새로 발견된 커피의 쓴맛 화합물 부류 (furan-2-yl)methylated benzene diols and triols

 

 Abstract

• 예비연구들
  ⇒ 로스팅된 커피에서 미지의 쓴맛 화합물을 분석적 분획법을 통해 식별하는 것은
      산화적 안정성 및 화학적 안정성이 제한적이기 때문에 어렵다는 것이 밝혀졌다. 
• 본 연구에서는
  ⇒  합성-구축 전략을 사용하여
  ⇒  커피 관련 전구체로 추정되는 물질을 표적 반응시켜 후보 쓴맛 분자를 얻었다.
• ■ di and tri-hydroxybenzene 즉
       pyrogallol, hydroxyhydroquinone, catechol의 바이너리 혼합물들, 또는
  ■ 3- and 4-methylcatechole, 그리고
  ■ a furan derivative 즉
       furfuryl alcohol, furan-2-aldehyde, 또는
  ■ 5-(hydroxymethyl)furan-2-aldehyde,
  ⇒ 모두 로스트된 커피에 존재하는 것으로 알려진 것들인 바, 이들이 열처리 되었다. 
• LC–MS and NMR experiments에 의하여,
  ⇒ 그 반응 산물들은 (furan-2-yl)methylated benzene diols and triols인 것으로 식별되었고,
  ⇒ 그리고 그들의 쓴맛 식역이 센서리 분석에 의해 결정되었다. 
• 마지막으로, LC–MS/MS 스터디들이
  ■ 4-(furan-2-ylmethyl)benzene-1,2-diol, 
  ■ 4-(furan-2-ylmethyl)benzene-1,2,3-triol,
  ■ 4-(furan-2-ylmethyl)-5-methylbenzene-1,2-diol, and
  ■ 3-(furan-2-ylmethyl)-6-methylbenzene-1,2-diol
  ➡ 이런 화합물들의 자연적 발생을
       로스트된 커피 내 새로운 부류의 쓴맛 화합물들로 검증하였다. 
• 그들의 화학구조에 따라 이 화합물들의 쓴맛 인식 식역은 100~537 μmol/l의 범위였다. 

 

 Contents

 

 

 1. Introduction

 

• 역사를 통해, 14세기 아라비아 상인들부터, 유명한 비엔나의 커피 하우스까지, 당신의 편안한 집까지, 신선하게 우려낸 커피는 아로마-활성적 휘발성 물질들의 조합이 가지는 매혹적인 냄새부터 bitterness와 sourness 중심의 잘 균형 잡힌 taste impression을 유도하는 첫 모금(first sip)까지 pleasure, reward, 그리고 enjoyment에 연관되어져 왔다. 
• 비록 휘발성 핵심 향기물질들(Mayer, Czerny, & Grosch, 2000; Semmelroch & Grosch, 1995, 1996) 그리고
  비휘발성의 쓴맛 화합물들(Blumberg, Frank, & Hofmann, 2010; Frank, Blumberg, Krümpel, & Hofmann, 2008; Frank, Blumberg, Kunert, Zehentbauer, & Hofmann, 2007; Frank, Zehentbauer, & Hofmann,2006)의 오케스트라를 생성하는 것으로 보고된 것이 로스팅 절차이지만, 후자 그룹의 분자들에 관해 이용 가능한 지식들은 전혀 포괄적이지 않다. 
• 커피 음료와 커피 관련 모델 시스템들에 대한 sensomics approach를 적용하고,
  이어서 LC–MS/MS and 1D/2D NMR studies를 통하여, 커피 로스팅은
  non-bitter 3-O-, 4-O-, and 5-O-caffeoylquinic acids 뿐만 아니라, 
  강렬한 쓴맛 나는 일련의 caffeoyl quinides를 유발하는 dicaffeoylquinic acid의 
   ┌ transesterification (에스테르 교환), 
   ├ epimerization, and 
   └ lactonisation을 유발하는 것으로 발견되었다
      (Blumberg et al., 2010; Clifford, 1979; Frank et al., 2006, 2008). 
• 더욱이, caffeoylquinic acids 그리고,
  일단 형성되면 그들의 상응하는 lactones가
  4-vinylcatechol로 분해되는 것으로 최근에 보고되었는데,
  이는 올리고머화하여 harsh and lingering bitter taste profile를 보이는
  일군의 polyhydroxylated phenylindanes를 생성한다 (Blumberg et al., 2010; Frank et al.,2007).  
• 비록, O-caffeoylquinic acids가
     ┌ pyrogallol,
     ├ hydroxyhydroquinone, 
     ├ catechol, 
     └ 3- and 4-methylcatechol, and 4-ethylcatechol와 같은
  일련의 di and trihydroxybenzenes로 분해되는 것으로 오랫동안 알려졌지만
      (Clifford, 1979; Haffenden & Yaylayan, 2005; Lang, Müller, & Hofmann, 2006;
        Tressl, Bahri, Koeppler, & Jensen,1978),
  ⇒ 커피 로스팅 동안 후보 쓴맛물질 생성에서
      일시적 중간물질들(transient intermediates)로서의 그들의 역할은 알려져 있지 않다. 
• 비슷하게,
  ┌ furfuryl alcohol (Shibamoto et al.,1981)과
  └ 5-(hydroxymethyl)furan-2-aldehyde (Belitz, 1977;Moon & Shibamoto, 2009)과 같은
      (이중 후자는 carbohydrates의 Maillard-type 반응과 카라멜화 반응들로부터 유래)
      (Antal, Mok, & Richards, 1990; Lewkowski, 2001; Richards, 1956),
  furan derivatives (푸란 파생물질들)은 각각
  커피의 bitterness의 발현에 공헌하는 것으로 제시되어왔다.  
  ⇒ 그러나, 그런 반응성 푸란들(furans)을 커피 로스팅 중에
      후보 쓴맛 분자들로 변환하는 메커니즘에 관한 어떠한 정보도 결핍되어있다. 
• 많은 bitter compounds의 높은 reactivity와 chemical instability가
  로스트된 커피에서의 명확한 식별을 제한 해왔기 때문에,
  선행 연구들에서의 iterative fractionation experiments에 의해,
• 본 연구의 목적은 
  커피에서 식별되는
     di/trihydrixybenzens와
     reactive furan derivatives,
       즉 ┌ furfuryl alcohol,
           ├ furan-2-aldehyde, 
           └ 5-(hydrixymethyl)furan-2-aldehyde 
            각각의 이원 혼합물들(binary mixtures)를 열처리를 하는 것이었다. 
  
• 형성되는 반응 산물들은 
  ⇒ 그들의 화학구조가 LC-MS/MS와 1D/2D NMR experiments에 의해서 식별될 것이며
  ⇒ 그것들의 bitter taste threshold concentrations이
       human sensory studies에 의해서 결정될 것이고,
  ⇒ freshly prepared coffee brew에서의 자연 발생이
      HPLC-MS/MS에 의해 검증될 것이다. 

 

 

 2. Materials and methods

 

2.1 Chemicals and materials

 

• 다음의 화합물들이 상업적으로 획득되었다 :
  (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)
      pyrogallol, hydroxydroquinone, catechol, 4-methylcatecol, 3-methylcatecol, resorcinol, 
      caffeic acid, chlorogenic acid, furfuryl alcohol, furan-2-aldehyde,
      5-(hydroxymethyl)furan-2-aldehyde.
  (Merck KGA, Darmstadt, Germany) 
     ethanol, methanol, formic acid, acetic acid.
• 솔벤트들은 HPLC grade였다 (J.T. Barker, Deventer, Netherlans). 
• 크로마토그래피를 위해 사용된 이온제거수(deionized water)는
  Milli-Q-Grandient A10 system에 의해 공급되었다 (Millipore, Billerica, USA). 
• Deuterated solvents(중수소화 솔벤트)는 Eurosp-Top (Gif-Sur-Yvette, France)에 의해 공급되었다. 
• Gradient flash chromatography를 위해서
  RP-18 Bulk material (LiChroprep RP-18, 25-40 μm, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)가 사용되었다. 
• Sensory analyses는 bottled water (Evian, Danone, Weisbaden, Germany)으로 수행되었다. 
• Coffee beans (Arabica Brazil, Santos)은
  230℃에서 240s 동안에 로스트된 커피 콩들은 식품 업계에서 구입되었다. 
• 3-((2-furylmethyl)sulfanyl)benzene-1,2-diol과
  3-((2-furylmethyl)sulfanyl)benzene-1,2,4-triol은
  선행연구에서 보고된 바에 따라 합성되고 정제되었다
        (Müller, Hemmersbach, Van’t Slot, & Hofmann, 2006). 
  

2.2 Sensory analyses

 

2.2.1. Panel training

 

• 12명의 subjects (7명 여성, 5명 남성, 25-28세) - 본 연구의 센서리 테스트에 참가를 동의.
• 알려진 taste disorders의 이력이 없는 사람들.
• 초기에 상세하게 보고된 바와 같이 sip-and-spit method를 사용하여 
  purified reference compounds를 가지고 센서리 훈련 세션들에서 적어도 2년 동안 참가했음.
    (Brock and Hofmann, 2008; Frank et al., 2006; Frank et al., 2007; Frank et al., 2008;
     Haseleu, Intelmann, & Hofmann, 2009; Scharbert, Holzmann & Hofmann, 2004;
     Stark, Bareuther & Hofmann, 2005).

 

2.2.2. Bitter taste recognition concentrations

 

• Astringent와 Bitter compounds의 carry-over effects(이월효과)를 극복하기 위해
  테스트 화합물들의 식역 농도들은 최근에 개발된 half-tongue test에 의해서
  생수(bottled water)에서 결정되었다.
   (Brock and Hofmann, 2008; Frank et al., 2007; Frank et al., 2008;
    Hufnagel and Hofmann, 2008; Scharbert et al., 2004; Start et al., 2005, 2010). 
• Serial 1:1 dilutions of samples (1 ml)를
  3회의 다른 세션들에서 12명의 훈련 받은 패널들에게,
  sip-and-spit method를 사용하여 농도가 높아지는 순서로 제시. 
• 최후의 것과 최후에서 두 번째 농도들의 기하평균을 계산하여 개인의 recognition threshold로 취했음. 
• 세션의 시작과 각 시행 전에, 참가자들은 물로 입을 헹구어 뱉었음(expectorated).
• 개인들과 3회의 별도 세션들 간의 값들은 ± one dilution step 이상 만큼 다르지 않았음 ;
  즉, 4-(furan-2-ylmethyl)benzen-1,2-diol의 경우 134 µmol/l의 식역치는
       astringent impression의 67~268 µmol/l의 범위에 해당했음.  
  
  

2.3 Roasting experiments with a binary mixture of catechol and furfuryl alcohol

 

• Catechol (0.04 mmol)과
  furfuryl alchol (0.2 mmol)의 binary mixture를
  silica gel (900 mg)과 acetic acid (500 μl; 1% in water)과 잘 혼합.
• 이 혼합물을 lab oven에서 50℃에서 120 min 동안 50말린 후에
  온도가 180℃로 상승했고 10 min 동안 두었음. 
• Cooling 후에,
  이 반응 혼합물을 acetone/water (7/3, v/v; 5ml)로 추출했고
  그 유기 솔벤트가 진공에서 분리되었고
  그런 다음에 RP-HPLC/DAD에 의해 분석되었음. 
  
  

2.4  Model reactions with mixtures of
di/trihydroxybenzenes and furan derivatives in solution

 

2.4.1. Analytical scale

 

• ┌5-O-caffeoylquinic acid,
  ├caffeic acid,
  ├catechol,
  ├3-methylcatechol,
  ├4-methylcatechol,
  ├resorcinol,
  ├pyrogallol, 또는
  └hydroxyhydroquinone (각 0.04 ml) 각각과
  Aqueous acetic acid (1 ml, 1% in water)에서의
  ┌furfuryl alcohol,
  ├furan-2-aldehyde, 또는
  └5-(hydroxymethyl)furan-2-aldehyde (0.04-0.4 mmol, each) 각각의
     바이너리 용액이 a heated alumina block을 사용하여
     100℃에서 a closed Pyrex glass vial (10ml)  (Pyrex 밀폐 유리병)에서 열처리되었음(가열). (Table 1).
• 여러 시간 간격 후에 (10분, 1, 2, 4, 8시간)
  그 반응 혼합물은 상온까지 식혀졌고,
  막여과되고(membranes filtered) 그리고
  앨리퀏들(30 μl)이 RP-JPLC/DAD에 의해 반응산물들이 직접적으로 모니터되었음. 

 

 

2.4.2. Preparative scale

 

• ┌catechol,
  ├3-methylcatechol,
  ├4-methylcatechol,
  ├resorcinol,
  ├pyrogallol, 또는
  └hydroxyhydroquinone (2.0 ml each) 각각과
  Aqueous acetic acid (15 ml, 1% in water)에서의
  ┌furfuryl alcohol (2-10 mmol) 또는,
  └ furan-2-aldehyde (10 mmol) 각각의 바이너리 솔루션이
  Table 1에 나온 시간들 동안 100℃에서 a closed Pyrex glass vial (60ml)에서 열처리되었음(가열). (Table 1). 
• 반응 혼합물들은 Cooling 후에,
  methanol (10 ml)로 희석되었고
  RP-18 material (LiChroprep, 25-40 ㎛, Merck KGaA Darmstadt, Germany) 슬러리(slurry)가 채워진
  150 × 40 mm i.d. column을 장착한 Buechi sepacore system (Flawil, Switzerland)를 사용하여
  gradient flash chromatography에 의해 분리되었다. 
• 그 effluent의 220 nm에서의 모니터링하면서,
  크로마토그래피가 40 ml/min의 flow rate으로 수행되었는데,
  aqueous formic acid (0.1% in water; solvent A)와  methanol (solvent B)의 혼합물 (100/0, v/v)로 시작하여,
  솔벤트 B를 34 min 내에 80%까지 증가시켰고,
  그 다음에 2 min 내에 B를 100%까지 증가시켰고,
  끝으로, 10 min 동안 100%로 유지하였다. 
  

 

 

 

 

2.5 Preparation of the coffee beverage

 

• Batch mill (IKA, Staufen, Germany)에 의해 커피 콩들을 그라인딩한 후,
  coffee powder 일부(54g)을
  coffee filter (No.4, Melitta, Germany)을 넣고
  boiling water로 여과물이 1.0 리터에 달할 때까지 퍼콜레이트 하였음. 
• 얻어진 커피 음료는
  HPLC-MS/MS 분석 이전에 아이스 통에서 즉시 상온까지 냉각되었음. 

 

2.6 High-performance liquid chromatography (HPLC)

 

• Analytical HPLC 장비 (Kontron, Eching, Germany)의 구성
  a low-pressure gradient system 525 HPLC pump,
  a M800 gradient mixer,
  a type 560 autosampler,
  a DAD type 540+ diode array detector.
• Chromatography의 수행
  250 × 4.6 mm i.d., 5 ㎛, Luna Phenyl-Hexyl column (Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)
  유속 flow rate of 0.8 ml/min
• Semi-preparative Chromatography의 수행. 사용한 HPLC system의 구성은
  two Skykam S1122 high pressure pumps (Eresing, Germany)
  a Sunchrom Spectraflow 600 DAD detector (Friedrichsdorf, Germany),
  a Rheodyne injector qith a 2 ml loop (Alsbach a.d. Bergstrasse, Germany),
  a 250 × 21.2 mm i.d., 5 ㎛, Microsorb 100-5 C18 column (Varian, Damsradt, Germany)
  operated with a flow rate of 18 ml/min. 

Kontron 525 HPLC system

 

Sykam S1125 HPLC Pump System

 

 

SunChrom Spectraflow 2050 DAD detector

 

 

2.7 Gradient flash  chromatography

 

• Gradient flash chromatography 장비 (Buechi, Flawil, Switzerland)의 구성
  two C-605 pumps with a C-615 pump manager,
  a C-635 UV/Vis detector,
  a C-660 fraction collector.
• Chromatography의 수행
  with a flow rate of 40 ml/min
  on a self-packed 150 × 40 mm i.d. polypropylene cartridge
     filled with LiChroprep, 25-40 ㎛, RP-18 Material (Merck KGaA, Darmstadt, Germany).

Flash Chromatography System ,Buchi Reveleris X2, Digital Crystalization

 

 

2.8 LC/time-of-flight mass spectrometry (LC/TOF-MS)

 

• High resolution mass spectra가
  a Bruker Micro-TOF mass spectrometer (Bruker Daltronics, Bremen, Germany) 장비에서 측정.
  referenced with sodium formate. 

HPLC system (Left) and Bruker Daltonics micrOTOF-Q mass spectrometer (center)

 

2.9 Gradient flash  chromatography

 

• [HPLC] Agilent 1200 Series HPLC-system의 구성
  a pump, a degasser, and autosampler
  (Agilent, Waldbronn, Germany)
• [Mass spectorometer] a 4000 QTrap triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometer
     (Applied Biosystems/MDS Sciex, Darmstadt, Germany)
  with an electrospray ionisation (ESI) device
          running in negative ionisation mode,
           with a spray voltage of -4500 V.
  이 Quadruples는 unit mass resolution에서 작동했음.
      ┌ Nitrogen이 a curtain gas (20 psi)로서 기능했고,
      └ the declustering potential은 -10 to -80 V in the ESI- mode.
• 이 Mass spectrometer는
        full scan mode monitoring negative ions로 작동하였음.
• [M-H]^- molecular ions의 특정 product ions로의 fragmentation은
      collision with nitrogen (5 × 10-5 Torr)과
      collision energy of -10 to -70 V에 의해 유도되었음.
• 장비 컨트롤과 데이터 획득을 위해서 the Sciex Analyst software (v1.5)가 사용되었음. 

Agilent 1200 Series HPLC-system, AB Sciex 4000 QTrap mass spectrometer

 

• Coffee beverage 내의 
  furan-2-ymethylated benzene diols와 triols의 HPLC-MS/MS analysis
• [컬럼]
  an analytical 150 × 2.1 mm i.d., 5 ㎛, Luna Phenyl-Hexyl column이
           (Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)
  mass spectrometer에 연결되었음.
         └→ multiple reaction monitoring (MRM), detecting negative ions에서 작동.
• 50 ms의 duration 경우에,
  mass transitions m/z 189→161과 189→67이 화합물 1과 2의 분석을 위해 사용되었음. 
       m/z 205→67과 205→41이 화합물 3의 분석,
       m/z 205→67과 205→43이 화합물 4의 분석, 
       m/z 203→67과 203→159가 화합물 5의 분석,
       m/z 203→67과 203→175가 화합물 6의 분석,
       m/z 297→187과 297→253이 화합물 7의 분석,
       m/z 329→125와 329→203이 화합물 8의 분석,
       m/z 419→309와 419→153이 화합물 9의 분석, 
       m/z 467→341과 467→174가 화합물 10의 분석.
• Nitrogen이 nebulizer gas (65 psi)와
                    turbo gas (350 ℃) for solvent drying (55 psi)로서 작용했음.
• sample injection (5 μl) 후에 chromatography가 수행되었음. 
  ⇒ A flow rate of 250 μl.
  ⇒ 3 min 동안의 aqueous formic acid (0.1% in water)으로 시작하는 a solvent gradient.
  ⇒ 그 다음에 methanol content를 10 min 내에 40%까지 증가시킴. 
  ⇒ 그 다음에는 5 min 내에 60%로 증가시킴. 
  ⇒ 그 다음에는 12 min 내에 70%로 증가시킴.
  ⇒ 최종적으로 2min 내에 100%로 증가시켰음. 
  ⇒ 그리고 나서 추가적인 3 min 동안 methanol content를 유지시켰음. 

 

2.10 Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy

 

• ¹H and ¹³C NMR experiments의 시행
  a DRX 400 spectrometer (Bruker, Rheistetten, Germany)에서 실험 수행.
  샘플들을 d₃-MeOD (Euriso-Top, Giv-Sur-Yvette, France)에 녹였음.
  그런 다음 178×5 mm NMR tubes (Norell, Sp5000 Landisville, USA) at 298 K로 분석되었음. 
• Chemical shifts는
  proton dimension에서 internal standard로서 tetramethylsilane (TMS)를 사용하여, 그리고
  carbon dimension에서 d₃-MeOD (49.3 ppm)의 carbon signal로부터 결정되었음. 
• Data processing은
     Topspin Version 1.3 (Bruker, Rheistetten, Germany)를 사용하여 수행
• 개별 데이터 해석은
     MestReNova® r 5.1.0-2940 (Mestrelab Research S.L., Santiago de Compostela, Spain)에 의해 이뤄졌음.  

Bruker TopSpin  Version 3.2

 

 

 3. Results and discussion

 

3.1  Preliminary studies

 

• Preliminary studies
  ⇒ analytical fractionation approach에 의한 roasted coffee 내의 미지의 bitter taste compounds 식별은
  ⇒ 제한적인 화학적 안정성뿐만 아니라 산화적 안정성에 의해 방해 받는다는 것을 보여주었음.
• 결과적으로,
  ⇒ candidate bitter taste molecules을 제공하는
      putative taste precursors의 targeted reaction과
      roasted coffee에서의 그것들의 natural occurrence의 verification에 기초하는
  ⇒ synthetic-constructive strategy가 더 전망있는 어푸로치일 것이라고 믿어진다. 
• ┌ Furfuryl alcohol, furan-2-aldehyde, 5-(hydroxymethyl)-furan-2-aldehyde와 같은
  │    furan derivatives 뿐만 아니라,
  │      (Belitz, 1977; Moon & Shibamoto, 2009; Shibamoto et al., 1981)
  └ Pyrogallol, hydroxyhydroquinone, catechol, 3-methylcatecol, 4-methylcatecol과 같은
         di and trihydroxybenzenes가
         (Clifford, 1979; Haffenden & Yaylayan, 2005; Lang et al., 2006; Tressl et al., 1978)
      ⇒ roasted coffee samples 내의 다소 덜 반응적인 분자들로 식별되었으로,
  ┌ di/trihydroxybenzenes와
  └ furan derivatives의 열처리된 binary mixtures의 screening이 
      ⇒ 선행연구에서 확인되지 않은, 로스트된 커피 내의 쓴맛 나는 반응산물 후보의 발견을 위한
          효과적인 전략일 것으로 생각되었다. 

 

3.2  Reaction of catechol and furfuryl alcohol
under low-moisture and aqueous conditions, respectively

 

• Preliminary quantitative studies on roasted coffee
  ⇒ catechol과 furfuryl alcohol이 각각 양적으로 지배적인
      dihydroxybenzne과 furan derivative인 것임을 보였으므로,
  ⇒ 이 화합물들의 binary mixture가 
      silica gel 상에서 10 min 동안 180℃에서,
      촉매량(catalytic amount)의 acetic acid 존재 전까지 열처리되었다.
• Cooling 후에, silica gel로부터 반응산물들을 분리하기 위하여,
  그 반응 혼합물은 acetone/water로 추출되었다(extracted).
• 얻어진 추출물(extract)는
  ⇒ a diode array detector 또는 a mass spectrometer에 연결된  RP-HPLC에 의해 분석되었다.
• HPLC analysis는
  ┌ 한 가지 주요 반응산물 (1)과
  │      (21 min 후에 eluting하고, 220 nm과 284 nm에서 UV absorption 최대값들을 나타냄.)
  └ 용출물들 furfuryl alcohol과 catechol을 나타냈다.
• LC-MS analysis (ESI^-)는
  ⇒ pseudomolecular ion ([M-H]^-)로서 m/z 189를 나타냈고
• High resolution mass spectrometry는
  ⇒ target molecule의 경우에 an elemental composition of C₁₁H₁₀O₃를 가리켰다. 
• 1의 amounts가 NMR spectroscopy에 의한 명확한 구조 파악에 너무 작기 때문에,
  catechol과 furfuryl alcohol의 binary mixture가
  ⇒ 소량의 acetic acid를 함유한 aqueous solution에서 120 min 동안 100℃에서 가열되었다.
• Dry-heated 모델 시스템과 aqueous 모델 시스템의 경우에 기록된 HPLC chromatograms를 비교한 결과,
  ⇒ 두 reaction systems 모두의 경우에 동일한 peak pattern을 나타냈다. 
• The model system의 up-scaling이 aqueous system의 경우에 다소 심플했으므로, 
  ⇒ 이 후자의 반응이 preparative scale로 수행되었다.
• Cooling 후에, 그 반응 혼합물은
  ⇒ RP-18 material에 대한 gradient flash chromatography에 의해서 분리되었고
  ⇒ 이어서 preparative RP-18 HPLC를 사용하여 반응산물의 final purification이 이뤄졌고
  ⇒ 그리고 the target compound를 주는 subsequent lyophilization (리오필라자시옹, 凍結乾燥)이 이뤄져,
  ⇒ 98% 이상 순도로(HPLC, NMR) a pale, amorphous power (엷고 비정형의 가루)로서
      pseudomolecular ion m/z 189 (M-H]^-)를 보였다. 
• 1의 경우에 기록된 ¹H NMR spectrum은
  ⇒ 8개의 protons를 통합하는 7개의 resonance signals를 보였다.
• 3.77, 5.96, 6.26, 그리고 7.31 ppm에서 관찰된 resonance signals는
      ⇒ (furan-2-yl)methyl moiety의 protons로 assign되었고
  6.68, 6.52, 그리고 6.64 ppm에서 검출된것은
    ⇒ catechol의 aromatic protons H-C(1), H-(C4), 그리고 H-C(5)에 속하는 것으로 제안되었다.
• Protons H-C(4)와 H-C(5)의 경우에 발견된 8 Hz의 large coupling constant는
    ⇒ catechol moiety 내의 이 2개의 protons의 vicinal position을 나타냈고, 
    ⇒ catechol ring의 C(6)로의 (furan-2-yl)methyl moiety의 linkage를 가리켰다.
• 이는
  ┌ (furan-2-yl)methyl moiety의 carbon atom C(7)과
  └ catechol moiety의 protons H-C(1)과 H-C(5) 간의 HMBC spectrum에서 발견된
      heteronuclear connectivity에 의해 더 강화되었다. 
• 모든 스펙트로스코픽 데이터를 감안할 때, 
  compound 1은 ➡ 4-(furan-2-ylmethyl)benzene-1,2-diols (Fig. 1)인 것으로 명백하게 식별되었다.  
• 비록, compound 1의 구조가 
  1960년에 IR experiments의 기초 위에서 이미 제안되었지만 (Kenzo, 1960; Kenzo, 1961),
  LC-MS와 NMR spectroscopy에 의한 그것의 최종 확인은 우리가 아는 바로는 여전히 부족하다. 
  

 

3.3  Reaction of di/trihydroxybenzenes and furfuryl alcohol

 

• 커피-관련 di and trihydroxybenzens와 furfuryl alcohol로부터 형성되는
  다른 반응산물들을 탐구하기 위해
  첫 번째 comparative analytical scale experiments가 수행되었음.
• ┌→ catechol, resorcin, pyrogallol, hydroxyhydroquinone, 3-methylcatechol, 
  │    4-methylcatechol, caffeic acid or 5-O-caffeoyl quinic acid 각각과 
  └→ furfuryl alcohol in 1% aqueous acid과 결합된 binary mixtures로 실험이 이뤄졌음.
          ├→ heated at 100℃
          ├→ varying in the phenol/furan ratio (1:1, 1:5, 1:10)
          └→ varying in the heating time (10, 60, 120, 240, 480 min)
• 각 reaction mixture는
      a diode array detector와 a mass spectrometer에 각각 결합된 RP-HPLC에 의해서 분석되었다.
• 흥미롭게도,
  반응산물들은 di- and trihydroxybenzenes를 함유한 model systems에서만 독점적으로 생성되었지만,
  반면에 caffeic acid와 5-O-caffeoyl quinic acid는 model experiments에서 적용된 조건들 하에서
             어떤 반응성도 보이지 않았다.
• di/trihydroxybenzenes와 furfuryl alcohol로부터 높은 yields로 반응 산물들을 제공한
  최적화된 반응 조건들이 Table 1에 요약되어있다. 
• 각 타겟 화합물들의 구조 결정을 위해,
  the individual model reactions이 preparative scale로 수행되었다. 
  ⇒ crude reaction mixtures가 gradient flash chromatography에 의해 분리되었고,
  ⇒ 이어서, 타겟 분자들 2-6 (Fig. 1)을 제공하기 위해 semi-preparative RP-HPLC가 이뤄졌다.
• 이 반응 산물의 구조는
      ┌ LC-MS/MS, 
      ├ LC-TOF-MS 그리고 
      └ 1D/2D NMR spectroscopic experiments에 의해서 명백하게 결정되었다. 
  
  
• Resorcinol과 furfuryl alcohol의 반응은
  ⇒ compound 1의 것과 잘 맞는, m/z 189 ([M-H]-)의 pseudomolecular ion을 나타낸
      compound 2 (Fig. 1)를 나타냈다.
• 1의 ¹H NMR spectrum과 다르게, 
  ⇒ proton H-C(4)의 signal이 compound 2에서 6.22 ppm으로 high-field shifted되었고
  ⇒ homonuclear couplings ³J_4,5 (8.0 Hz) and ⁴J_2,4 (2.4 Hz)가
       (furan-2-yl)methyl moiety와 resorcinol moiety의 linkage를 확인해주었다.
• C(7), H-C(5), 뿐만 아니라 H-C(9) 사이에서 관찰된
  heteronuclear connetivities (HMBC)에 의해 강화되었고
• compound 2는
  ➡ 4-(furan-2-ylmethyl)benzens-1,3-diol (Fig. 1)으로 식별되었고
      이는 예전에 보고된 데이터(Kenzo, 1961)를 확인해주는 것이다.  
  
  
• Furfuryl alcohol과 pyrogallol 및 hydroxyhydroquinone 각각과의 reaction mixture로부터
  분리되어진 compounds 3과 4에 대한 LC-MS and LC-TOF-MS analysis는
  ⇒ m/z 205 ([M-H]^-)의 pseudomolecular ion과
  ⇒ 두 isomers의 경우 C₁₁H₁₀O₄의 elemental composition을 보였다.
• 3과 4의 ¹H NMR spectrum은 각각
  (furan-2-yl)methyl moiety에서 기대된 proton signals를 보였다.
       ├→ compound 3의 pyrogallol moiety의 protons (³J=8.3Hz) 뿐만 아니라,
       └→ compound 4의 hydroxyhydroquinone moiety의 2개의 non-coupling, isolated aromatic protons
• 모든 스펙트로스코픽 데이터를 고려할 때,
  이 compounds는 예전에 보고된 바 없는
      ➡ 4-(furan-2-ylmethyl)benzene-1,2,3-triol (3)과
      ➡ 5-(furan-2-ylmethyl)benzene-1,2,4-triol (4)인 것으로 각각 식별되었다. (Fig. 1)
  
  
• Compounds 5 and 6는
  ⇒ furfuryl alcohol과 4-methylcatechol 및 3-methylcatechol과의 reaction mixtures에서 isolaed되었음.
  ⇒ 이 두 가지는 모두 204 Da의 분자량을 보였음.
• 5 and 6의 1H NMR spectra는
  ┌ (furan-2-yl)methyl moiety에 assigned되는 protons와
  └ 4-methylcatechol과 3-methylcatechol의 경우에 기대된
       one arene proton (1 아렌 양자) each가 부족한 proton resonances를 각각 나타냈다.
• HMBC에 의한 signal assignment는
  선행하여 보고된 바 없는
  ➡ 4-(furan-2-ylmethyl)-5-methylbenzene-1,2-diol (5)과
  ➡ 3-(furan-2-ylmethyl)-6-methylbenzene-1,2-diol (6)의 명백한 식별로 이끌었다. 
  

 

3.4  Reaction of di/trihydroxybenzenes and furan-2-aldehyde

 

• Furfuryl alcohol과의 반응에서 
  coffee-related di and trihydroxybenzenes로부터 형성되는 화합물들과
  furan-2-aldehyde의 존재 시에 형성되는 것들과 비교하기 위해
  Analytical scale reactions가 다음의 이원 혼합물들로 수행되었음.
  ┌ catechol, resorcinol, pyrogallol, hydroxyhydroquinone, 3-methylcatechol, 4-methylcatechol,
  │ caffeic acid or 5-O-caffeoyl quinic acid와
  └ furan-2-aldehyde의 binary mixtures
           ├→ in 1% aqueous acid
           ├→ heated at 100℃
           ├→ varying in the phenol/furan ratio (1:1, 1:5, 1:10)
           └→ varying in the heating time (10, 60, 120, 240, 480 min)
• HPLC analysis는
  반응산물들이
  ⇒ 두 분자들의 aromatic ring은
       meta-position에서 hydroxyl groups로 치환된
       resorcin과 pyrogallol을 함유한 model systems에서만 독점적으로 생성되었음을 보였다 (Table 1).
• Structure determination을 위해,
  ⇒ 개별 모델 반응들이 preparative scale에서 수행되었고
  ⇒ crude reaction mixtures가 gradient flash chromatography에 의해 분리되었고
  ⇒ 이어서 purified target molecules 7과 8 (Fig. 2)을 제공하도록
      semi-preparative RP-HPLC가 진행되었음.
  ⇒ 이들은  LC-MS/MS, LC-TOF-MS, 그리고 1D/2D NMR spectroscopy에 의해 식별되었음. 
  
  
• Compound 7에 대한 LC-MS 및 LC-TOF-MS analysis은
          └→ resorcinol과 furan-2-aldehyde의 model reaction으로부터 분리된 화합물
  ⇒ m/z 297 ([M-H]-)의 pseudomolecular ion과 C₁₇H₁₄O₅의 elemental composition을 나타냈음.
  ⇒ 이는 furan-2-aldehyde 한 분자와 resorcin 두 분자들로부터 형성된 반응 산물임을 가리킴.
• ¹H NMR spectrum of 7은
  ⇒ 9개의 protons를 통합하는 7개의 resonance signals를 보였음.
  ⇒ (furan-2-yl)methyl moiety의
       proton signals는 integrals of one을 보인 반면
       resonance signals는 각 2개의 protons에 대해 integrated된 6.18, 6.28, 그리고 6.58 ppm에서 관찰되었고,
  ⇒ 따라서, 타겟 분자 내에 1개의 (furan-2-yl)methyl moiety와
                                       2개의 resorcin moieties를 확인해주었음.
• 추가적으로, HMBC spectrum에서
  ⇒ homonuclear coupling constants ³J_4,5=8.0 Hz와 ³J_2,4=1.5 Hz 뿐만 아니라
       C(7)과 H-C(5)/H-C(5’) 사이에서 관찰된 heteronuclear couplings는
       (furan-2-yl)methyl moiety가 position C(6)에서
       2개의 resorcin 분자들을 브리지하고 있음을 가리켰다.
  ⇒ 이는 molecule 7의
       ➡ 4,4’-(furan-2-ylmethanediyl)dibenzene-1,3-diol (Fig. 2)로의 명백한 식별로 이끌었다.
  
  
• Compound 8에 대한 LC-MS analyses는
            └→ pyrogallol과 furan-2-aldehyde로부터 생성된 것
  ⇒ 330 Da의 분자량을 나타냈고
  ⇒ 타겟 분자 내 2개의 pyrogallol moieties와 1개의 furan-2-aldehyde moiety 존재를 나타냈음.
• compound 8의 ¹H NMR spectrum은
  ⇒ compound 7의 spectrum과 달리,
       arene protons H-C(2)/H-C(2’)가 결핍되고 있었으며
  ⇒ 이는 그 타겟 화합물을 알려진 적이 없는
       ➡ 4,4’-(furan-2-ylmethanediyl)dibenzen-1,2,3-triol (8, Fig. 2)로 식별하도록 이끌었다. 

 

 

 

3.5  Reaction of di/trihydroxybenzenes and 5(hydroxymethyl)furan-2-aldehyde

 

• 5-(hydroxymethyl)furan-2-aldehyde는
  같은 분자 내에 furfuryl alcohol과 furan-2-aldehyde의 reactivity를 결합하고 있어서
  커피-관련 di and trihydroxybenzenes와의 반응에서 어떤 반응 산물들이 형성되었는지에 관해 의문이 발생했다.
• 수행된 모든 analytical model reactions 가운데 (Table 1),
  resorcinol과 pyrogallol이 5-(hydroxymethyl)furan-2-aldehyde와 반응했을 때
  각각 독점적으로 특정 반응 산물을 내었다.
• 이 반응 systems의 semi-preparative up-scaling 후에
  반응 산물 9와 10이 gradient flash chromatography에 의해 분리되었고
  이어서 RP-HPLC가 이뤄진 후
  LC-MS/MS, LC-TOF-MS 그리고 1D/2D spectroscopic experiments에 의해 화학구조가 파악되었다. 
  
  
• Compound 9에 대한 LC-MS 및 LC-TOF-MS analysis
             └→ resorcin과 5-(hydroxymethyl)furan-2-aldehyde로부터 생성된 화합물
  ⇒ m/z 419 ([M-H]^-)의 pseudomolecular ion과
      C₂₄H₂₄O₇의 elemental composition을 나타냈음.
  ⇒ 이는 resorcin 세 분자들이
              5-(hydroxymethyl)furan-2-aldehyde 한 분자와 반응했음을 가리킴.
• ¹H NMR spectrum of 9는
  ⇒ 총 14개의 carbon-bound protons를 통합하는 10개의 resonance signals를 보였음.
  ⇒ 3.74 ppm에서 관찰된 resonance signal은 2개의 protons에 대해 통합됬고
      methylene group H-C(7)으로 할당된 반면,
  ⇒ 5.57, 5.74, 그리고 5.80 ppm에서 resonating하는 3개의 protons는
      전자의 5-(hydroxymethyl)furan-aldehyde moiety의
      protons H-C(9), H-C(10) 그리고 H-C(12)로 assign되었음.
  ⇒ 1H NMR spectrum에서 관찰된 나머지 protons signals는
      3개의 resorcin moieties의 arene protons에 상응되었다.
      각 2개의 protons에 통합된 6.19, 6.28, 그리고 6.63 ppm에서 검출된 signals는
      coupling constants ³J_17/18=8.2, ³J_17'/18'=8.2, ³J_17/15=2.3, ³J_17'/15'=2.3 을 보였고
      H-C(17)/H-C(17’), H-C(15)/H-C(15’), 그리고 H-C(18)/H-C(18’)로 assigned되었다.
  ⇒ 세 번째 resorcin moiety는
       compound 9의 protons H-C(4), H-C(2) 그리고 H-C(5)에 해당하는
       6.20, 6.28, 그리고 6.81 ppm에서 3개의 resonances를 보였다.
• Heteronuclear multiple-bond coherence experiment (HMBC)에 의해서,
  ⇒ heteronuclear correlations가
      carbon C(7)과 proton H-C(5) 사이에서 뿐만 아니라
      methin carbon atom C(12)와 arene protons H-C(18) 및 H-C(18’) 사이에서 관찰되었고
• 따라서 compound 9의 구조를 선행적으로 보고된 바 없는
  ➡ 2-(bis-(2,4-dihydroxy-phenyl)methyl)-5-(2,4-dihydroxybenzyl)furan (Fig. 3)으로
      보여주었다. 
  
  
• Compound 10에 대한 LC-MS analyses는
            └→ pyrogallol과 5-(hydroxymethyl)furan-2-aldehyde로부터 생성된 화합물
  ⇒ LC-MS spectrum에서 m/z 419 ([M-H]^-)의 pseudomolecular ion을 보였고
  ⇒ LC-TOF-MS analysis에 의해서 C₂₄H₂₀O₁₀의 elemental composition을 나타냈음.
• compound 10의 1H NMR data는
  ⇒ 각 benzene moiety에 1개의 arene proton의 결핍만 제외하고는
      compound 9의 경우에 발견된 것들과 다소 유사했다.
• 모든 스펙트로스코픽 데이터를 고려할 때,
  compound 10의 구조는 ⇒ 앞서 알려진 적이 없는
  ➡ 2-(bis-(2,3,4-trihydroxy-phenyl)methyl)-5-(2,3,4-trihydroxybenzyl)furan (Fig. 3)으로
      명확하게 결정되었다.  

 

 

3.6  Taste recognition threshold concentrations

 

• 반응산물들 1-10 뿐만 아니라 그들의 parent di/trihydroxybenzenes의 purity 체크
  ⇒ sensory analysis 이전에
  ⇒ ¹H NMR spectroscopy 뿐만 아니라 HPLC-MS에 의해서.
• Astringent와 bitter compounds의 carry-over effect를 극복하기 위해
  ⇒ 개별 화합물들의 taste threshold concentrations가
  ⇒ sip-and-spit method를 사용하여
      (Brock and Hofmann, 2008; Frank et al., 2007; Frank et al., 2008;
       Scharbert et al., 2004; Stark et al., 2005)
  ⇒ half-tongue test에 의하여
  ⇒ bottled water (pH 6.0)에서 결정되었다. 
• Trained panel
  ⇒ 12명의 센서리 subjects
  ⇒ 평가되는 각 화합물들의 clear bitter taste 뿐만 아니라 astringent mouthfeel을 인식했다.
• 화학구조에 따라서, recognition thresholds는
  ■ astringency의 경우는 ⇒ 16에서 900 μmol/L의 범위였고
  ■ bitter taste의 경우는 ⇒ 100에서 1800 μmol/L의 범위였다 (Table 2). 
• 각 화합물들의 부류에 있어서,
  다른 furan moieties로 한 di and trihydroxybenzenes의 조정은
  taste threshold concentrations의 유의한 변화를 유도했다. 

 

 

• 다양한 반응 산물들이 
  Pyrogallol 파생물들(3, 8, 10)을 제외하고는,
  그 parent di and trihydroxybenzenes 보다 더 낮은 bitter taste 식역 농도를 나타냈다.
  예를 들어, resorcin의 쓴맛 식역은
                 furfuryl alcohol,
                 furan-2-aldehyde, 그리고
                 5-(hydroxymethyl)furan-2-aldehyde와의 반응 후에
                 각각 2.2배(2), 10.2배 (7), 그리고 5.3배 (9) 만큼 감소했다 (Table 2). 
• 흥미롭게도, compound 1과 4의 화학구조들은
  ⇒ 3-((2-furylmethyl)sulfanyl)benzen-1,2-diol (11)의 구조와
      3-((2-durylmethyl)sulfanyl_benzene-1,2,4-triol (12)의 구조와
      동일한 carbon skeleton을 공유했는데,
  ⇒ 이들은 커피 음료들에서 최근에 식별된 것들이고,
  ⇒ Fig. 4에서 보인 odour-active 2-furfurylthiol과
      ┌ catechol과
      └ hydroxyhydroquinone 각각의 oxidative coupling으로 형성될 수 있는 것으로 발견되었다.
         (Müller, Hemmersbach, Van’t Slot, & Hofmann, 2006; Müller and Hofmann, 2007).
• 이런 구조적 유사성은
  ⇒ thio ethers 11과 12 (Table 2)의 taste activity를 탐구하게 했다.
• Compounds 11과 12 는
  ⇒ 1 (537 µmol/L)과 4 (317 µmol/L)의 경우에 발견된 데이터와 다소 가까운
       350과 135 µmol/L의 쓴맛 인식 식역들을 보였는데,
  ⇒ 이는 11과 12 에서의 추가적인 sulphur atom이
       그 화합물 부류의 쓴맛 활성도에 유의하게 영향을 미치지 않음을 보여주는 것이다. 

 

 

3.7  Identification of bitter compounds in coffee brew

 

• Coffee beverages에서 di/trihydroxybenzenes과 furan derivatives로부터 형성되는 
  bitter tasting reaction products의 발생을 검증하기 위해,
  ⇒ medium roasted coffee beans로부터 갓 마련된 음료를
  ⇒ multiple reaction monitoring (MRM) mode에서 작동하는
      HPLC-MS/MS (ESI^-)에 의하여 compounds 1-10에 대해 분석하였다.
• 분석 이전에, 분석을 돌리면서 각 개별 화합물들의 경우에
  특징적인 mass transitions와 optimized instrument settings가 선정되었다.  
• 커피에서 검출된 각 타겟 화합물들과
  상응하는 레퍼런스 화합물들의
  ⇒ Retention time 뿐만 아니라 characteristic mass transitions를 비교한 결과,
  ⇒ 커피 샘플에서 bitter tastants 1, 3, 5, and 6이 명백하게 식별되었다 (Fig. 5). 
• 또한, 커피 내의 이 화합물들의 정체가
  ⇒ model reaction systems로부터 분리되어진
      상응하는 레퍼런스 화합물과의 co-chromatography에 의해서 확인되었다. 
• 흥미롭게도,
  ⇒ 로스트된 커피에서 발견된 모든 화합물들(1, 3, 5, 6)은
      ┌ di and trihydroxybenzenes와
      └ furfuryl alcohol과의 반응에서 생성되는 반면,
  ⇒ 화합물들 2, 4, and 7-10은,
      즉, 각각 furan-2-aldehyde와
            5-(hydroxymethyl)furan-2-aldehyde로부터 생성되는 것들은
      coffee brew에서는 검출될 수 없었다. 

 

 

 4. Conclusions

 

• 본 연구에서 얻어진 데이터는 
  커피 로스팅 시
  O-caffeoylquinic acids의 분해로 생성된,
  ┌ di- and trihydroxybenzenes catechol,
  ├ pyrogallol,
  ├ 3-methylcatechol, 그리고
  └ 4-methylcatechol이
  ⇒ furfuryl alcohol과 다시 반응하여
  ⇒ 로스트된 커피 내의 새로운 부류의 쓴맛 화합물로서
     (furan-2-yl)methylated benzene diols and triols를 낳는다는 것을 명확하게 보여준다. 
  
  
• 수행된 model reactions에 기초하여,
  ⇒ furfuryl alcohol의 acid-catalysed dehydration은
      transient intermediate로서 furfuryl cation을 주고
  ⇒ 이는
       di- and trihydroxybenzenes와의 electrophilic substitution을 통하여 반응하여
       bitter tasting (furan-2-yl)methylated benzenes 1, 3, 5, and 6 (Fig. 6)을 낳는다고
      결론지을 수 있다.
  
  
• 반대로, 
  로스트된 커피에서 일찍 식별된 sulphur-containing bitter compounds 11과 12는
         (Müller, Hemmersbach, Van’t Slot, & Hofmann, 2006; Müller and Hofmann, 2007) 
  ⇒ odour-active 2-furfurylthiol의,
       ┌ di and trihydroxybenzenes catechol과 
       └ hydrohydroquinone 각각에 대한 oxidative coupling 중에 생성된다.
  
  
• 커피 음료들의 bitterness에 대한
  이 4가지 새로운 쓴맛 화합물들의 percent abundance을 보이기 위해서
  ⇒ 그것들에 대한 정확한 정량화를 위한
      a stable isotope dilution analysis의 개발이 현재 진행중에 있다. 

 

 

 

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