopol III에서 기록되었음.
• 3-FQA, 4-FQA, 그리고 5-FQA는
  각각 FQL and 4-FQL로부터 합성되었는데,
  보고된 바와 같은[40] 50% aqueous tetrahydrofuran에서의 hydrolysis에 의해 합성.
• The lactones의 identity와 purity는
  proton and ¹³C NMR spectroscopy에 의해서, 그리고 HPLC에 의해서 확인되었음.
• diCQA의 경우에는,
      a mixture of 3,4-, 3,5-, and 4,5-diCQA from Roth (Germany)가 사용되었음.
  
  

 HPLC Analysis.

 

• Extracts of phenolic acids and lactones의 분석은
  ⇒ two high precision pumps (model 582, ESA, Chelmsford, MA); 
  ⇒ a UV detector (Model M 486, Waters Corp., Milford, MA), operating at 325 nm; 그리고
  ⇒ an ODS-C18 column (Rexchrom, 5 µm; 250×4.6 mm, Regis Technologies, Morton Grove, IL)
      coupled with a guard column (Rexchrom, 5 µm, 10 × 3 mm, Regis)를
     사용하는 a HPLC gradient system에 의하여 이뤄졌음.
• Chromatographic data의 기록과 통합은
  ⇒ the Easy Chrom Elite computer software (ESA)에서 수행되었음.
• The chromatographic conditions for the gradient는 다음과 같았음 :
  ⇒ Eluent A : 80% 10 mM citric acid solution,
      acidity adjusted to pH 2.5 with 6 N hydrochloric acid and 20% methanol,
      메탄올은 시스템 내에서의 기포 형성을 피하기 위해 eluent A에 이미 첨가되었음. 
  ⇒ Eluent B: methanol.
• The flow rate(流速)는 1 mL/min이었음.
• Run time : 60 min.
• The gradient program은 다음과 같았음 :   

 

 

 CQA and CGL의 식별 수행

 

• 각 standards의 retention time과 비교하여 식별
• peak identity의 확인을 위해 소량의 appropriate standards를 커피 샘플에 spike하였음.
• 5-CQA의 계량화는 the standard와 UV peak의 면적을 비교하여 수행.
• 다른 모든 CGA의 계량화는 5-CQA standard의 면적을 사용하여 수행.
• 다음과 같은 등식을 사용하여 Rubach (36)에 의해 보고된 molar extinction coefficients와 결합하여 계산.

 

where C = the concentration of the isomer in question in g L^-1 ;
           RF = the response factor of the 5-CQA standard (expressed in g L^-1 ); 
           ε1  = the molar extinction coefficient of 5-CQA; 
           ε2  = the molar extinction coefficient of the analogue or positional isomer in question;
           MR1 = the molecular weight of 5-CQA;
           MR2 = the relative molecular weight of the isomer in question; and
            A = the area of the peak of the isomer in question [31]. 

 

• Molar extinction coefficients (× 104 )은 다음과 같았음 :
       at λmax 330 nm, 5-CQA = 1.95 ;
                                   4-CQA = 1.80 ;
                                   3-CQA = 1.84 ;
                                   3.4-diCQA = 3.18 ; 
                                   3,5-diCQA = 3.16 ; and 
                                   4,5-diCQA = 3.32.
       at λmax 325 nm, 5-FQA = 1.93 ;
                                  4-FQA = 1.95;  and 
                                  3-FQA = 1.90 m-1 cm-1 [31]
• 모든 CQL standards가 analytical grade의 것이 아니었기 때문에, 
  lactones의 계량화도
  ⇒ 각 특정 lactone에서 나온 CGA의 molar extinction coefficient와 결합한 
  ⇒ the area of 5-CQA를 사용하여 수행.
      (pCoQL는 예외, molar extinction coefficients가 없으므로, 5-CQA standard의 면적이 사용되었음.)
  ⇒ Lactones의 계량화를 위해
      precursors의 molar extinction coefficients를 사용하는 것은 타당한 것으로 생각되었는데,
      그 이유는 그 lactones의 the conjugated double bonds의 UV absorbances (吸光度)가
      실제로 해당 chlorogenic acids의 것들과 동일하기 때문이다.
      High purity를 가진 lactones standards의 일부로부터 나온 결과와 비교했을 때, 
      이 방법은 적절한 것으로 나타났다. 
  

 Statistical Analysis. 

 

• HPLC 결과들은 Statistica 소프트웨어 version 6.0으로 ANOVA를 사용하여 분석되었다. 
• 차이들은 p < 0.05 일 때 유의한 것으로 생각되었다. 

 

 Detection Limit. 

 

• 본 연구에서 사용된 조건들 하에서 5-CQA의 경우 검출한계(detection limit) (4-fold baseline noise)는 0.03 µg/mL.였다.  

 

 RESULTS AND DISCUSSION

 

 Green Coffee. 

 

• 모두 9개의 CGA들이 식별되었다.
• 325 nm에서 아라비카 생두의 경우에 얻어진 전형적인 chromatogram이 Figure 2에 나와있다.
• C.arabica cv. Bourbon, C. arabica cv. Longberry, and C. canephora cv. Robusta 생두들의
  개별 CGA의 함유율은 Table 1에 나와 있다.  

 

 

• 생두 샘플들에서 가장 풍부한 CGA 그룹은 CQA였다. 
• 이는 Arabica와 Robusta 커피에서 각각 total CGA의 약 80%와 76%를 나타냈다.
• 주요 CQA인 5-CQA는 각각 62%와 56%였다. (Table 1).
• diCQA isomers가 그 다음으로 세번째로 풍부한 CGA였다.
• Total diCQA는 Arabica와 Robusta 샘플들에서 각각 total CGA의 15%와 18%를 나타냈다.
• FQA의 total levels는 Arabica와 Robusta 커피에서 각각 5.2%와 6.2%를 나타냈다.
• arabica 커피 생두에서 CQA와 diCQA의 total contents는 각각 8.9%와 8.4%였고, 
  Bourbon에서보다 Longberry에서 더 높았다.
• 두 arabica 품종들에서 FQA의 total content 간에는 유의한 차이가 없었다.
• Robusta 커피 생두에서의 total CGA content가
  arabica 품종들에서의 average CGA content 보다 25% 더 높았다.
• C. arabica and C. canephora에서의 CGA의 contents 간 차이는 널리 보고되어져 왔다 [2, 10, 45].
• 아라비카 커피 생두에서 식별된 lactones는 없었다.
  그러나, 로부스타 생두에서는 소량의 FQL and diCQL가 식별되었다.
• Hucke and Maier [46]는
  gas chromatography에 의해 커피 생두의 분석에서 어떠한 lactones도 발견하지 않았지만,
  Schrader et al. [47]은 4-CQL을 발견했다.
• 생두에서의 lactones의 존재는 1차 프로세싱 동안의 heating 때문일 수도 있다. 

 

 

 Roasted Coffee. 

 

• 샘플들은 5~15 min 동안 로스트 되었다.
• 커피 로스팅 프로세스 동안 loss of CGA는 이미 설명된 바 있었다 [45-49].
• 로스팅 프로세스의 고온이
  CGA의 carbon-carbon bonds의 파손(breakage)을 유발하며,
  isomerization and degradation를 초래한다.
• After 5 min of roasting (∼7% weight loss),
  ⇒ 5-CQA의 levels는 상당히 감소했고, 반면에
  ⇒ 3-CQA와 4-CQA의 levels는 그들의 본래의 값들보다 2배까지 증가했다.
• 이런 행태는 FQA에서도 관찰되었다.
• 이는 Trugo and Macrae [37]와 Leloup et al. [43]가 이미 관찰한 바와 같이,
  isomerization of CGA가 로스팅 초기에 발생한다는 증거이다.
• 또한, isomerization에 더하여
  diCQA의 monoester derivatives로의 partial hydrolysis(부분적 가수분해)가 발생한다는 것이 가능하다 [43]. 
• Total CGA amount의 첫 상승이 로스팅 5분에 관찰되었다.
  ⇒ 이는 열에 더욱 민감한 다른 화합물들의 손실이 나머지 것들의 levels에서의 상대적 상승을 유발한
      결과일 수도 있다.
  ⇒ Longer periods of roasting은 loss of total CGA를 초래했다.
  ⇒ isomerization and degradation 외에도 다른 화학적 변환들이 발생할 수도 있으며,
      주로 quinic acid moiety의 dehydration과 그리고
      a lactone ring의 형성일 수도 있을 것이다 [24] (Figure 1).
• quinic acid ((R,R,S,R)-1,3,4,5-tetrahydroxycyclohexane1-carboxylic acid)의
  six-membered ring으로부터 water molecule의 제거(elimination)는
  lactones를 형성하는 hydroxyl and carboxyl groups의
  a syn-1,3-diaxial configuration을 필요로 하기 때문에,
  quinic acid의 5-position에서의 a cinnamoyl substituent이 결여된
  isomers만이(i.e., 3-CQA and 4-CQA)
  로스팅 동안에 1,5-quinide를 형성할 수 있다.
• 이런 모든 변화들이 발생하는 속도는 로스터 내부의 temperature와 콩의 양에 의존한다.  
• Roasted coffee에서는
  ⇒ 생두 샘플에서 식별된 9개의 CGA에 더하여, 7개의 CGL이 식별되었다.
  ⇒ CGL은 로스팅 시작 약 7 min 후에 maximum level에 도달했다
      (i.e., light medium roast equal to ∼14% weight loss).
  ⇒ 더 긴 로스팅 시간들은 더 적은 량들의 CGA와 CGL를 초래했다.
  ⇒ light medium roasted coffee에 존재하는
      CGA and CGL의 전형적인 HPLC chromatogram가 Figure 3에 나타나 있다.
  ⇒ 그들의 화학 구조들은 Figure 4에 나와 있다. 

 

 

Figure 4. 배전커피의 클로로겐산 락톤들과 그것들의 전구물질들의 구조.
                괄호 내 숫자들은 크로마토그램 (Figure 3)에서 식별된 피크들을 가리킴.

 

 

• Arabica 재배품종들이, Bourbon 품종에서 pCoQL이 다른 화합물(들)과 함께 용출한 것으로 보이는 한 경우만 제외하고는 lactones의 가장 명료한 식별과 계량화를 제공했다.
• Robusta 커피는 arabica 커피보다 phenolic compounds가 더 풍부하기 때문에 [10, 44, 45],
  lactones의 분리(separation)가 coelution 때문에 더 어렵다.
• CGA and CQL의 용출 순서는 Schrader et al. [47]에 의해 보고되었던 것과 비슷했다.
  그들은 특징 분석을 위해 mass spectrometry, NMR spectroscopy, 그리고 LC-MS를 사용했다.
  예외는 3-CQL이었는데, 우리 column에서는 5-FQA와 4-FQA 전에 용출되었다.
• 샘플들을 synthetic standards으로 그리고 green coffee extract로 spiking하여
  Schrader et al.에 의해 사용된 것과 약간 다른 selectivity를 가진 a reverse phase column를 사용하여
  CGA와 CQL을 구분할 수 있었다.
  분명히 이들 7개의 CGL은 싱글 HPLC 분석에서 종전에는 분리된 적이 없었던 것들이다. 
       
  
• Arabica와 Robusta 생두와 로스트 샘플들의 개별 CGA and CGL의 함유율들이
  각각 Tables 1과 Table 2에 나와있다.
  C. arabica (average)와 C. canephora의 경우
  ⇒ total CGL의 maximum amount는 398 and 424 mg/100 g of coffee이었는데
  ⇒ 이는 arabica와 Robusta 생두 샘플에서의 total CGA의 contents 7.3%와 5.6%에 상응한다.
  ⇒ Arabica와 Robusta 커피들 간의 이 차이는
      Robusta가 arabica 보다 28% 더 높다는 것을 생각하면 기대한 만큼 높은 것은 아니다.
  ⇒ 이 사실은 Bennat et al. [48]에 의해 CQL의 경우에 관찰된 적이 있었다.
  ⇒ 비록 Longberry 생두에서의 CGA의 total amount (5,690 mg/100 g)가
      Bourbon (5,172 mg/100 g)에서보다 더 높았지만,
      Bourbon 품종에서의 lactones의 total maximum amount (427 mg/100 g)는
      Longberry 품종에서(383 g/100 g) 보다 더 높았다.
  ⇒ 그러나, the precursors의 total amounts의 경우에,
      CGL formation의 경우 해당 precursors의 contents가
      Bourbon (1331 mg/100 g)이 Longberry(1,244 mg/100 g) 보다 더 높았다. 

 

 

 Table 2 브루봉, 롱베리, 로부스타 커피 생두 및 배전커피의 클로로겐산 락톤 함량. 

 

• Table 2 Bourbon과 Longberry 품종들에서의 lactone 함량들은
  그들의 precursors의 32%와 31%에 각각 해당된다.
• Table에서 minor CGL을 제외한 것을 감안하고, Robusta 샘플에 대한 비슷한 평가에서,
  total CQL의 maximum amount은 해당 precursors의 26%에 상당하는 것이었다.
• 이는 두 종들에서의 퍼센트들을 더 가까이 만들어주지만, 
  Robusta 커피에서의 lactone formation의 더 낮은 퍼센트의 발생은 여전히 설명되어야 한다.  
• At a 10 min or longer time of roasting (i.e., dark roast equal to >20% weight loss),
  ⇒ total CGA와 CGL의 amounts는 그들의 maximal 값들의 5.2%와 20% 미만으로 감소했다.
  ⇒ 대부분의 CGA는 11 min 후에 검출될 수 없었고
  ⇒ 미량의 CGL만이 15 min 후에 검출될 수 있었다. 

 

 Caffeoyl-1,5-lactones (CQL). 

 

• roasted coffee에서의 3-CQL and 4-CQL의 식별과 계량화는 이미 보고된 바 있다 [47, 48].
• 비록, 커피 내의 3가지 주요 CGA가 5-CQA, 3-CQA, and 4-CQA이지만, 
  quinic acid의 5-position에 substituent를 가지지 않은
  뒤의 두 가지 화합물들만이 1,5-lactone을 형성할 수 있다 (Figure 1).
• 그러므로, 3-CQL and 4-CQL이 roasted coffee extracts 내에서의 주요 lactones일 것으로 기대되며,
  이는 본 연구에서 확인되었다.
• 3-CQL이
  ⇒ 모든 샘플들에서 가장 풍부한 lactone이었고,
  ⇒ 이는 로스팅 7 min 후에서의 그 최대 량에 도달했다 (Table 2).
  ⇒ 7분 (i.e., light medium roast (249±9 mg; 211±9 mg ; and 254 mg±4 mg/100 g coffee
             for C. arabica cv Bourbon, C. arabica cv. Longberry, and C. canephora cv. Robusta,
             respectively)
• 4-CQL은
  ⇒ 두번째로 높은 량을 보였는데,
  ⇒ 로스팅 7 min 후에서 역시 최대 량에 도달했다.
  ⇒ 7분 (115±1 mg; 116±5 mg; and 139±2 mg/100 g coffee, respectively).
• 이런 lactones의 레벨들은
  ⇒ Schrader et al. [47] 뿐만 아니라 Bennat et al. [48]에 의해 보고된
      상업용 커피 브랜드들에 관한 분석의 경우와 일치하는 것이었다. 

 

 Caffeoyl-1,5-lactones (CQL). 

 

• 로스팅 7 min에서의 3-CQL과 4-CQL의 평균 량은 ⇒ 커피 생두의 평균 CGA의 37%와 23%에 해당했다.
• light medium roast에서
  ⇒ precursor 4-CQA의 양이 arabica 생두 샘플에서 3-CQA보다 더 높았더라도 
      CGL이 그들의 maximum levels에 달했을 때, 
  ⇒ 3-CQL and 4-CQL 간에 65:35 ratio이 관찰되었고,
      이는 Bennat et al. [48]에 의해 관찰된 60:40 비율과 비슷했다.
• Robusta 샘플에서의 3-CQL/4-CQL의 ratio는 68:32였다.
• 4-CQL에 비해 더 높은 3-CQL의 비율들은
  ⇒ 3-CQL은 4-CQL로부터도 생성된다고 가정함으로써 설명될 수 있을 것이다.
• 4-CQL의 형성 동안에, 
  ⇒ 4-CQL의 cyclohexane ring의 axial chair conformer(배좌이성체)로부터 물 분자의 제거가 발생한다.
  ⇒ the axial conformer의 elimination 때문에,
       the equatorial and the axial chair conformers 사이의 equilibrium은
       대부분의 4-CQL이 변환될 때까지 이동되는 경향이 있다.
• 3-CQL와 4-CQL 두 가지 모두가 그들의 해당 precursors로부터 형성이 된 후에, 
  ⇒ 4-CQL은 caffeoyl substituent의 분자내 이동(intramolecular migration)을 겪는다. 
  ⇒ 그 caffeoyl moiety의 carbonyl group은 the quinide의 3-position에 있는 hydroxyl group으로
       intermediate five-membered orthoformate ring을 형성할 수 있다 (Figure 6).
• 이 ring의 bonds의 파열(breaking)은
  ⇒ 그 two oxygen atoms 중 어느 하나에서 발생할 수도 있을 것이다.
  ⇒ 만일, 파열이 the 4-position에 있는 caffeoyl carboxylic carbon atom과 quinide oxygen atom 사이에서
      발생한다면, 그 중간물은 4-CQL이 되며, 그리고 그 프로세스는 반복한다.
  ⇒ 그러나, 만일 3-position에서의 bond가 파열되면, 중간물은 3-CQL로 변환된다.
  ⇒ 이 프로세스는 가역적이지만(reversible),
       3-CQL에 있는 caffeoyl group의 equatorial conformation(수평방향 배좌)이 
       4-CQ의 axial conformation(축방향 배좌) 보다 에너지 상으로 더 선호된다.
• 나아가, 4-CQL의 4-substituent의 axial configuration 때문에, 
  ⇒ lactone 형성에 필요한 cyclohexane ring의 conformation(배좌)는
      3-CQL의 그것에 비해 덜 선호된다 (Figure 1).
• 결과적으로 3-CQL이 roasted coffee에서 지배적인 lactone이다. 

 

Figure 5.  로스팅 동안의 락톤의 형성 

 

Figure 6.  4-CGA의 열로 인한 전위에 의한 3-CQL의 형성 

 

 

 

 

 

 Feruloyl-1,5-lactones (FQL). 

 

• FQL의 발생은 roasted coffee의 fractions에서 선행연구들에서 이미 기술된 바 있다 [26, 27].
• 우리는 2개의 major feruloyl-1,5-lactones인,
            3-FQL과
            4-FQL을 식별했고 계량화하였다.
• 이 화합물들의 가장 높은 량은 역시 roasting 7 min에 발생하였고
  CQL의 경우에 관찰된 것과 같은 패턴이 FQL의 경우에서도 관찰되었다.
• 비록, 4-FQA의 량이 세 가지 샘플들 모두에서 3-FQA의 양 보다 더 높았지만,
  3-FQL은 major FQL이었다.
• Bourbon과 Longberry 샘플들의
  3-FQL의 maximum levels가 29.8과 29.7 mg/100 g이었고,
  4-FQL의 maximum levels는 13.4와 11.6 mg/100 g이었다.
• 3-FQL은 Robusta 샘플에서는 계량화될 수 없었는데,
  이는 다른 peaks(s)와 그것의 동시 용출(coelution) 때문이었다.
• 3-FQL와 4-FQL의 형성은
  arabica 샘플에서 3-FQL and 4-FQL 간의 비율 70:30이 증명하는 바와 같이
  CQL의 형성을 거울처렴 보여주었다.   

 

 

 p-Coumaroyl-1,5-lactones (pCoQL). 

 

• Roasted coffee에서의 pCoQL 발생은 선행 연구들에서 보고된 적이 없으며, 
  이는 아마 매우 소량으로 존재하기 때문일 것이다.
• Precursors pCoQA가
  ⇒ green과 roasted 커피 모두에서 minor CGA인 것으로 알려져 있고 [2, 29], 
  ⇒ 그 양은 green arabica와 Robusta 커피의 경우에 전형적으로 각각 70 mg/100 g과 50-60 mg/100 g이다 [28].
• Roasting 7 min 후에, Bourbon과 Longberry 샘플들의
  ⇒ 3-pCoQL total amounts는 각각 7.5 mg과 4.4 mg/100 g of coffee이었다.
  ⇒ 4-pCoQL total amounts는 각각 7.8 mg과 2.6 mg/100 g of coffee이었다.
• 로스팅 프로세스 동안에, 많은 2차적 화합물들이 형성된다.
• Robusta coffee는 minor unidentified phenolic compounds이 풍부하고, 
  그리고 이 크로마토그래픽 조건들에서는, 
  ⇒ 3-pCoQL and 4-pCoQL을 계량화하는 것이 불가능했고
  ⇒ 이들은 다른 화합물들과 함께 같이 용출되었다.
• Roasted Longberry 콩들에서는 
  ⇒ 3-pCoQA and 4-pCoQA 간의 비율 63:37이 관찰되었는데, 
  ⇒ 이는 CQL의 경우에 관찰되었던 패턴을 따른다.
• 그러나, 이 비율은 Bourbon 품종에서는 보이지 않았는데,
  ⇒ 이는 3-pCoQL 또는 both pCoQL의 계량화가
      Robusta coffee의 경우에서와 같이,
      다른 minor compounds와의 공동 용출(coelution) 때문에 confounded되었었을 것이다. 

 

 

 3,4-Dicaffeoyl-1,5-lactone (3,4-diCQL).

 

• Bourbon and Longberry 품종들에서의 
  3,4-diCQL의 maximum amount는 ⇒ 6.6 and 7.8 mg/100 g of coffee이었다.
  이들은 생두에 존재하는 precursor 3,4-diCQA의 량의 2.8 and 3.3%에 각각 해당한다.
• 로스팅 7 min 후에  역시, Green Robusta coffee가
  ⇒ 25.4 mg/100 g of coffee의 maximum value에 도달했다.
• 로부스타 생두 샘플은 이미 소량의 3,4-diCQL을 함유하고 있는 것으로 보였다.
• 본 연구는 CGL의 형성이 배전도에 고도로 의존적이라는 것을 보여준다.
• 커피내 lactones의 maximum amount에 도달하는
  ⇒ 최적 배전도는 light medium roast (∼14% weight loss)인 반면,
  ⇒ darker roasts는 더 낮은 량들을 낳는다.
• CGA의 유리한 구조적 구성들에도 불구하고, 
  ⇒ green coffee 내의 10% 미만의 total CGA와 약 30%의 가능한 precursors가 lactones로 전환되었다.
• 생두 내에서 3-CQA에 비해 더 높은 량의 4-CQA에도 불구하고,
  ⇒ 3-CQL가 major lactone이었고 그 다음이 4-CQL이었다.

 

사람들에서의, 보통 및 높은 커피 소비 모두의 경우에서,
이들 화합물들의 bioavailability와 physiological effects가 결정되어야 할 필요가 있다.

추가적으로, 홈 커피 마련을 위해 사용되는 hot water extraction 방법이 이론적으로 
본 연구에서 얻어진 것보다 더 적은 량의 lactones를 추출하는 경향이 있을 것이라는 사실이
커피 준비 조건들의 효과에 관한 추가적인 탐구의 필요성을 제기한다. 

 

 

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