아라비카 커피의 쓴맛 화합물 Mozambioside

Furokaurane glycoside는 화학적으로 배당체(glycoside)와 푸로카우란(furokaurane) 구조를 포함하는 화합물을 의미한다. 특히, 모잠바이오사이드(Mozambioside)라는 물질이 대표적인 푸로카우란 글리코사이드(配糖體)로 알려져 있으며, 이는 아라비카 커피(Arabica coffee)에서 발견되는 쓴맛을 내는 성분이다. 이 화합물은 고도로 극성(polar)이며, 커피의 쓴맛을 유발하는 주요 성분 중 하나로 작용한다. 연구에 따르면, 아라비카(Arabica) 원두에는 396~1188 nmol/g의 Mozambioside가 포함되어 있지만, 로부스타(Robusta) 커피에서는 거의 검출되지 않는다. 또한, 커피 로스팅 과정에서 부분적으로 분해되어 최종적으로 커피의 맛에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 이러한 화합물은 커피의 품질을 분석하는 마커(marker)로 사용될 수 있으며, 커피의 쓴맛을 조절하는 데 중요한 역할을 할 수 있다.

Furokaurane 구조는 카우란(kaurane) 골격을 기반으로 하면서 푸란(furan) 고리를 포함하는 화합물의 구조적 특징 (fused furan과 kaurane rings)을 의미한다. 카우란은 테르페노이드(terpenoid) 계열의 화합물로, 식물에서 발견되는 생리활성 물질 중 하나이다. 이러한 구조는 천연물 화학(natural product chemistry)에서 중요한 역할을 하며, 특히 식물 유래 생리활성 화합물에서 발견될 수 있다. 푸란 고리는 산소 원자를 포함하는 5원자 고리 구조로, 화합물의 반응성과 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있다.

카우란(kaurane) 골격은 테르페노이드(terpenoid) 계열의 20탄소 디테르펜(diterpene) 구조로, 식물에서 발견되는 생리활성 화합물의 기본 골격 중 하나이다. 이 구조는 4개의 고리(tetracyclic)로 이루어진 특징적인 형태를 가지며, 다양한 천연물(natural products)에서 발견된다. 카우란 골격을 기반으로 한 화합물들은 항암, 항염, 항균 등의 생물학적 활성을 가지는 것으로 보고되었으며, 특히 커피(Coffea) 속 식물에서도 발견된다. 또한, 곰팡이(fungal) 생체 변환(biotransformation)을 통해 다양한 구조적 변형이 가능하며, 이는 화합물의 생물학적 활성 및 기능성을 변화시키는 중요한 과정이라고 한다.

푸로카우란 화합물, 특히 모잠바이오사이드(mozambioside)는 아라비카 커피의 쓴맛에 중요한 역할을 한다. 모잠바이오사이드는 쓴맛을 내는 푸로카우란 글루코사이드로, 인간의 쓴맛 수용체, 특히 TAS2R43과 TAS2R46을 활성화하는데, 이 수용체의 쓴맛 역치는 카페인보다 10배 낮다. 커피 로스팅 과정에서 모잠바비오사이드는 분해되어 새로운 열분해 화합물을 생성하고, 이는 최종 추출 커피의 쓴맛에 영향을 미친다. 이러한 로스팅 산물들은 쓴맛 수용체의 활성화 역치가 낮아, 낮은 농도에서도 커피의 쓴맛을 더욱 강하게 느낄 수 있다. 최근 관심이 고조되고 있는 커피의 쓴맛 화합물들 가운데 모잠바비오사이드 관련 아티클을 본격적으로 읽어 보기 전에, 가능하면 처음으로 언급하거나 논의된 아티클들을 찾던 중 1990년에 스위스 쮜리히 대학교 유기화학 연구소와 식물학 연구소의 교수진 및 과학자들에 의해 발표된 짧은 것이 있어 일단 읽어본다.

 

 

 Abstract

• 카페인-프리 커피종인 모잠비코페아스(Mozambicoffeas)에 속하는
  코페아 슈도장게바리아에(Coffea pseudozanguebariae)의 씨앗에서
  푸로카우란(furokaurane) 타입의 디테르펜 배당체(diterpene glycoside)가 분리되었다. 
• 모잠바이오사이드(mozambioside)라는 이름의
  이 쓴맛 화합물은 화학적 방어작용 측면에서 카페인을 대체하는 것으로 여겨진다.
• 이 화합물의 구조가 X선 회절분석(X-ray diffraction analysis)을 통해 확인되었다.

 

 INTRODUCTION

• 금세기 초, Bertrand [1-3]는 마다가스카르와 인근 섬에서 자라는 야생 커피 종에 카페인이 없지만 불쾌한 쓴맛을 내는 성분이 포함되어 있음을 발견했다.
• 70년 후, 그 마스카로사이드(mascaroside) (1)의 구조가 밝혀졌다 [4,5].
• 이는 푸로카우란(furokaurane) 타입의
  쓴맛이 나는 디테르펜 글리코사이드(bitter-tasting diterpene glycoside)이며,
  Mascarocoffea 절(section)에 속하는 Coffea vianneyi Leroy의 생두에서 분리되었다 [6].
• 야생 커피 종에 대한 탐사 중 [7] 케냐에서 두 개의 밀접한 관련이 있는 식물 그룹이 발견되었다 [8]. 
• 이 두 그룹은 개화 시기에 의해서만 유성적으로 분리되었으며(동소적 종 분화, sympatric speciation),
  둘 다 Mozambicoffea 절에 속한다.
• 한 種인 Coffea sp. A는 카페인을 함유하고,
  다른 한 種인 C. pseudozanguebariae는 카페인이 없다.
• 우리는 후자 種의 콩을 분석하여 쓴맛이 나는 디테르펜 글리코사이드가 축적됨을 발견했으며,
  이에 mozambioside라는 이름을 제안했다.

 

영국 Kew 왕립식물원의 C. pseudozanguebariae 커피나무 표본

 

 

• 이 화합물은 이전에 Richter & Spiteller가 분리한 C. arabica 콩에 미량으로 존재한다 [9].
• 그들은 UV, MS, NMR을 통해 구조가 11-O-(β-D-glucopyranosyl)cafestol-2-one임을 확인한 바 있다. 
• 유추를 위해 이 저자들은 2와 같은 상대적인 배열을 제시한다.
• 본 연구에서는 X선 회절 분석(X-ray diffraction analysis)을 통해 얻은 배열에 대해 보고한다.
• 또한, 씨앗의 모잠바이오사이드 함량과 쓴맛 값(bitterness value)을 측정했다.

 

 RESULTS AND DISCUSSION

• 무색의 결정들이 약 – 140°에서 
  공간군(space group) P2₁, a = 18.919(3), b =7.028(1), c = 19.998(3)Å, β = 103.02(l)인 수용액으로부터 얻어졌다.
• 단위 격자 부피(unit cell volume) 2591(l)ų에서 유도된 바와 같이, 그 비대칭 단위(asymmetric unit)는 모잠바이오사이드의 두 분자(그리고 구조 결정의 후반 단계에서 발견한 바와 같이 물 분자 여섯 개)를 포함한다.

 

 

• X-선 회절 분석 결과, Fig. 1에 표시된 두 개의 독립 분자들 중 하나에서 볼 수 있듯이,
  모잠바이오사이드의 구조 2가 확인되었다.
• 따라서 이는 Richter & Spiteller [9]가 제안한 구성과 배열을 모두 확인한다.
• 그 두 개의 독립 분자들은 주로 C-11/O-11 결합(bond)의 형태(conformation)와,
  결과적으로 그것의 아글리콘(aglycone)에 대한 포도당 잔기(glucose residue)의 위치가 다르다.
• 그 結晶은
  z = 0 평면(plane)에 대해서는
  광범위한 수소 결합(hydrogen bonding)을 갖는 주로 親水性 領域(hydrophilic region)과,
  z = 0.5 평면에 관해서는
  더 疏水性인 領域(more hydrophobic region)을 가지고 있다 (Fig. 2 참조).
  

  

  
  

 

 

 

• 분석된 C. pseudozanguebariae의 종자는 0.94 %(건조 중량) 농도의 모잠바이오사이드를 함유했다.
• Richter and Spiteller [9]는
  Coffea arabica 종자 5 kg에서 약 50 mg만 분리했는데, 이는 재배종에서 1,000배 낮은 함량을 의미한다.
• 이러한 디테르펜 글리코사이드(such diterpene glycosides)의 고농도는
  카페인-프리 커피 種에서만 발견되었기 때문에, 카페인과 유사하게 화학적 식물 방어에 중요한 역할을 한다고 가정할 수 있다 ([10]에서 리뷰).
• 모잠바이오사이드의 카페인 대체 기능은 두 화합물의 쓴맛 값을 비교하여 뒷받침될 수 있다 :
  퀴닌(quinine)을 기준으로 우리는
  모잠바이오사이드의 값은 ⇒ 6,000으로,
  카페인의 값은 ⇒ 3,200으로 결정했고,
  이는 카페인-프리 빈의 total ‘bitterness potential’ (모잠바이오사이드 0.94%)이 카페인-함유 빈 (카페인 1-2%)의 총 '쓴맛 잠재력'과 유사함을 의미한다.
  
  

 EXPERIMENTAL

 

Extraction and isolation of mozambioside (2). 

 

• Coffea pseudozanguebariae Bridson의 종자는
   A. Charrier 박사와 F. Anthony 박사(ORSTOM, 몽펠리에, 프랑스)께서 친절히 제공해 주셨다.
• 각질층(내과피, endocarp)을 집게로 제거하고,
  빈들(10g)을 막자사발에 넣고 액체 질소(N2)를 넣어 균질화했다.
• 그 균질물을 초음파 분쇄기(sonicator)에서 60˚로 30 ml H2O로 추출했다 (2x).
• 원심분리로 얻은 합친 aq. extracts (추출액)(53 ml)을
  Kieselgur 컬럼 (Extrelut, Merck Darmstadt, F.R.G.; 34×195 mm)에 부었다.
• 용출(Elution)은 CH₂Cl₂ (염화메티렌)(fraction 1, 150ml)로 수행한 다음,
  EtOAc-iso-PrOH, 9:1 (fractions II-V, 각 200 ml)로 진행했다.
• 그 디테르펜 글리코시드를 함유한 fractions II-V (UV spectrophotometry 분광광도법으로 스크리닝)를 합친 후,
  회전 증발(rotatory evaporation)로 건조했다.
• 잔류물을 분취용 preparative HPLC를 위해 13 ml MeOH (메탄올)에 용해했다:
  Nucleosil 120, 10 μm, C8; 250×20 mm; MeCN-H₂O (Acetonitrile-물), 20:80; 10 ml/min.
• Rt 17.5 min인 피크에 있는 물질을 수집하고,
  이동상(mobile phase)을 증발시킨 후 H₂O로부터 결정화했다. 
• 무색 결정 (88 mg), mp 179.4-180.3°; (Lit. mp 140-145° (MeOH) [9]);
  FABMS (glycerol sample matrix) m/z: 509 [M+H]⁺;
  분광 특성(UV, IR, ¹H NMR)은 공개된 데이터와 동일했다 [9].
  
  

Determination of the seed content of 2. 

 

• 50개의 종자들을 액체 질소(N2)에 분쇄하고(pulverized), 
  초음파 처리기(sonicator)에서 30 분간 60°에서 MeOH (메탄올)(143 ml)로 추출했다.
• 그 추출물은 TLC (Sigel F254; CHCl3-MeOH, 8:2)로 분리했다.
• Rt 0.11의 밴드를 MeOH로 용출하여 분광광도법(Shimadzu UV-160, Kyoto, Japan)으로 함량과 순도를 측정했다.

 

Crystallographic measurements.  

 

• 이는 결정을 약 -140˚로 유지하는 저온 장치 LT-1을 갖춘 Nicolet R3 회절계(diffractometer)에서
  MoKα 방사선  주사로 수행되었다.
• 단위 셀 파라미터들은 31<｜2θ｜201 < 38˚ 범위에서
  자동으로 중심화된 72개 반사 위치들(reflection positions)의 2θ-values을 최소자승법(least-squares)으로
  미세 조정하여 얻었다.
• (sin θ/1=0.70 Å-1) 내의 8,122개 고유 반사(unique reflections)의 세기(intensities)가 ω-scan mode에서 측정되었고, 흡수(absorption)를 제외한 일반적인 보정이 적용되었다.
• E-values의 수를 700으로, 삼중항(triplets)의 수를 11,293으로 늘린 후,
  직접법 프로그램(the direct methods programme) SHELXS-86 [11]을 사용하여 초기 구조 모델을 얻었다.
• 그 당시에는 그 構造에 대한 불완전한 아이디어만 있었기 때문에,
  원자 유형(atom types)이 올바르게 할당되도록 주의를 기울였다.

 

• 두 분자 중 하나에 있는 포도당 잔기(glucose residue)의 O-6은 두 위치에 걸쳐 무질서하다(disordered).
• 대부분의 H 원자들은 다른 원자의 異方性 精製(anisotropic refinement) 후,
  여러 差異 密度 맵(difference density maps)에 위치할 수 있었지만, 일부는 의미 있는 정제가 불가능했다.
• 마지막 정제 단계(refinement step)에서,
  5개의 H 원자들이 제외되고(omitted), 3개는 원래 위치에 고정했으며,
  그 외의 것들은 하나의 共通 等方性  溫度因子(one common isotropic temperature factor)를 사용하여
  자유롭게 정제했다. 
• C와 O 원자들은 이방성으로 정제되었다 (anisotropically refined).
• 두 위치에 걸쳐 분할된 O 원자의 경우,
  둘 다 독립적으로 정제되었지만 하나의 모집단 모수(population parameter)를 사용했다.
• 945개 변수들의 정제는 블록당 102개 변수들을 사용하는 블록형 캐스케이드 최소자승(blocked cascade least-squares) 알고리즘[12]을 통해 수행되었으며, 1σ_F  이상의 6,577개 구조 인자(structure factors)를 사용했고 R=0.100, Rw = 0.076, l/w= σ²_F + 0.001 F²에서 수렴했다.
• CC와 CO 결합 길이들(bond lengths)의
  e.s.d.s. (추정표준편차)(무질서한 O 제외)는 0.005Å에서 0.010Å 사이이다.
• 두 분자의 등가 결합 거리(equivalent bond distances)의 가장 큰 차이는 0.035Å, 0.032Å, 0.026Å이다.

 

Hydrolysis of 2.

 

• 15mg의 시료를 1.5ml의 염산(HCl, MeOH에서 5%)에 넣어 밀폐된 바이알(2ml)에서
  95˚C에서 4.5시간 동안 가열하였다. 
• 필터링(0.2μm, Acre LC 13, Gelman, Ann Arbor, MI, USA) 후,
  1 ml의 물(H₂O)을 첨가하였고,
  그 가수분해된 용액을 10ml의 염화메틸렌(CH2CI2)로 한 번(1×) 추출하였다. 
• 그 액상물(aq. phase)은 회전 증발(rotatory evaporation)로 건조되었으며,
  5.5mg의 메틸글루코스(methylglucose)가 생성되었다. 
• 이는 methyl-α- and methyl-β-D-glucopyranoside가 3:2 비율로 혼합된 것이며,
  광학 회전(optical rotation)으로 확인되었다.

 

 REFERENCES

 

1. Bertrand, G. (1901)  C. R. Acad. Sci. 132, 162.

2. Bertrand, G. (1902) Bull. Sci. Pharm. 5, 203. 

3. Bertrand, G. (1905)  C. R. Acad. Sci. 141, 209. 

4. Ducrujx, A., Pascard-Billy, C., Hammoniere, M. and Poisson, J. (1975) 
    J. Chem. Sot., Chem. Commun. 396.

5. Ducruix, A., Pascard-Billy, C., Hammoniere, M. and Poisson, J. (1977) Acta Cryst. B33, 2846. 

6. Charrier, A. (1978) 
    La structure génétique des caféiers spontanés de la region malgache, Mascarocoffea,
    Mémoires ORSTOM (Paris) 87.  

7. Berthaud, J., Guillaumet, J.-L., Le Pierres, D. and Lourd, M. (1980) Café, Cacao, Thé  24, 101.

8. Hamon, S., Anthony, F. and Le Pierres, D. (1984) Bull. Mus. Natn. Hist. Nat. (Paris) 4e sér., 6. 207.

9. Richter, H. and Spiteller, G. (1979)
    Über ein neues Furokauran-glycosid aus grunen Kaffeebohnen.
     (A new furokaurane glycoside from green coffee-beans)
    Chemische Berichte 112, 1088-1092.  

10. Baumann, T. W. and Frischknecht, P. M. (1988) 
      II.6  Caffeine: Production by Plant (Coffea spp.), Cell Cultures
      In (Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol. 4) Medicinal and Aromatic Plants I
       (Bajaj, Y. P. S. ed.) p. 264. Springer, Berlin.

11. Sheldrick, G. M., (1986) SHELXS-86, Universität Göttingen. 

12. Sheldrick, G. M., (1985) SHELXTL. 
     An integrated system for solving, refining and displaying crystal structures from diffraction data.
     Revision 5.1, Universität Göttingen.