Mozambioside : 아라비카-特異的 쓴맛 푸로카우란 配糖體

 

 ABSTRACT

• モザンビオシドはコーヒー豆中のアラビカに特異的な苦味 Furokaurane 配糖体である.
  모잠바이오사이드는 커피 콩 중에서 아라비카에 特異的 苦味 Furokaurane 配糖体이다. 
• 로스팅된 커피 음료의 센서리-유도적 분획 분석(fractionation) 결과, 극성이 높고(highly polar) 쓴맛이 나는 하위 분획(subfraction)이 확인되었으며, 이 분획에서 푸로카우란 글루코시드(furokaurane glucoside)인 모잠바이오사이드(mozambioside)가 분리되었고, HDMS와 NMR 스펙트럼을 통해 화학 구조를 확인했다. 
• 관능평가 결과, 쓴맛 認知 識閾値(threshold)는 60 (±10) μmol/L였다. 
• 커피 생두의 UPLC-HDMS 정량분석 ​​결과, 아라비카 커피는 396~1188 nmol/g의 모잠바이오사이드(mozambioside)를 함유한 반면, 로부스타 커피에서는 극소량(<5 nmol/g)만 검출되었다. 
• 이는 모잠바이오사이드가 아라비카 커피의 분석 지표로 사용될 수 있음을 시사한다.
• 로스팅된 아라비카 커피는 모잠바이오사이드의 농도가 상당히 감소(232±37 nmol/g)하였는데, 이는 커피 로스팅 과정에서 모잠바이오사이드가 부분적으로 분해되었음을 나타낸다. 
• 모잠바이오사이드는 커피 메이킹 중에 물 추출액(aqueous brew)에서 거의 정량적으로 추출되었다 (86~98%).

 

Contents 

 

■ INTRODUCTION
■ MATERIALS AND METHODS
	Chemicals and Materials.
	Solvent Fractionation of Coffee Brew.
	Subfractionation of the Fraction C.
	Isolation and Purification of Compounds 1−3 from Raw Coffee Extract.
	Sensory Analyses.
	Ultraperformance Liquid Chromatography−High-Definition Mass Spectrometry (UPLC-HDMS).
	Screening by UPLC-HDMS (ESI±) Analysis.
	Targeted Quantitation of Mozambioside in Coffee.
	Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR).
	Calculations.
■ RESULTS AND DISCUSSION
	Identification of Bitter Key Tastant in Subfraction C11.
	Sensory Analysis.
	Quantitation of Mozambioside (3) in Raw and Roasted Coffee Beans
■ REFERENCES

 

 ■ INTRODUCTION

 

• 갓 내린 커피는 자극적인 효과 외에도 매력적인 아로마와 뿐만 아니라 쓴맛(苦味, bitterness)과 신맛(酸味, sourness)을 중심으로 한 특유의 맛(taste)으로 전 세계 소비자들에게 사랑받고 있다.
  볶은 커피의 휘발성 물질 부분은 수천 가지 성분으로 구성되어 있지만, 단일 휘발성 성분만으로는 대표되지 않는 커피 특유의 향에 대한 진정한 지각을 창출하는 데는 약 30여 가지의 휘발성 성분만이 필요충분한 것으로 밝혀졌다. 
  이러한 휘발성 성분은 단일 휘발성 성분만으로는 표현되지 않는다. [1-3]
  반대로, 커피의 전형적인 쓴맛을 담당하는 주요 성분에 대한 지식은 아직 단편적이다.
  
• 카페인과 함께, 순차적 용매 추출법(sequential solvent extraction)을 이용한 
  볶은 커피의 관능-유도 분획(sensory-guided fractionation), 
  후속 preparative RP-HPLC, 그리고 
  추출물(extracts)에 대한 센서리 분석을 통해 
  볶은 커피 음료의 쓴맛을 내는 핵심 화합물들로서 
  일단의 다소 疏水性인 성분들(hydrophobic components)이 확인되었다. [4]
• 190 μmol/L for cyclo(Leu-Phe)과
  최대 >8000 μmol/L for cyclo(Gly-Gly) 사이의 쓴맛 역치(bitter taste thresholds)를 갖는 것으로 오랫동안 알려져 온 2,5-diketopiperazines [5,6] 외에도,
• LC-MS/MS 및 1D/2D NMR을 통해 9.8~180 μmol/L의 역치 농도 이상에서 쓴맛을 내는
  일련의 mono- and dicaffeoyl quinides (모노카페욜 퀴나이드, 디카페욜 퀴나이드)가
  약배전에서 중배전 커피의 쓴맛 자극제로 식별된 바 있다. [4,7]
• 모델 실험 결과, 이러한 퀴나이드(quinides)는 
  로스팅 과정에서 해당 클로로겐산(chlorogenic acids)의 에피머化(epimerization) 및 락톤化(lactonization)에
  의해 생성되는 것으로 밝혀졌다. [4,8]
• 로스팅 시간 및/또는 온도가 증가함에 따라, 카페욜 퀴나이드(caffeoyl quinides)는
  반응성이 높은 일시적인 중간체인 4-비닐카테콜(4-vinylcatechol)을 분해하여 유리시키고,
  이 4-비닐카테콜은 더 나아가 올리고머化되어
  ■ 1,3-bis(3′,4′-dihydroxyphenyl)butane,
  ■ trans-1,3-bis(3′,4′-dihydroxyphenyl)-1-butene, 그리고
  ■ a series of multiply hydroxylated phenylindanes을 생성한다. 
• 이 모든 물질은 23~178 μmol/L 이상의 역치에서 목구멍에
  오래 지속되는 거친 쓴맛(long-lasting harsh bitter taste)을 유발한다.[9,10]
• 최근, 쓴맛 인지 역치가 100~537 μmol/L인 일련의 쓴맛이 나는
  ■ (furan-2-yl)methylated benzene diols and triols가 로스팅된 커피에서 발견되었고,
  피로갈롤(pyrogallol),
  하이드록시하이드로퀴논(hydroxyhydroquinone),
  카테콜(catechol) 또는
  3- and 4-methylcatechol과
  푸르푸릴 알코올(furfuryl alcohol)의 반응으로
  형성될 수 있다는 것이 적절한 모델 반응을 통해 입증되었다.[11]
  
  
• 커피 추출액(brews)로부터 마련된 에틸 아세테이트 추출물(ethyl acetate extract)에서 
  이러한 폴리페놀-유래 쓴맛 화합물들이 모두 식별되었지만, 
  남은 수용액 층에서는 여전히 뚜렷한 쓴맛이 느껴졌다. 
• 그러나 이러한 쓴맛을 유발하는 화합물들은 찾기 힘든 채로 남아 있다(아직 다 밝혀지지 않았다).
• 본 연구의 목적은
  수용액 커피 분획물의 맛 활성 기반 하위 분획화(taste-activity driven subfractionation)를 통해
  그 극성 쓴맛 화합물(polar bitter compounds)을 찾아내고,
  화학 구조를 규명하며,
  맛 인지 역치 농도(taste recognition threshold concentrations)를 결정하는 것이었다.
  마지막으로, 커피 샘플에서 확인된 극성 쓴맛 화합물들을 정량적으로 분석하는 것을 목표로 했다.
  

 

 ■ MATERIALS AND METHODS

 

Chemicals and materials.

 

• 화학 물질 및 시약은 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)에서 구입했다.
• 솔벤트들은 HPLC 등급의 것들이었다 (J. T. Baker, Deventer, The Netherlands). 
• 물은 Milli-Q apparatus 정수기에 의해 준비되었다 (Millipore, Schwalbach, Germany).
• NMR를 위한 중수소화된 솔벤트(Deuterated solvents)는 Euriso-Top의 제품을 사용했다 (Giv sur Ivette, France). 
• 커피 생두와 복은 커피 가루는 커피 업계로부터 획득되었다. 
• 맛 식역치(taste thresholds)의 결정은 생수로 수행되었다 (Evian, low mineralization). 
• Filter 커피액은 볶은 가루 커피(48 g in a size 4 filter paper)와 수돗물(900 mL)로 가정용 커피 메이커를 사용하여 준비되었다.
• Boiled 커피는 커피 파우더 (50 g)와 물(1 L)를 가열하여 끓을 때까지 저어주면서 마련되었다. 
• French press 커피는 커피 파우더 (50 g)와 끓는 물(1 L)로 프렌치 프레스 기구를 사용하여 마련되었다. 
• 동결건조된(lyophilized) 커피생두 추출물은 문헌에 나와 있는 대로 준비되었다 [12]. 
• 2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin (1)의 레퍼런스 재료는 최근에 보고된 바에 따라 커피 생두로부터 분리되었다 [13]. 

 

 

Solvent Fractionation of Coffee Brew.

 

• 갓 추출한 필터 커피 브루(500mL)의 일부를 실온으로 식혔다.
• 그 커피액을 디클로로메탄(dichloromethane) (3×300mL)과 에틸 아세테이트(ethyl acetate) (3×300mL)로 순차적으로 추출했다.
• 디클로로메탄 분획(A)과 에틸 아세테이트 분획(B) 및 잔류 水層(C)을 진공 상태에서 용매로부터 분리하고 두 번 동결 건조했다. 모든 분획(fractions)의 쓴맛을 관능 실험을 통해 평가했다 (아래 및 Table 1 참조).
  
  

 

 

Fraction C. Subfractionation of the Fraction C.

 

• 수용성 동결건조물(fraction C)의 일부(Aliquots)을 물(50 mg/mL)에 녹이고
  플래시 크로마토그래피 (flash chromatography) (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Switzerland)를
  이용하여
  Luna phenyl-hexyl 컬럼(100×26 mm, 12 μm, Phenomenex, Aschaffenburg, 독일)으로 분리했다. 
• 시료 주입(5 mL) 후, 포름산(formic acid) 수용액 (물 중 0.1%, 용매 A)과 메탄올(용매 B)의 농도 gradient를
  사용하여 크로마토그래피를 수행했다 :  
  99% 솔벤트 A로 3분간 등용매 용리(isocratic elution)한 후,
  솔벤트 B를 30분 이내에 1%에서 100%로 증가시킨 후,
  10분 동안 100% 솔벤트 B로 컬럼을 플러싱했다.
• 유출액(40 mL min-1)을 UV detector (280 nm)로 모니터링하고
  유리관(50 mL)에 수거하여 총 13개의 분획을 얻었다 (Table 1).
• 진공 상태에서 용매를 제거한 후,
  각 분획을 두 번 동결 건조하여 관능 실험 및 UPLC-HDMS (ESI±) 분석에 사용했다.

 

Isolation and Purification of Compounds 1−3 from Raw Coffee Extract. 

 

• 동결 건조된 aqueous raw coffee extract (코페아 아라비카, 100 g)을 
  메탄올(300 mL)과 함께 하룻밤 동안 교반하였다. 
• 메탄올 용액을 수거하여,
  그 잔류물을 뜨거운 물(50 mL, 60 °C)에 현탁시킨 후
  메탄올(300 mL)을 첨가하여 재추출하였다. 
• 그 혼합물을 1시간 동안 교반하고 여과한 후, 두 추출물을 합하여 증발시켰다. 
• 잔류물을 물(100 mL)에 녹이고 4 °C에서 하룻밤 동안 방치하였다. 
• 침전된 카페인은 여과하여 제거하였다. 
• 그 여과액의 분취량(20 mL)을
  25~40 μm LiChroprep 물질(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)로 채워진
  150×70 mm 유리 컬럼에서
  플래시 크로마토그래피 (Sepacore MPLC system, Büchi Labortechnik AG)로 분리했다. 
• 이때 용매는
  acetonitrile (솔벤트 A)과 포름산 수용액(aqueous formic acid)(물 중 0.1%, 솔벤트 B)이며
  유속은 40 mL min−1이다. 
• 솔벤트 A는 10분 이내에 5%에서 10%로 증가한 다음
  30분 이내에 40%로 증가되었다.
• 다음 주입 전에 컬럼을 솔벤트 A (10분)로 헹구고 5% acetonitrile  (20분)로 전처리했다.
• 유출액(effluent)은 202 nm에서 모니터링하고,
  분획들(fractions) (각 40 mL)을 유리 튜브에 수거했다.
• 수거된 fractions에 대한 MS screening (루프 주입 loop injection) 결과,
  화합물 1~3이 fractions 24~28 (960-1120 mL)에 존재하는 것으로 나타났으며, 이를 합쳐서 증발시켰다.

 

BUCHI Sepacore Easy Purification Systems

 

• 미정제 잔류물을 물(8 mL)에 녹인 후, 
• acetonitrile (솔벤트  A)과 포름산 수용액 (물 중 0.1%; 솔벤트 B)을 용매로 쓰는
  250×21.4 mm, 5 μm Hyperclone RP18 컬럼(Phenomenex, Darmstadt, Germany)으로
  preparative HPLC에 의해 분리하였다. 
• 15% 솔벤트 A로 5분간 등용매 용리(isocratic elution)한 후,
  솔벤트 A 농도를 30분 이내에 30%까지 선형적으로 증가시키고,
  100% 솔벤트 A로 5분간 세척한 후, 15% 솔벤트 A로 10분간 재처리하였다.
• 202nm에서 검출된 피크를 따로 수집하여
  MS로 타겟 화합물 1-3 (loop injection)을 확인하고,
  진공 상태에서 용매로부터 분리한 후,
  두 번 동결건조하여
• (1) 2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin (글루코피라노실-아트락틸리게닌),
  (2) 4,5-dicaffeoylquinic acid (디카페욜퀴닉산),
  (3) mozambioside (모잠바이오사이드)를 얻었으며,
• 그 구조는 mass spectrometry와 1D/2D NMR spectroscopy를 통해 확인되었다.

2-O-β-D-Glucopyranosyl-atractyligenin, 1. 

• HDMS 데이터가 Table 2 (그리고 Supporting Information의 Figure S1)에 나와있다. 
• ¹H and ¹³C NMR 데이터와 HDMS 데이터가 최근에 보고된 데이터와 일치하였다 [13]. 
• H−C17a 그리고 H−C17b의 경우에 관찰된
  ¹H NMR signals의 적분들(integrals)이 순도 계산(purity calculation)에 사용되었다. 

4,5-Dicaffeoylquinic acid, 2.

• HDMS 데이터가 Table 2 (그리고 Supporting Information의 Figure S1)에 나와있다.
• ¹H and ¹³C 데이터는 Supporting Information로 제공된다. 
• H−C4의 경우에 관찰된 ¹H NMR signals의 적분들이 순도 계산에 사용되었다. 

 

Mozambioside,  11-(β- -Glucopyranosyl)-cafestol-2-one,  3.

• HDMS 데이터가 Table 1에 나와 있다 (그리고 Supporting Information의 Figure S1에). 
• ¹H NMR (d₄-MeOD, 500 MHz): δ 0.88 (3H,s, H-20),1.35 (1H, d, J = 14.7 Hz, H-15), 1.65 (1H, m, H-6), 1.73−1.87 (5H, m, 2 × H7, H-12, 2 × H-14), 1.89 (1H, s, H-9), 2.05 (1H, m, H-6), 2.09 (1H, m, H-13), 2.26 (1H, d, J = 14.7 Hz, H-15), 2.35 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-12), 2.46 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-1), 2.78 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-1), 2.90 (1H, dd, J = 12.5, 1.7 Hz, H-5), 3.18 (1H, dd, J = 8.0, 8.1 Hz, H-2′), 3.24−3.34 (2H, m, H-4′, H-5′), 3.37 (1H, m, H-3′), 3.67 (1H, m, H-6′), 3.79 (1H, d, J = 12 Hz, H-17), 3.92 (1H, m, H-6′), 3.92 (1H, m, H-11), 4.28 (1H, d, J = 12 Hz, H-17), 4.34 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1′), 6.60 (1H, d, J = 1.4 Hz, H-18), 7.79 (1H, d, J = 1.4 Hz, H-19).
• ¹³C NMR (d₄-MeOD, 125 MHz): δ 16.1 (CH3, C-20), 23.6 (CH2, C-6), 35.4 (CH2, C-12), 38.2 (CH2, C-14), 41.5 (CH2, C-7), 44.1 (C, C-8), 45.1 (C, C-10), 45.9 (CH2, C-5), 46.1 (CH, C-13), 51.6 (CH2, C-15), 54.5 (CH2, C-1), 59.5 (CH, C-9), 62.9 (CH2OH, C-6′), 67.7 (CH2OH, C-17), 71.9 (CHOH, C-4′), 74.5 (CHOH, C-11), 75.5 (CHOH, C-2′), 77.9 (CHOH, C-5′), 78.5 (CHOH, C-3′), 83.8 (C, C-16), 103.2 (CH, C-1′), 111.5 (CH, C-18), 144.8 (C, C-4), 148.2 (C, C-3), 150.5 (CH, C-19), 187.7 (C, C-2). 
• H−C18 그리고 H−C19의 ¹H NMR signals의 적분들(integrals)이 순도 계산에 사용되었다.  

 

Sensory Analyses.

 

• 각 테스트 샘플은 블라인드 처리 후, 
  21°C의 지정된 관능실에서 적색광이 비추는 코드화된 시험관에 담아 제공되었다.
• 모든 센서리 데이터는 터치스크린을 통해 기록하고
  FIZZ 소프트웨어(Biosystème, Couternon, France)를 사용하여 계산했다. 
• 분석 전에, 분획물들(fractions)과 정제된 화합물은 용매와 버퍼 화합물들이 거의 없음을 분석적으로 확인했다.[14,15]
• 후각 자극과의 cross-modal 상호작용을 방지하기 위해, 패널리스트들은 코 클립을 사용했고,
  센서리 세션은 에어컨이 설치된 21°C의 실내에서 진행했다.
• 패널리스트들은 맛본 후 시험 용액을 삼키지 않고 뱉아 내도록 권고 받았다.

Descriptive Sensory Analysis of Aqueous Subfractions.

• C1~C13의 개별 분획물들을 생수에 천연 농도로 용해하여 별도의 세션(각각 2회 반복)으로 평가했다.
• 패널들은 주어진 설명어 “sour”, “bitter”, 그리고 “astringent”와 “none of these”을 이용해
  특정 분획물의 주된 맛을 표시하도록 요청 받았다.
• 단일 분획물에 대한 총 응답수와 각 설명어의 개수를 사용하여,
  주어진 분획물에 대해 특정 설명어를 주된 맛으로 잘못 선택하는 제1종 오류를 계산했다.
• 센서리 데이터(p 값)는 시각적 명확성을 위해 (1 - p 값)으로 표시했다 (Figure 1).

Panel Training and Bitter Threshold Determination [16]

• 본 연구의 센서리 테스트에 참여하기로 동의하고 
  알려진 미각 장애 병력이 없는 
  12명의 센서리 패널리스트(여성 6명, 남성 6명, 연령 24~37세)는 
  카페인 농도가 증가함에 따라 (0.062~2mmol/L) 
  3-alternative forced choice (3AFC)을 사용하여 쓴맛을 평가하도록 훈련 받았다. 
• 각 3AFC 시험에서 패널리스트들은
  두 개의 빈 샘플 중 하나의 쓴맛 샘플을 감지하도록 요청 받았다. 
• 개별 역치(threshold)는
  각 패널리스트의 첫 번째 잘못된 선택과 마지막 올바른 선택의 기하 평균(geometric mean)을 계산하여 결정했다. 
• 개별 카페인 역치의 기하 평균은 카페인 패널 역치를 결정하는데 사용되었다 (Table 3).
• 각 테스트 화합물의 순도(purity)를 ¹H NMR과 HPLC-MS로 확인한 후, 
  1-3을 생수(1000 μmol/L)에 용해했다. 
• 용액을 물로 1+1 단계로 희석하여 최종 농도가 62.5~1000 μmol/L가 되도록 했다. 
• 이후 12명의 패널리스트가 카페인에 대해 위에서 설명한 바와 같이 평가했다.
• 또한, 화합물 3은 10~200 μmol/L 범위에서 두 차례에 걸쳐 센서리 평가를 실시했다.
  
  

 

 

 

Ultraperformance Liquid Chromatography−High-Definition Mass Spectrometry (UPLC-HDMS). 

 

• Acquity UPLC 시스템(Waters, Milford, MA, USA)을
  ESI ± 모드로 작동하는
  Waters Synapt G2S HDMS mass spectrometer (Waters, Manchester, UK)에 연결했다.
• 괄호 안에는 기기 설정이 명시되어 있다:
  capillary voltage 모세관 전압(±3 kV),
  sampling cone voltage 샘플링 콘 전압(±30 V),
  source temperature 소스 온도(120 °C),
  cone gas flow 콘 가스 유량(50 L h−1),
  desolvation gas flow 탈용매화 가스 유량(850 L h−1),
  desolvation temperature 탈용매화 온도(450 °C). 
• 시스템 운영에는 소프트웨어 MassLynx 4.1 SCN 851을 사용했다. 
• 질량 데이터는 데이터 수집 중
  acetonitrile과 aqueous formic acid (물에 0.1%)의 혼합물(1:1, v/v)에 포함된
  펜타펩타이드 류신 엔케팔린 (pentapeptide leucine enkephaline)
  (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu, m/z 556.2771, [M+H]⁺, m/z 554.2615, [M-H]^-) 용액(1 ng/μL)을
  이온 소스에 주입(10 μL min-1)하여 자동 보정했다.
• 그 잠금 질량(lock mass)의 스캔 시간은 0.3초(15초 간격)였다.
• m/z 50-1200 질량 범위에서 Synapt G2S의 질량 교정(calibration)은
  포름산나트륨 (sodium formate) (5 mmol/L in 2-propanol/water, 9:1, v/v)을 사용하여 수행했다.

Waters Acquity UPLC system (photo: ⓒ Waters)

 

Screening by UPLC-HDMS (ESI±) Analysis.

 

• C1-C13 subfractions를 물(1 mg/mL)에 용해시키고, 
  멤브레인-여과(0.45 μm)하여 
  UPLC-HDMS 시스템(1 μL)에 주입했다.
• 크로마토그래피 분리는
  150 mm × 2 mm, 1.7 μm BEH phenyl column (Waters, Manchester, UK)을 사용하여
  0.1% 수성 포름산(솔벤트 A)과 아세토니트릴(0.1% 포름산 함유, 솔벤트 B)을
  0.3 mL min^-1의 유속으로 사용했다.
• 95% 솔벤트 A로 0.5분간 등용매 용리(isocratic elution)한 후,
  솔벤트 B를 9분 이내에 95%까지 증가시키고,
  이어서 등용매 용리(2분) 후
  재조정(0.5분) 및 재평형화(re-equilibration) (3분)를 수행했다.
• 중심 MS 데이터는 MS^e(10 Hz)를 사용하여 m/z 50~1200의 질량 범위에서 수집되었다.
  
  

Waters’ Immerse Cambridge laboratory in Cambridge, MA (photo: ⓒ Waters)

 

 

 

Targeted Quantitation of Mozambioside in Coffee.

 

• 모잠바이오사이드 용액 (d₄-methanol에 1200 μM을 녹인 용액, qNMR [17]로 정확히 측정된 것)을
  50% 수성 에탄올로 희석하여 최종 농도를 12.00 μmol/L로 만들었다.
• 이 원액을 물로 더 희석하여
  6000, 3000, 1500, 750, 375, 188 nmol/L 농도의 작업 용액을 얻었다.
• “raw coffee matrix” 용액을 제조하기 위해,
  정량 가능한 양(S/N < 10)의 타겟 분석물질 3이 포함되지 않은
  분쇄된 raw coffee (Robusta Vietnam) 샘플(2 g)을
  에탄올(5 mL, 5분)과 함께 계량 플라스크(100 mL)에 넣은 다음
  뜨거운 물(50 mL, 60 °C)을 첨가하고 현탁액을 초음파 처리했다 (30분).
• 냉각 후 그 플라스크에 물을 넣어 100mL로 만들고,
  여과지로 여과한 후 멤브레인 여과(0.45μm)를 실시했다.
• 마찬가지로, 로스팅된 로부스타 베트남(2g/100mL)을 사용하여
  “roasted coffee matrix” 용액을 마련했다. 
• 생두 및 로스팅된 커피 매트릭스 용액의 분취량(0.5mL)을 각각 HPLC 바이알에 분취하고,
  작업 용액의 분취량(0.5mL)과 혼합하여
  최종 농도가 각각 3000, 1500, 750, 375, 188, 94nmol/L인 매트릭스가 첨가된 표준 용액을 제조했다. 
• 매트릭스 용액과 물의 혼합물(1+1)을 블랭크로 사용했다. 
• 모든 샘플 배치와 함께 표준 용액을
  UPLC-HDMS로 3회 반복 분석하여 검량선(Calibration curves)을 계산했다.
  
  
  
• Mozambioside (3)의 UPLC-HDMS 분석은
  BEH C18 컬럼(50mm×2mm, 1.7μm, Waters, Manchester, UK)에서
  물(0.1% % formic acid, 솔벤트 A)과 acetonitrile (0.1% formic acid, 솔벤트 B)을
  0.3mL min^-1의 유속으로 사용하여 수행했다.
• 90% 솔벤트 A로 등용매 용리(0.5분) 후,
  솔벤트 B를 5분 이내에 90%까지 증가시키고,
  이후 등용매 용리(0.4분) 후,
  초기 조건(0.1분)을 재설정하고 재평형(1.5분)을 이루었다.
• 중심 MS 데이터는 MS^e 실험(10Hz)을 사용하여 m/z 50~600의 질량 범위에서 수집했다.
• 컬럼 용출액은 변화도 2~4분으로 이동시켰다.
  
  
• 커피 생두와 로스팅된 분쇄 커피 내 mozambioside (3)의 정량화를 위해, 
  분말 샘플(500 mg)를 계량 플라스크(100 mL)에 넣고
   에탄올(5 mL)에 담근 후,
  물(50 mL)에 현탁하고 초음파 처리(30분, 60°C)했다.
• 실온으로 식힌 후,
  플라스크에 물을 넣어 100 mL로 만들고,
  일부(1 mL)를 4°C에서 30분 동안 원심분리(12,500 rpm)한 후,
  상층액의 일부(1 μL)를 UPLC-HDMS로 분석했다.
  
  
• 커피 추출액 내의 모잠바이오사이드 3의 정량화를 위해서는,
  음료의 일부(1 mL)를 원심분리(12,000rpm; 4°C, 10분)하고,
  물(1+9, v/v)로 희석한 후,
  막 여과(0.45 μm)를 거쳐
  UPLC-HDMS 시스템에 주입(1 μL)했다.  
  
  
• 분석 정확도와 정밀도 평가를 위해, 
  커피 생두 또는 볶은 커피 매트릭스를 각각 물(1+1)로 개별적으로 희석하고, 
  모잠바이오사이드 표준 용액(12.00 μmol/L, 100 μL)을 분취량(900 μL, n = 5)에 첨가하여
  각각 raw coffee matrix sample과 roasted coffee matrix sample을 1,200 nmol/L로 첨가했다.
• 첨가된 생커피 매트릭스를 분석한 결과 1136 ± 38 nmol/L로 나타났으며,
  이는 정확도 accuracy 94.7 ± 3.2%, 정밀도 precision 3.3%의
  상대표준편차 relative standard deviation (RSD)를 나타냈다.
• 볶은 커피 매트릭스에 첨가했을 때,
  1255 ± 27 nmol/L의 타겟 분석물질 3이 회수되었다 (정확도 104.6 ± 2.3%, 정밀도 2.2% RSD).
• 아라비카 생두 (파푸아뉴기니, n = 5) 샘플에서 3회의 반복 측정 결과
  1177 ± 49 nmol/g (4.2% RSD)가 나왔다.
  

 

 

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR).

 

• 구조 결정을 위한 NMR 데이터는 
  Cryo-TCI 프로브(Bruker, Rheinstetten, Germany)가 장착된 
  Bruker Avance III 500 MHz spectrometer (분광기)를 사용하여 수집했다.
• 데이터 처리는
  Topspin 소프트웨어 (버전 2.1; Bruker)와
  MestReNova 소프트웨어 (버전 5.2.3; Mestrelab Research, Santiago de Compostella, Spain)를
  사용하여 수행했다. 
• Quantitative NMR (qNMR) 실험은
  최근 보고된 Bruker Avance III 400 MHz spectrometer를 사용하여 수행했다 [17].

 

Bruker Avance 400 spectrometer

 

 

Calculations. 

 

• 계산은 Microsoft Excel 2010, 통계 패키지 R, Graphpad Prism 5 (버전 5.04)를 사용하여 수행했다.

 

 ■ RESULTS AND DISCUSSION

 

• 볶은 커피에서 親水性(hydrophilic) 쓴맛 화합물을 찾아내기 위해, 
  카페인(caffeine), 
  디케토피페라진(diketopiperazines), 
  카페욜 퀴나이드(caffeoyl quinides), 
  수산화 페닐인단(hydroxylated phenylindanes),
  (furan-2-yl)methylated benzene diols and triols과 같은
  기존에 확인된 疏水性(hydrophobic) 쓴맛 분자를
• 디클로로메탄(dichloromethane)(fraction A)과
  에틸 아세테이트(ethyl acetate)(fraction B)를 이용한
  완전 추출법(exhaustive extraction)을 통해 갓 내린 볶은 커피 원액에서 제거했다.
• 솔벤트들은 동결건조를 통해 제거하고,
  fraction A와 B의 수용액과 자연적으로 함유된 잔류 수분 fraction(C)의 쓴맛을 5점 척도로 관능 평가했다.
• Fraction A에서 가장 높은 쓴맛 강도(점수 = 2.2)가 보고되었고,
  그 다음으로 fraction B (점수 = 1.4)가 보고되었으며, 수용성 분획 C는 1.3의 쓴맛 점수를 받았다 (Table 1).
  
  
• 이러한 데이터는 
  커피에 극성(polar) 쓴맛 화합물이 존재함을 명확히 나타내므로, 
  페닐헥실(phenyl-hexyl) 물질에 대한 플래시 크로마토그래피를 통해 분획 C를 추가로 분리했다.
• 얻어진 하위 분획 C1~C13은
  커피 추출액(brew)에 포함된 천연 함량과 동일한 농도의 수용액에서 관능 평가를 실시했다.
• 센서리 패널리스트들은 주어진 설명어인
  “astringency”, “sourness”, “bitterness” 그리고 “해당 없음(none of these)” 중에서
  가장 두드러진 맛을 선택했다.
• 하위 분획 C11만 쓴맛이 가장 두드러진 맛으로 평가되어 상세 연구를 위해 선정되었다 (Figure 1).

 

Identification of Bitter Key Tastant in Subfraction C11. 

 

• 충돌 에너지(collision energy) 전달 유무에 따른 MSe 실험을 통해
  UPLC-HDMS를 이용하여 하위분획(subfraction) C11을 분석하였으며,
  m/z 50~1200 mass 범위에서 MS 데이터를 제공했다 (Figure 2).
• Negative ESI mode에서, 하위분획 C11에서 두 개의 매우 풍부한 피크가 검출되었다. 
• 7.9분에 용출된 화합물은
  m/z 481.2442의 유사분자 이온(pseudomolecular ion)(C₂₅H₃₇O₉, [M−H]⁻)을 나타냈으며,
  2-O-β-D-glucopyranosyl-atractyligenin (1, cf. Figure 3)과 잘 일치했다. 
• 이는 retention times와 MS data를 비교하고, 뿐만 아니라
  최근 분리된 준거 물질과의 cochromatography를 통해서도 확인되었다 [13,18].
• 화합물 2는
  8.05분의 retention time을 가졌고,
  pseudomolecular ion ([M−H]⁻)으로서 m/z 515.1198을 나타내
  dicaffeoylquinic acid derivative 파생체의 존재를 시사한다 (Table 2). [19] 
• retention time, MS data, MS 단편 데이터, 그리고
  커피 생두로부터 정제된 기준 물질(Supporting Information의 해당 NMR 데이터 참조)을
  사용한 cochromatography 결과를 비교한 결과,
  화합물 2는 4,5-O-dicaffeoylquinic acid인 것으로 나타났다 (Figure 3). 
  
  

 

 

• Positive ESI mode를 사용하여 검출된 주요 화합물 3은
  약 ~8분의 retention time과
  m/z 509.2388 (C₂₆H₃₇O₁₀ [M+H]⁺)의 베이스 피크를 나타내어, 
  전하를 띠지 않은 화합물의 sum formula가 C₂₆H₃₆O₁₀임을 시사한다. 
• Fragment m/z 347.1865 ([C₂₀H₂₆O₅] + H⁺)는 hexose의 손실을 나타내므로,
  화합물 3은 배당체(glycoside)임을 시사한다 (cf. Figure S1).
• HDMS 스펙트럼을 바탕으로,
  아글리콘(aglycon)으로서 디테르페노이드 파생물(diterpenoid derivative)일 것으로 추정했다.
• 그러나, 이 화합물의 식별은 풍부한 NMR 데이터 없이는 불가능했다. 
• NMR 실험에 적합한 양을 분리하기 위해,
  아라비카 및 로부스타 커피 생두와 볶은 콩들로부터 추출한 수용액 추출물을
  UPLC-HDMS로 스크리닝하여 화합물 3 (m/z 509.2388)의 함량을 분석했다.
• 흥미롭게도, 로스팅 하지 않은 아라비카 커피에서 화합물 3의 함량이 가장 높게 검출된 반면,
  로부스타 샘플에서는 대상 분석물질이 미량만 검출되었다.
  
  
• 따라서, 화합물 3은 
  m/z 509.2388의 높은 함량을 갖는 raw C. arabica로부터 
  플래시 크로마토그래피와 후속 RP-HPLC를 포함하는 
  MS-유도 분리 프로세스를 통해 분리 및 정제되었다. 
• 모든 분획 및 하위 분획에 대한 MS 분석을 통해 
  최종적으로 3을 단일 물질로 얻었으며, 
  이를 UPLC-HDMS 및 1D/2D NMR spectroscopy로 분석했다.
• ¹³C NMR은 총 26개의 탄소 신호를 나타냈다.
• HSQC에서 결론 지은 바와 같이,
  187.7(C2), 148.2(C3), 144.8(C4), 44.1(C8), 45.1(C10), 그리고 83.8(C16)의
  quaternary carbons 6개 외에,
  1개의 탄소가 3차(tertiary) 메틸基(C20)로 확인되었고,
  8개의 추가 신호는 메틸렌基, 그리고
  11개의 신호는 메틴基였다 (cf. the Supporting Information). 
• 103.2 ppm의 탄소(C1')는
  4.34 ppm의 글리코시드 양성자(glycosidic proton)(H1')와 연결되어 있었으며,
  이는 J = 7.8 Hz의 이중선으로 공명하여 β-glycoside의 존재를 확인했다.
• 이는 methine carbons C2’(75.5 ppm), C3’(78.5 ppm), C4'(71.0 ppm), C5'(77.9 ppm),
  그리고 C6'(62.9 ppm)의 화학적 이동에 기반하여 D-glucoside로 확인되었다.
• 그 glycosidic proton H1'과의 강한 교차 결합(cross coupling)은
  74.5 ppm의 탄소(C11)가 당(sugar)과 아글리콘(aglycon) 사이의 연결 고리임을 시사했다. 
• 수산화된 4基의 탄소(hydroxylated quaternary carbon) C16(83.8ppm)은
  C17(3.83/4.81 ppm)의 메틸렌 양성자와 메틸렌基 C15(1.35/2.26 ppm) 모두와 결합했다.
• 스펙트럼에는
  6.60ppm(H-C18)과 7.80ppm(H-C19)에서 결합 상수(coupling constant) J = 1.2Hz로
  눈에 띄게 이동한 두 개의 이중선이 추가로 포함되어 있었는데,
  이는 HMBC에서 관찰된 것처럼
  144.8ppm(C4)과 148.2ppm(C3)의 두 quaternary carbons와 결합했다.
• 이는 furan spin system을 나타내는 것이다 (cf. the Supporting Information).  
  
  
• 그 두 개의 더블릿(doublets)은 
  187.7 ppm의 카르보닐 탄소(C2)와 장거리 결합(long-range couplings)을 보였다.
• HMBC 스펙트럼에서 C2는
  J=16.2 Hz에서 2.50 ppm과 2.80 ppm에서 공명하는 두 개의 더블릿과 상관관계를 보였다. 
• HSQC에서 추론한 바와 같이,
  두 양성자 모두 54.1 ppm(C1)에서 단일 탄소에 연결되어 있었다.
• 탄소 C1은 3차 메틸기 C20과 결합했다 (주요 구조 요소는 Figure 4 참조).
• NMR data를 furan diterpenoids 경우의 것들과 비교한 결과, cafestol-like derivative임이 밝혀졌다.
• 그 글리코시드 부분(glycoside moiety), 연결 탄소 C11(74.5 ppm) 및 4차 탄소 C16(83.8 ppm)을 제외하고,
  표적 화합물 3의 화학적 이동은
  코페아 벵갈렌시스(Coffea bengalensis) 잎에서 분리된 벵갈렌솔(bengalensol)에 대해
  보고된 것과 잘 일치했다.[20]
• 3의
  글리코시드 특성,
  온전한 유사분자 이온과 단편화된 유사분자 이온의 HDMS 데이터, 그리고
  NMR 분광 데이터를 고려할 때,
  화합물 3은 모잠바이오사이드(mozambioside)로도 보고된
  푸로카우란 글루코시드(furokaurane glucoside) 11-O-(β-D-glucopyranosyl)-cafestol-2-one으로
  명확히 확인되었다 (cf. Figure 3). 
• 이 물질은
  코페아 아라비카(C. arabica)의 씨앗으로부터 [21] 그리고
  야생 커피 종인 코페아 슈도장게바리아에(Coffea pseudozanguebariae)에서[22]로부터 분리된 바 있었다.
• bitter-tasting subfraction C11에 대한
  UPLC-HDMS-ESI⁺ analysis로부터 얻어진 화합물 3의
  retention time과 MS 데이터를,
  정제된 준거물질에 대해 관찰된 것들과 비교하고,
  cochromatography 공크로마토그래피로 분석한 결과,
  화합물 3이 furokaurane glycoside mozambioside라는 사실이 명확히 밝혀졌다.  

 

 

Sensory Analysis. 

 

• 쓴맛의 서브플랙션 C11에서 식별된 화합물들 1~3의 관능적 특성을 평가하기 위해, 
  HPLC-MS 및 1H NMR 분광법을 통해
  각 화합물의 순도가 98% 이상임을 확인한 후,
• 표적 화합물의 연속 물 희석액(serial aqueous dilutions)을 사용하는 triangular test를 통해
  인간의 쓴맛 역치 농도를 측정했다 (Table 3).
• 화합물 1과 2는
  최고 시험 농도인 700 μmol/L까지 쓴맛을 전혀 나타내지 않았지만,
• 훈련된 센서리 패널리스트들은
  mozambioside (3)를
  미각 인지 역치 농도가 60(±10) μmol/L인 강렬한 쓴맛 화합물로 판단했다. 
• 이는 기준 카페인(680 μmol/L)에서 기록된 쓴맛 역치보다 10배 이상 낮다.
• 이전에 확인된 커피 쓴맛 화합물인
  2,5-diketopiperazines (190~8000 μmol/L)[6]과
  (furan-2-yl)methylated benzene diols and triols (100~537 μmol/L)[11]와 비교했을 때,
  이 푸로카우란 글리코사이드는 상당히 낮은 쓴맛 역치를 나타냈다.
• 실제로, 이는
  커피 로스팅 시 생성되는 것으로 이전에 확인된 고강력 쓴맛 내는
  mono/di- O-caffeoyl quinides (9.8~180 μmol/L)와
  hydroxylated phenylindanes (23~178 μmol/L)의 역치 범위 내에 있었다.[4,7-10]
• Mozambioside가
  수용액 서브플랙션 C11에서 유일한 쓴맛 화합물로 확인되었기 때문에,
  이 푸로카우란 글리코사이드가 수용액 커피 분획 C의 쓴맛을 유발하는 핵심 화합물로 간주되었다.

 

Quantitation of Mozambioside (3) in Raw and Roasted Coffee Beans. 

 

• 상업용 커피에서 발견되는 mozambioside (3)의 농도 범위에 대한 첫 번째 통찰력을 얻으려면, 
  이 푸로카우란 글루코사이드를 강력하게 분석할 수 있는 선택적 정량 분석법을 개발해야 한다.
• 예비 UPLC-HDMS 연구에서
  타겟 화합물(3)이 아라비카 커피에만 상당히 많이 존재하는 것으로 밝혀졌으므로,
• 생 로부스타 커피와 로스팅된 로부스타 커피의 수용액 추출물을 사용하고
  UPLC-HDMS를 이용하여
  세 가지 커피 샘플을 정량하기 위한 매트릭스 보정 외부 검정을 수행했다 (Figure 5).

 

• Signal-to-noise ratio (신호 대 잡음비, SNR) <10으로 추정된 타겟 화합물 3의 양은
  생 로부스타 커피(n=7)에서는 5 nmol/g 미만인 반면,
  아라비카 커피(n=16)에서는 모잠바이오사이드 함량이 높은 것으로 나타났는데,
  396 nmol/g (Sambia 커피)에서부터 1177 nmol/g (파푸아뉴기니 커피)까지의 범위에 달했다. 
• 이러한 데이터는
  생두의 모잠바이오사이드 농도가 원산지보다는 주로 품종(아라비카, 로부스타)에 따라 달라짐을 시사한다.
• 이는 carboxyatractyligenin glucosides [13,18]와 같은 디테르펜(diterpenes)과,
  kahweol 및 cafestol derivatives [23]의 정량적 차이에 대한 기존 연구와 잘 일치한다.
• 생 아라비카 커피들(396~1177nmol/g)와 비교했을 때,
  로스팅 및 분쇄된 아라비카 파우더의 모잠바이오사이드(3) 농도는
  232±37 nmol/g로 상당히 낮았다 (Table 4).
• 이는 커피 로스팅 시 모잠바이오사이드가 열 분해됨을 시사한다.

 

• 볶은 커피 추출액(brews)에서의 3에 관한 분석을 위해, 
  볶고 분쇄한 상업용 커피(100% 아라비카로 표시) 샘플로부터 
  가정용 커피 메이커를 사용해 음료를 마련하여
   UPLC-HDMS/UV (λ = 280 nm, Figure 6A)로 분석했다.
• 시판 볶은 커피로 만든 필터 커피 음료의
  모잠바이오사이드 농도는 5.0~11.5 μmol/L 범위였다 (Table 4).
• 커피 파우더에서 수용액으로의 모잠바이오사이드 추출 비율은
  필터 커피 음료의 경우 약 88%였고,
  프렌치 프레스를 사용하거나 커피 분말을 물에 끓여 추출한 경우 거의 정량적(>95%)이었다.
• 이러한 데이터에 따르면,
  볶은 커피 음료에서 이 글루코사이드 3은
  쓴맛 식역치인 60(±10) μmol/L를 초과하지 않는 것으로 보이며,
• 이는 모잠바이오사이드가
  볶은 커피 음료의 쓴맛 프로파일에 직접적인 영향을 미치지 않음을 시사한다.
• 그러나 생 아라비카 커피의 모잠바이오사이드 함량이 약 ~5배 높기 때문에, 
  모잠바이오사이드는 
  raw coffee로 만든 음료의 쓴맛에 또는 점점 더 인기를 얻고 있는 raw coffee extracts를 함유한 음료에
  영향을 미칠 수 있다.
• 예를 들어, 생 아라비카 커피로 만든 수용액(물 900 mL당 48g)에서 발견된
  모잠바이오사이드 51.0 μmol/L의 농도는
  쓴맛을 내는 푸로카우란 글루코사이드의 미각 역치(60±10 μmol/L)에 거의 도달했다 (Table 4).
• 따라서 향후 연구에서는
  로스팅 방식이 커피 음료의 모잠바이오사이드 함량에 미치는 영향을 조사해야 한다. 
• 더 나아가, 커피의 센서리 특성에서 이 푸로카우란 글리코사이드의 역할을
  더욱 포괄적으로 이해하기 위해서는
  원두 로스팅 시 생성되는 아직 알려지지 않은 열 변환 생성물의 화학 구조와 관능적 특성을 규명해야 한다.
  
  

 

 

 ■ ASSOCIATED CONTENT

ⓢ Supporting Information

Supporting Information은 ACS Publications 웹사이트에서 (DOI: 10.1021/acs.jafc.5b04847) 무료로 얻을 수 있다. 

 

     ¹H NMR, ¹³C NMR, and 2D-MR spectra (COSY, HSQC, and HMBC) and
     exact mass spectrometric data (PDF)

 

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            Springer: New York, 2010; pp 125−147 http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4419-6488-5_6 

(17) Frank, O.; Kreissl, J. K.; Daschner, A.; Hofmann, T.
        Accurate determination of reference materials and natural isolates
        by means of quantitative ¹H NMR spectroscopy.
        J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 2506−2515. https://doi.org/10.1021/jf405529b 

 

(18) Lang, R.; Fromme, T.; Beusch, A.; Lang, T.; Klingenspor, M.; Hofmann, T.
        Raw coffee based dietary supplements contain carboxyatractyligenin derivatives inhibiting
        mitochondrial adenine-nucleotide-translocase.
        Food and Chemical Toxicology  2014, 70, 198−204. https://doi.org/10.1016/j.fct.2014.05.017

(19) Poerner Rodrigues, N.; Bragagnolo, N.
        Identification and quantification of bioactive compounds in coffee brews by HPLC-DAD-MSⁿ.
        Journal of Food Composition and Analysis 2013, 32, 105−115. https://doi.org/10.1016/j.jfca.2013.09.002 

(20) Hasan, C. M.; Huda, Q.; Lavaud, C.; Connolly, J. D.; Haque, M. E.
        Bengalensol, a new 16-epicafestol derivative from the leaves of Coffea bengalensis.
        Natural Product Letters 1994, 5, 55−60.https://doi.org/10.1080/10575639408043935 

(21) Richter, H.; Spiteller, G.
        Über ein neues Furokauran-glycosid aus grünen Kaffeebohnen.
        (A new furokaurane glycoside from green coffee beans)
        Chemische Berichte 1979, 112, 1088−1092. https://doi.org/10.1002/cber.19791120403 

(22) Prewo, R.; Guggisberg, A.; Lorenzi-Riatsch, A.; Baumann, T. W.; Wettstein-Bättig, M.
        Crystal structure of mozambioside, a diterpene glycoside of Coffea pseudozanguebariae.
        Phytochemistry 1990, 29, 990−992. https://doi.org/10.1016/0031-9422(90)80065-O

(23) Karl Speer ; Isabelle Kölling-Speer.
        The lipid fraction of the coffee bean.
        Braz. J. Plant Physiol. 2006, 18, 201−216. https://doi.org/10.1590/S1677-04202006000100014