커피의 脂質

20.1 Introduction

상업적 가치가 가장 큰 커피 種은
┌ Coffea arabica L.과
└ Coffea canephora Pierre var. robusta로, 일반적으로 "아라비카"와 "로부스타" 커피로 알려져 있다.
이 두 種은 官能的特性과 化學的組成 모두에서 중요한 차이점을 보인다.
아라비카 커피 생두의 脂質 함량은 평균 약 15%인 반면,
로부스타 커피는 약 10%로 훨씬 적다.
대부분의 脂質(lipids), 소위 커피 오일은
⇒ 생두의 內胚乳(endosperm)에 있으며,
⇒ 소량의 커피 왁스(coffee wax)만이 생두의 바깥층에 있다.
비교적 큰 不鹼化物 부분(unsaponifiable fraction)에는
⇒ 카우란 계열(kaurene family)의 디테르펜(diterpenes),
⇒ 주로 카페스톨(cafestol), 카웨올(kahweol), 16-O-methylcafestol이 풍부하게 함유되어 있으며,
⇒ 이는 다양한 생리적 효과로 인해 최근 몇 년 동안 점점 더 많은 관심을 받고 있다
(see Coffee: Consumption and Health Implications).
더욱이, 16-O-methylcafestol은
⇒ 커피 블렌드에 로부스타 원두가 함유되어 있음을 나타내는 신뢰할 수 있는 지표이다.
不鹼化物 부분의 일부이기도 한 스테롤(sterols) 중에서, 다양한
데스메틸스테롤(desmethylsterol), 메틸스테롤(methylsterol), 그리고 디메틸스테롤(dimethylsterol)이
식별된 바 있다.
커피 生豆의 脂質 부분(lipid fraction)의 평균 조성 백분율은 Figure 20.1에 제시되어 있다.

20.2 Coffee Oil

20.2.1 Total Oil Content

아라비카 커피 생두의 지질 함량(lipid content)은 건조 기준으로 평균 약 15%인 반면,
로부스타 커피는 그보다 훨씬 적은 약 10%이다.
대부분의 지질, 즉 커피 오일은 ⇒ 그 커피 콩의 胚乳(endosperm)에 위치하며,
소량인 커피 왁스(coffee wax)만이 ⇒ 外皮에 존재한다.
粗 커피 오일(crude coffee oil)의 수율은
⇒ 그 콩들의 조성(composition) 뿐만 아니라,
⇒ 추출 조건(composition),
용매 선택(choice of solvent), 그리고
특정 입자 크기(particular particle size)에 따라 달라진다.
수율의 차이가 크기 때문에 “커피 오일”이라는 용어를 더 명확하게 정의할 필요가 있다.
볶은 커피(焙煎豆)의 오일 함량은 그린 커피(生豆)보다 높은데,
이는 로스팅 과정에서 전체 건조 물질 함량 손실이 발생하기 때문이며,
이 손실은 로스팅 정도에 따라 달라진다.
그러나 실제 지질 손실량은 적다 [1].
그린 커피 오일(커피 생두의 오일)은 디테르펜 함량이 높아 사람이 섭취하기에 적합하지 않다.
그럼에도 불구하고, 지방산(fatty acids)과 디테르펜(diterpenes)이 제공하는
피부 진정 효과(emollient properties)와 그리고
인체 피부에 유해한 것으로 입증된 자외선의 차단 효과 덕분에
그린 커피 오일은 수년간 화장품 산업에서 널리 사용되어 왔다 [2].
결함이 있는 그린빈에서 추출한 커피 오일은
바이오디젤(biodiesel) 생산의 원료로 활용될 가능성이 제기되기도 했다 [3].
커피 오일의 화학적 조성을 심층적으로 연구하기 위해서는,
⇒ 酸 처리 없는 직접 용매 추출(direct solvent extraction without acid treatment)이 필요하다.
Picard 외 연구진에 따르면 [4],
⇒ 몇몇 저자들이
디에틸 에테르(diethyl ether),
다양한 끓는점 범위를 가진 석유 에테르(petroleum ether),
n-헥산(hexane), 그리고
디에틸 에테르와 n-헥산의 혼합물을 사용했다.
⇒ 연구 결과는 균질하지 않았는데,
⇒ 선택한 용매에 따라
카페인과 같이 극성이 더 강하고 지질 함량이 더 낮은 물질도 부분적으로 추출되었기 때문이다.
Folstar et al.[5]은
⇒ 용매 추출에서 얻을 수 있는 수율은
커피가 최종적으로 분쇄되는 입자 크기에 따라 달라진다는 것을 보여주었다.
Speer [6]는
⇒ 입자 크기가 0.25~0.63 mm인 분쇄 커피를 추출하고,
⇒ 위험한 디에틸 에테르(diethyl ether)를 피해서 tertiary butyl methyl ether를 추출 용매로 사용했다.
⇒ 이 방법은 DIN 방법 10779 (ref. 7)로 채택되었으며, 다음과 같이 설명되어 있다:
⇒ 볶은 커피 원두를 일반 커피 분쇄기에서 굵게 분쇄하고 0.63mm 체에 통과시킨다.
체로 걸러진 물질 5g을 막자사발(mortar)에서 황산나트륨(sodium sulfate)과 함께 분말화한 후,
Soxhlet (4시간)에서 tertiary butyl methyl ether로 추출하고,
시간당 6~7회 siphoning 해준다.
용매를 증발시키고 잔류물을 일정한 무게(105 ℃)로 건조한다.
추출 시간을 길게(6, 8 또는 10시간) 설정해도 지질 함량은 증가하지 않는다.
생두의 경우, 분쇄기를 사용하여 드라이아이스와 함께 분쇄한다.
⇒ 결과적으로, 遊離 디테르펜(free diterpenes)과 같은 극성 물질의 수율이 높아졌다.
de Azevedo et al. [8]이
⇒ 제안한 초임계 이산화탄소(supercritical carbon dioxide)를 이용한 추출법은
디테르펜 분석에 매우 편리한 것으로 보인다.

20.3 Fatty Acids

20.3.1 Total Fatty Acids and Fatty Acids in Triacylglycerides

대부분의 지방산(fatty acids)은 ⇒ 결합된 상태로 존재한다.
약 75%는 트리아실글리세리드(triacylglycerides) (TAG)에서 글리세롤(glycerol)과 에스테르化되어 있고,
약 20%는 디테르펜(diterpenes)과 에스테르화되어 있으며,
소량은 스테롤 에스테르(sterol esters)와
소위 카르복실산-5-하이드록시트립타미드(carboxylic acid-5hydroxytryptamides, C-5HT)에 존재한다.
Triacylglycerides는
⇒ 팔미트산(palmitic acid, P), 리놀레산(linoleic acid, L),
스테아르산(stearic acid, S), 올레산(oleic acid, O)으로 구성된 분자종이며,
⇒ PLL, PLP, PLO + SLL, LLL, OLL, OLO, POP, SOS가 현재까지 확인된 전형적인 TAGs 종들이다.
또한, TAG 구성 및 농도 측면에서
아라비카와 로부스타 종 간의 중요한 차이점을 강조하는 것이 중요하다.
따라서 아라비카 샘플은 LLL 농도가 더 높으며, 아라비카는 6.1%, 로부스타는 3.7%의 특징적인 비율을 보인다.
그러나 아라비카는 OLO 함량이 1.1%로 로부스타의 2.3%보다 낮다는 특징이 있다.
이는 PLO + SLL에도 해당한다.
실제로 아라비카는 PLO + SLL 함량이 13.8%로 로부스타의 16.4%보다 낮다 [9].
Folstar et al.[5], Picard et al.[4], Speer et al.[10]은
⇒ 트리아실글리세리드(triacylglycerides),
스테롤 에스테르(sterol esters),
디테르펜 에스테르(diterpene esters)의 지방산들을 분석했다.
Folstar et al.[5]은 다양한 지질 계열을 분리하기 위해 Florisil 컬럼을 사용했다.
Speer et al. [10]은
⇒ 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography)를 통해 triacylglycerides를 분리하고,
⇒ 메틸화칼륨(potassium methylate)으로 에스테르 교환 반응을 수행한 후 (transesterified),
⇒ RTX 2330으로 코팅된 60μm 용융 실리카 모세관 컬럼을 사용하여
⇒ 메틸화된 지방산(methylated fatty acids)을 크로마토그래피 분석했다.
⇒ 총 지방산(total fatty acids)과
트리아실글리세리드 내 지방산(fatty acids in the triacylglycerides) 간에는 유의미한 차이가 없었다 [11].
⇒ 아라비카와 로부스타 커피의 경우,
로스팅 과정에서 트랜스 지방산(trans fatty acid) 레벨,
특히 C18:2ct와 C18:2tc 함량이 증가한다는 점에 유의해야 한다 [12].

20.3.2 Free Fatty Acids

커피에 존재하는 遊離脂肪酸(free fatty acids, FFA)은 여러 저자들에 의해 기술되었다 [13–16].
그러나 이러한 모든 데이터는 지방 분석에 사용되는 일반적이지만 간접적인 측정 방법인 酸價(acid value)로 표현되었다.
커피의 경우, 이 滴定法(titration method)은 遊離脂肪酸 자체 뿐만 아니라 다른 酸化合物도 포함하기 때문에, 매우 근사치에 불과하다.
따라서 Speer et al.[10]은 遊離脂肪酸을 직접 측정하는 방법을 개발했다.
⇒ 위에서 언급한 BioBeads S-X3를 이용한 겔 크로마토그래피 시스템을 사용하면,
⇒ 3차 부틸 메틸 에테르(tertiary butyl methyl ether)로 추출한 커피 지질을
세 가지 개별 분획으로 나눌 수 있다:
┌ 트리아실글리세리드를 포함하는 분획,
├ 디테르펜 지방산 에스테르(diterpene fatty acid esters)를 포함하는 분획, 그리고
└ 遊離지방산을 포함하는 분획이다.
⇒ 후자는 BF3/메탄올(BF3/methanol)로 전환시키고,
모세관 가스 크로마토그래피를 통해 메틸 에스테르(methyl esters)로 측정하였다.
9가지 遊離脂肪酸들이 검출되었다; 로부스타와 아라비카 커피에 각각 매우 균일하게 분포되어 있다.
두 커피 種 모두에서
⇒ 주요 지방산은 C18:2와 C16이었다.
⇒ C18, C18:1, C20, C22는 다량 검출되었지만,
⇒ C14, C18:3, C24는 미량만 검출되었다.
아라비카와 로부스타의 차이는
⇒ 크로마토그램(Figure 20.2)에서
스테아르산(stearic acid)과 올레산(oleic acid) 함량을 비교할 때만 드러난다.
⇒ 로부스타에서는 스테아르산의 비율이 올레산의 비율보다 현저히 낮지만,
아라비카 커피에서는 이 두 酸의 비율이 거의 같다.
⇒ Stearic acid/oleic acid 비율은 커피 블렌드에서 로부스타에 대한 첫번째 지표가 될 수 있다.
Martin et al. [17]은
⇒ 가스 크로마토그래피 분석에서 얻은 데이터를 처리하는 기본 도구로
Principal Components Analysis (PCA)과
Linear Discriminant Analysis (LDA)을 사용했다.
⇒ PCA는 올레산, 리놀레산, 미리스틴산(myristic acid)을 고려하여
아라비카와 로부스타 종을 분리할 수 있도록 한다.
Rui Alves et a. [18]은
⇒ 생두와 로스팅된 커피 품종의 진위 여부를 판별하기 위해 지방산 프로필을 분석했다.

20.4 Diterpenes in the Lipid Fraction
of Robusta and Arabica Coffees

커피의 주요 디테르펜(diterpenes)은
⇒ 카우란 골격(kauran skeleton)을 기반으로 하는
오환식 디테르펜 알코올(pentacyclic diterpene alcohols)이다.
Bengis & Anderson [19], Chakravorty et al. [20,21], Wettstein et al. [22],
Haworth & Johnstone [23], 그리고 Finnegan & Djerassi [24] 등은
⇒ 커피 디테르펜 중 두 가지인
┌ 카웨올(kahweol)과
└ 카페스톨(kahweol)의 구조를 규명했다.
⇒ 두 물질 모두 산, 열, 빛에 민감하며, 특히 카웨올은 정제된 형태에서 불안정하다.
1989년, 로부스타 커피콩에서 16-O-methylcafestol (16-OMC)이 분리되었고,
⇒ 그 구조는 NMR, GC/MS, 결정들에 대한 X-ray 분석 및 합성을 통해 밝혀졌다.[25,26]
로부스타 커피콩에서
16-O-methylkahweol (16-OMK)과 함께
또 다른 O-methyl diterpene이 확인되었다 [11].
⇒ 이 디테르펜의 구조식은 Figure 20.3에 정리되어 있다.

아라비카 커피에는 cafestol과 kahweol이 함유되어 있으며,
로부스타 커피에는 cafestol과 소량의 kahweol(건조 중량 0.1g kg⁻¹ 미만), 그리고
로부스타 커피 콩들에서만 측정되는 16-OMC가 함유되어 있다 [26, 27]
(Figures 20.4 및 20.5).
아라비카 커피 콩에 16-OMC가 존재하지 않는다는 사실은
Frega et al. [28], White et al. [39], Trouche et al. [30],
Kamm et al. [31], D'Amelio et al. [32], 그리고 최근에는 Monakhova et al. [33]에 의해 확인되었다.
로스팅 과정에서도 안정성을 유지하는 16-OMC는
⇒ 아라비카 커피 블렌드에서 로부스타를 신뢰성 있게 검출하는 데 이상적인 품질 특성이 되었다.[27]

여기서 16-OMC는
⇒ 아라비카 커피 콩에서는 검출되지 않았지만,
⇒ 아라비카 커피 나무의 다른 부분, 예를 들어 잎에서 발견되었다는 점을 언급해야 한다 [34].
다양한 분광법들을 사용하여 명확하게 식별된 16-OMK는
다양한 로부스타 커피들의 생두와 로스팅된 원두 모두에서 측정되었다 [11].
⇒ 이러한 결과는 이 성분이 코페아 스테노필라(Coffea stenophylla)에만 존재한다고 기술한
de Roos et al. [35]의 주장과 대조된다.
언급된 그 디테르펜은 커피 콩들에만 존재하는 고유한 화학 물질이다.
디테르펜인 카페스톨, 카웨올, 16-OMC, 16-OMK는 주로 다양한 지방산들과 에스테르화되어 있으며,
遊離 형태로 존재하는 것은 2~3%에 불과하다.
총 디테르펜 량을 분석하기 위해, 분쇄 커피 콩 또는 추출된 커피 오일을 비누화(saponified)했다.
⇒ 그런 다음, 비누화 되지 않는 물질에서 디테르펜을 GC를 사용하여[26,28] 또는
아세토니트릴/물을 용리액으로 사용하는 RP-HPLC를 사용하여
직접 측정했다 (Nackunstz and Maier, 1987,36 Speer, 1989,6 그림 20.6 참조).
파생체화(derivatization) 없이 GC 또는 GC/MS를 사용하여
遊離 디테르펜(free diterpenes)을 분석할 경우,
⇒ 아티팩트(artefact)를 방지하기 위해
분할/비분할 주입기(split/less injector) 대신
콜드온컬럼 주입기(cold-on-column injector)를 사용해야 한다 [37].
독일에서는 로스팅된 커피의 16-OMC 측정을 위한 검증된 방법이
⇒ 독일표준화연구소(German Institute for Standardization)의 DIN 방법 10779 (참고문헌 7)로 발표되었다.
⇒ Speer [6]의 HPLC 방법을 기반으로 하는 이 DIN 방법은
아라비카 커피와 블렌딩된 커피에서 2% 미만의 로부스타 성분을 검출할 수 있다.

그 검증된 DIN 방법 10779 (ref. 7)는 좋은 결과를 보여준다.
그러나 이 방법은 시간이 많이 소요되고,
특히 첫 번째 단계인 커피 오일 추출로 인해 많은 양의 유기 용매가 필요하다.
따라서 커피 시료는 사전 지질 추출 없이 바로 비누화되었다.
⇒ 이 방법을 적용하면 인스턴트 커피에서도 16-OMC를 정량할 수 있다 [38].
추출 속도를 높이기 위해
⇒ liquid–liquid extraction 대신
⇒ kieselguhr(硅藻土)(absorbent diatom earth 흡착성 硅藻土)를 사용하는
SPE(Suppression Peroxide)를 사용한다 (Figure 20.7).

DIN 방법[7]과 유사하게, 최대 2%의 함량을 측정할 수 있다.
⇒ 소량의 遊離 16-OMC가 포함되지 않는다는 점을 고려하면, 얻어진 결과는 유의미하다.
⇒ 분석에 2~3일이 걸리는 DIN 방법과 비교했을 때, 약 3~4시간만 소요된다.
⇒ 시간 절약 외에도 용매 소비를 상당히 줄일 수 있다.
아라비카에서 로부스타 부분에 대한 분석에는 다른 여러 방법이 적용되었다 :
⇒ Kamm et al. [31]이 개발한 온라인 LC-GC 방법이다.
또한 NMR을 사용하면 생두와 로스팅된 커피를 별도의 정제 과정 없이 직접 분석할 수 있다 [32,33].
⇒ 최대 2% 및 3% 그리고 그 이상의 함량이 정량화될 수 있을 것이다;
결과적으로, 인스턴트 커피에서 16-OMC의 존재를 입증하는 것은 불가능하다.
몇몇 연구들에서 근적외선 분광법(Near-Infrared Spectroscopy, NIR)을 다루었으며,
아라비카와 로부스타라는 두 커피 종의 차이점이 명확해졌다.
그러나 커피는 카페인, 클로로겐산과 그 파생체들, 다당류, 단백질, 지질 등 다양한 유기 분자가
소량 또는 다량으로 결합된 형태이다.
⇒ 따라서 모든 분자가 NIR 스펙트럼에 미치는 영향을 분석하는 것은 어렵다.
그러므로 NIR은 커피 산업에 귀중한 도구가 될 수 있지만,
여기서 정의된 물질들을 분석해야 하기 때문에 그 결과는 법정에서 유효하지 않을 것이다 [41–43].
마찬가지로, Keidel et al. [44]과 Wermelinger et al. [45]은
⇒ 아라비카 생두와 로부스타 커피 생두를 구별하기 위해
라만 분광법(Raman spectroscopy)을 수행했다.
Wermelinger et al.은
⇒ Soxhlet 시스템을 사용하여 로부스타와 아라비카 커피 추출물(extracts)을 얻었다.
⇒ 그런 다음 용질을 추가 정제 없이 라만 분광법으로 분석했다.
⇒ 2개의 라만 피크들, 카웨올에 특징적인 피크와 지방산에 특징적인 피크 간의 강도 비율을 통해
주어진 혼합물의 로부스타 함량을 측정할 수 있다.
⇒ 제시된 연구에서 모델 시스템의 검출 한계는 4.9%에서 7.5% 사이였다.

20.4.1 Free Diterpenes

디테르펜(diterpenes)인 카페스톨(cafestol), 카웨올(kahweol), 16-OMC는
遊離 형태로는 커피 오일에서 미량 성분으로만 존재한다.
이들을 정량화하려면
⇒ 지질 부분의 주요 화합물,
즉 분석을 방해하는 디테르펜 에스테르(diterpenes esters)와
트리아실글리세리드(triacylglycerides)로부터 분리하는 효과적인 방법이 필요하다.
⇒ 겔 투과 크로마토그래피를 사용하면
遊離 디테르펜 분획을 후속 RP-HPLC로 분석할 수 있다 [46,47].
⇒ 각각의 총 함량에서 遊離 디테르펜(free diterpenes)의 비율은 일반적으로 3.5% 미만이다.
⇒ 일부 로부스타 커피에서만, 0.1 g/kg⁻¹ (건조 중량) 미만인 소량의 total kahweol 때문에,
미량의 카웨올 흔적이 예상대로 검출되었다.
遊離 디테르펜(free diterpenes)과 遊離 지방산(free fatty acids)의 양은 생두의 보관 조건에 영향을 받았다.
⇒ 저온 및 건조 보관은 카페스톨 함량을 약간만 증가시켰지만,
⇒ 5℃와 40℃에서 보관한 잘 건조되지 않은 커피들에서는
total cafestol 함량의 최대 16%까지 더 높은 함량으로 측정되었다.
⇒ 그 이유는 리파아제(lipase) 효소의 활성 때문이었다.
⇒ 저온과 낮은 수분 함량은 이 효소를 가역적으로 억제했다 [48].
이 효소를 검출하기 위해 저자들이
수정한 리파아제 테스트 (Roche Company for clinical diagnostics)를 사용하여
다양한 ages의 커피를 분석했다 [48].
⇒ 이 검사는 특정 기질인 1,2-O-dilauryl-rac-glycero-3-glutaric acid-resorufin ester 가수분해를
기반으로 했다 (Figure 20.9).
⇒ 디아실글리세리드(diacylglycerides)에서 분리된 후,
나머지 분자는 알칼리성 매질에서 글루타르산(glutaric acid)과 레조루핀(resorufin)으로
자발적으로 해리되었다.
⇒ 레조루핀(resorufin)은 λ = 572 nm에서 광도 측정으로 검출할 수 있다.
⇒ 붉은색 염료의 강도는 리파아제의 활성에 비례한다.

먼저, 분쇄 커피를 아스코르브산나트륨(sodium ascorbate) 용액으로 추출했다.
⇒ 효소 활성을 측정하기 위해 이 용액의 일부를 알칼리성 완충액과 발색 시약과 혼합했다.
⇒ 소멸률을 측정한 후, 혼합물을 37℃에서 6시간 동안 배양하고 소멸률을 다시 측정했다.
⇒ 커피 시료의 소멸률이 空시험 결과의 소멸률보다 높을 때 리파아제 활성이 확인되었다.
⇒ 이를 통해 신선한 커피 뿐만 아니라 최대 10년까지 보관된 커피의 리파아제 활성도 측정이 가능했다.
로스팅 과정 전에 커피 콩들을 찌면(steaming)
⇒ 선택한 스티밍 파라미터들에 따라 개별 遊離 디테르펜 함량이 감소한다 [50,51].
⇒ 강력한 찌는 과정(2bar에서 120분)을 통해 遊離 카웨올이 완전히 분해되었다.
찐 커피(steamed)와 찌지 않은 커피(unsteamed coffee)가 모두 이용 가능하다면,
⇒ 遊離 카웨올 함량은 찐 커피를 평가하는데 유용한 도구가 될 것이다 [52].

20.4.2 Diterpene Fatty Acid Esters

1987년까지는 서로 다른 지방산들을 함유하는 카페스톨(cafestol) 및 카웨올(kahweol)의 에스테르(esters)가
몇 가지만 보고되었다 [5,53–55].
Speer 연구팀은 16-OMC의 에스테르를 추가로 여러 개 발견했다 [58,59].
⇒ Gel chromatography를 이용하여 디테르펜 에스테르를 스테롤 에스테르와 함께 분리하였고,
스테롤 에스테르는 실리카 카트리지에서 고체상 추출법을 사용하여 제거했다.
⇒ 로부스타의 경우, 카페스톨과 카웨올 에스테르를 포함하는 분획 하나와
16-OMC 에스테르를 포함하는 분획 하나를 얻었으며,
아라비카의 경우 단 하나의 분획만 얻었다.
⇒ 이후 acetonitrile/isopropanol을 용리액으로 사용하여 RP-HPLC로 분석하면
개별 에스테르를 정량할 수 있다.
Figure 20.10은
⇒ 로부스타 커피 샘플의 카페스톨 에스테르에 대한 반분취 크로마토그램을 보여주고,
Figure 20.11은
⇒ 동일 샘플의 16-OMC 에스테르에 대한 크로마토그램을 보여준다.
Figure 20.12, Table 20.1에
⇒ 아라비카 커피의 카페스톨과 카웨올 에스테르가 제시되어 있다.

C14, C16, C18, C18:1, C18:2, C18:3, C20, C22, C24와 같은 지방산을 갖는 cafestol esters와
C20:1 지방산 및 C17, C19, C21, C23과 같은 홀수 번호의 지방산을 갖는 에스테르들이 식별되었다.
이러한 데이터는 16-OMC를 갖는 지방산들의 경우에서 확인되었으며,
카웨올의 경우에도 유효한 것으로 보인다 [60,61].
개별 디테르펜 에스테르는 커피 오일에 불규칙적으로 존재했다.
⇒ 홀수 번호의 지방산 에스테르는 미량 성분인 반면,
⇒ 팔미트산(palmitic), 리놀레산(linoleic), 올레산(oleic), 스테아르산(stearic), 아라키드산(arachidic),
그리고 베헨산(behenic acid)으로 에스테르화된 디테르펜은 더 많은 양으로 존재하여 [56-58],
각 디테르펜의 거의 98%를 차지했다.

20.4.3 Synthesis of Diterpene Esters

정량 분석을 위해서는 표준 물질이 필요하다.
⇒ 그러나 遊離 디테르펜(free diterpenes)은 매우 고가이며,
⇒ 디테르펜 에스테르(diterpene esters)는 시중에서 구할 수 없다.
⇒ 따라서 표준 물질은 커피 오일에서 분리하거나 합성해야 한다.
⇒ 이를 위해서, 遊離 디테르펜을 다른 지질 성분들과 함께 커피에서 추출하여
비누화 반응을 통해 분리할 수 있다.
커피 오일에서 디테르펜 에스테르(diterpene esters)를 분리하는 것은 합성 프로세스보다 더 어려울 수 있다.
⇒ 개별 화합물의 양에 따라 비용이 매우 많이 들 수 있다.
⇒ 따라서 cafestol esters와 16-OMC esters의 합성 방법이 개발되었다.
디테르펜은 酸에 민감하기 때문에, 에스테르화(esterification)에는 온화한 절차가 필요하다.
아인혼 변이체(Einhorn variant)에 따르면 알칼리성 환경에서의 반응이 유리하다.
⇒ 피리딘(pyridine)을 촉매로 사용하면,
알코올은 카르복실산 염화물(carboxylic acid chlorides)을 통해 전환되는데,
이러한 염화물과의 반응은 해당 酸과의 반응보다 훨씬 쉽고 수율이 높기 때문이다.
카페스톨을 에스테르화하는 기술은 Kaufmann and Hamsagar [13]에 의해 처음 기술되었다.
⇒ 카페스톨은 그 배취(batch)를 냉각하면서,
벤젠과 피리딘(3+1, v/v)의 용매 혼합물에서 지방산 염화물을 통해 전환되었다.
⇒ 개별 에스테르들의 경우에,
그들은 45% (cafestol arachidate and cafestol linolate)에서
55%(cafestol palmitate and cafestol stearate) 사이의 수율을 얻었다.
⇒ 독성학적 이유로, 벤젠(benzene)을 톨루엔(toluene)으로 분배(dispense)한 경우에는,
더 낮은 수율을 얻었다.
⇒ 사용된 화학물질의 양을 거의 변경하지 않고,
Kaufmann and Hamsagar가 기술한 방법에 따라 다양한 cafestol esters를 생산했다 [53].
입체 장애가 있는 遊離 히드록시基(free hydroxyl group) 때문에
16-OMC esters의 합성에는 더 강력한 촉매인 4-dimethylaminopyridine이 필요하다.
⇒ 이 물질을 사용하면 피리딘을 촉매로 사용할 때보다
아실化(acylation) 반응이 훨씬 빠르고 수율이 높다.
⇒ 용매로 n-hexane과 pyridine (5+1, v/v)을 사용하여
8가지 다른 16-OMC 에스테르의 합성이 성공적으로 수행되었다 [58].
⇒ 반응 후, 생성된 디테르펜 에스테르(diterpene ester) 뿐만 아니라
遊離 지방산과 전환되지 않은 디테르펜이 반응 용기에 존재한다.
⇒ t-butyl methyl ether와 탄산나트륨(sodium carbonate) 용액 사이의
liquid–liquid extraction을 통해 遊離 지방산을 분리할 수 있다.
⇒ 이후, 실리카겔 컬럼에서 고상 추출(solid-phase extraction)을 통해
그 에스테르로부터 디테르펜을 분리할 수 있다.
⇒ 시료를 컬럼으로 옮긴 후,
먼저 에스테르를 n-hexane과 ethyl acetate (9+1, v/v)의 혼합물로 용출한다.
⇒ 그런 다음, 전환되지 않은 디테르펜을 에틸 아세테이트로 용출하여 추가 합성에 재사용할 수 있다.
⇒ 합성을 통해 얻은 다양한 디테르펜 에스테르의 수율은 Table 20.2에 정리되어 있다.
⇒ 수율은 사용된 디테르펜의 양과 직접적인 관련이 있다.
⇒ 에스테르의 순도(purity)는
질량 분석법과 다이오드 어레이 검출기(diode-array detector)를 연결한 HPLC를 통해 측정했다.
⇒ 또한, 몰 흡광 계수(molar extinction coefficients)를 측정했는데,
이 계수들은 매우 달랐으며 지방산의 구조에 따라 달라지는 것으로 보였다 (Figure 20.13 참조).
⇒ 따라서 정밀한 정량화를 위해서는 여러 개의 개별 에스테르들이 필요하다.

20.4.4 Other Diterpene Compounds

20.4.4.1 Atractylosides

커피에서 발견되는 또 다른 중요한 디테르펜 파생체 그룹은
⇒ 아트락틸로사이드(atractylosides) 계열로, 주로 배당체로 존재한다
(Obermann and Spiteller, 1976, Maier and Wewetzer, 1978,
Aeschbach et al., 1982, Bradbury and Balzer, 1999) [62–65].
Total bean glycoside contents (총 콩 배당체 함량)은 약 1~5 g/kg으로 다양했다.
열처리 시, 해당 아트락틸리게닌 배당체(atractyligenin glycosides)로의 탈카르복실화(decarboxylation) 반응이
빠르게 일어났다.
아트락틸리게닌 배당체는 로스팅에 비교적 안정적이었으며, 다크 로스팅 조건에서는 함량이 약 절반으로 감소했다 [65].

20.4.4.2 Arabiol

아라비올(arabiol)에 대해 말하자면,
콜롬비아산 습식 가공 아라비카 커피 생두에서 한 디테르펜 파생체(diterpene derivative)가 추가로 확인되었다.
이 커피 콩들은
수분 함량(6.2%, 11.5%, 13.8%) 및
온도(12°C, 25°C, 40°C)와 같은 다양한 주요 요인의 조건에서
18개월 동안 특수 포장지에 담아 정해진 대기(산소 함량: 2%, 5%, normal)에서 보관했다
(Speer and Kölling-Speer, 2006).[11]
신선한 커피 콩들과 달리 크로마토그램에서 추가 신호가 검출되었다 (Figure 20.14).

새로운 물질의 구조는
⇒ ¹H 및 ¹³C NMR spectroscopy을 통해 결정되었으며,
⇒ 모든 양성자 및 탄소 신호의 정확한 할당은 2D NMR 기술인 COSY, HSQC, HMBC, NOESY를 통해 수행되었다.
⇒ 카페스톨과는 대조적으로, 새로운 화합물은
방향족(aromatic) 또는 올레핀(olefinic) 구조의 다른 수와 배열을 나타낸다.
¹H/¹³C-correlated HSQC 스펙트럼들은 방향족 영역에 6개의 CH=基를 나타내며,
NOESY 스펙트럼은 양성자 배향을 제공한다.
⇒ 12/13-H, 13/2-H, 2/1-H, 4/3-H correlations를 이용하여
이러한 양성자들의 결합 배위(coordination of the linkage)가 명확해졌다.
⇒ Mass spectrometry와 NMR 데이터를 결합하여, Figure 20.15에 나타난 구조식을 추정할 수 있다.
⇒ 이 물질의 IUPAC 명칭은
8-(hydroxymethyl)-11b-methyl-4b,5,6,7,8,9,10,11,11a,11b-decahydro-6a,9-methanocyclohepta[a]
phenanthren-8-ol이다.
(2002년 ACD/Labs™ IUPAC Name Educators Pack 14.5 버전 6.0 소프트웨어에 따름).
⇒ 본 장의 저자들은 이 이름을 아라비올(arabiol)이라고 제안했다 [66].

20.4.4.3 Coffeadiol

표준 물질로서 cafestol의 분리 중에, 새로운 화합물이 검출되었다.
실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 후속 반분취 RP-HPLC를 사용하여 그 물질을 분리했다.
구조 규명은
NMR 분광법(¹H-NMR, ¹³C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY),
mass spectroscopy, 그리고 X-ray crystal structure analysis를 통해 수행되었다.
고분해능 EI 질량 스펙트럼은
⇒ 분자식 C₁₉H₃₀O₂를 설명하는 m/z 290.225의 분자 이온 피크를 나타냈다.
⇒ 물과 히드록시메틸(hydroxymethyl)의 연속적인 손실로 인해
m/z 272.215(C₁₉H₂₈O), m/z 259.206(C₁₈H₂₇O), 그리고 m/z 241.195(C₁₈H₂₅))에서
세 개의 더 강한 단편 피크(fragment peaks)가 나타났다.
¹³C-NMR 스펙트럼 (Table 20.3)은 새로운 화합물의 탄소 원자 數가 총 19개임을 나타낸다.
⇒ 그 탄소 원자(carbon atoms)는
DEPT 스펙트럼에서 메틸기(methyls) 2개, 메틴(methines) 2개, 메틸렌(methylenes) 10개,
4차 탄소 원자(quaternary carbon atoms) (sp2) 2개,
4차 탄소 원자(quaternary carbon atoms) (sp3) 3개로 확인되었다.
⇒ 두 4차 탄소 원자 사이에 이중 결합이 1개 존재함은
¹³C-NMR (δ = 129.6 and 126.6 ppm)을 통해 확인되었다.
HMBC 스펙트럼은
⇒ 메틸基 1개(δ=1.612 ppm)의 양성자와
double bond C4, C5, 그리고 C6의 4차 탄소 원자(quaternary carbon atoms) 2개 사이에
강한 교차 피크(cross-peaks)를 보여준다.
⇒ 결과적으로, 이 메틸기는 C5에 위치한다.
NOESY 스펙트럼은
⇒ 메틸 양성자(δ = 0.85 ppm)와 양성자 H8α, H2α, H11α, H16α 사이에 교차 피크를 나타낸다.
⇒ 이는 탄소 원자 C10에 메틸기가 위치하는 것으로만 해석할 수 있다.
⇒ 만약 카페스톨처럼 탄소 원자 C9에 위치한다면,
양성자 H16α를 가진 C10의 NOE 피크는 나타나지 않아야 한다.

결정 구조를 X-ray single crystal method로 분석하여
메틸基(methyl group) C18이 기존 디테르펜과 비교하여 실제로 다른 탄소에 결합되어 있음을 확인했다.
추정된 구조는 확인되었으며(Figure 20.16), 분석 결과 H bridged dimer의 존재가 나타났다.
⇒ 카페스톨과 비교했을 때, 새로운 구조의 가장 중요한 차이점은
⇒ 푸란 고리(furan ring)의 부재와 메틸기 1개의 위치이다.
⇒ 14-(Hydroxymethyl)-5,10-dimethyltetracyclo-[11.2.1.01,10.04,9]hexadec-4-en-14-ol은
밝은 노란색 결정(융점 110°C)으로 얻어졌다.
⇒ 일반적인 명칭으로 코페아디올(coffeadiol)이 제안되었다 (Kurt and Speer, 1999) [67].

20.4.5 Diterpenes in the Lipid Fraction of Roasted Coffees

로스팅 과정에서 여러 가지 새로운 디테르펜 화합물들이 생성된다.
로스팅된 커피에서 cafestol과 kahweol의 두 가지 분해 산물인
┌ dehydrocafestol (디하이드로카페스톨)과
└ dehydrokahweol (디하이드로카웨올)이 확인되었다 (Figure 20.17).
⇒ 두 화합물의 함량은 로스팅 온도가 높아질수록 증가하지만,
생두 내 카페스톨과 카웨올의 함량에도 영향을 받는다 [27,68,69].

커피의 로스팅 정도에 대한 객관적인 특성을 찾으려면 cafestol/dehydrocafestol 비율이 적합하다;
⇒ 따라서 25~40의 비율은 잘 로스팅된 커피를 의미하고,
15 이하의 비율은 강하게 로스팅된 커피를 의미한다.
⇒ 그러나 더 강하게 로스팅 된 에스프레소 커피의 비율은 10~15.69이다.
Cafestal (카페스탈)과 kahweal (카웨알) (Figure 20.17)은
⇒ 상업용 로스팅 커피에서 검출된 cafestol (카페스톨)과 kahweol (카웨올)의
두 가지 새로운 분해 산물이다 [70].
high-resolution mass spectrometry와 다양한 NMR 실험을 통해 로스팅 커피에서
⇒ 세 가지 새로운 디테르펜이 확인되었다 [71,72].
2005년에는
┌ isokahweol (이소카웨올)과
└ dehydroisokahweol (디하이드로이소카웨올) (Figure 20.18), 그리고
2008년에는
⇒ secokahweol(세코카웨올)(Figure 20.19)이 식별되었다.
강하게 로스팅된 커피 샘플의 일반적인 HPLC 크로마토그램이 Figure 20.20에 제시되어 있다.
새로운 컬럼과 예를 들어 UHPLC를 사용하면
분리 효율 저하 없이 6분 이내에 분석을 수행할 수 있다 (Figure 20.21 and Figure 20.22) [73,74].

20.4.6 Diterpenes in Coffee Beverages

커피 음료의 센서리 품질은 다양한 요인에 의해 부정적인 영향을 받을 수 있다.
⇒ 건조된 생두는 로스팅 전 최대 3년까지 보관된다는 점을 고려할 때,
보관 조건은 커피 음료의 이취 발생에 영향을 미치는 주요 요인이다.
⇒ 부정적인 향미 변화는
“moldy (곰팡이 냄새)", "earthy (흙 냄새)", "raw-old (오래된 냄새)", "woody (나무 냄새)"로 설명된다.
⇒ 모든 원산 지방들이 후자의 영향을 받는 것은 아니지만,
생두 보관조건이 이러한 유형의 이취를 발생시키는 것으로 추정된다.
⇒ 특히, 지질 분획은 이취 발생의 전구체로 제시된다 [48].
여러 연구들에서 특별히 마련된 커피를 섭취하면 혈청 콜레스테롤 수치가 증가할 수 있다고 보고했다.
여과되지 않은 커피를 사용하는 국가에서
⇒ 혈청 LDL 콜레스테롤 수치가 높은 경우가 많았기 때문에,
⇒ 이러한 효과는 커피에 존재하는 지질 때문이라고 추론되었다.
이러한 지질은 물에 잘 녹지 않지만, 우려내는 방법에 따라 커피에 포함될 수 있다.
⇒ 초기에는 triacylglycerides (트리아실글리세리드)가 이러한 효과의 원인으로 여겨졌지만,
⇒ 최근 몇 년 동안 디테르펜(diterpenes), 특히 카페스톨(cafestol)과 카웨올(kahweol)이
遊離 형태와 palmitate esters (팔미트酸鹽 에스테르) 형태로
혈청 콜레스테롤 수치에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 [76–80].
⇒ 다른 디테르펜은 아직 테스트되지 않았다.
더욱이, diterpenes (디테르펜)의 긍정적인 효과가 보고된 과학 논문이 상당수 존재한다.[81–84]
⇒ Lam et al. [81]은 카페스톨이
glutathione-S-transferase (글루타치온-S-트랜스퍼라제) 활성을 자극하여
xenobiotica (제노바이오티카)의 분해를 촉진한다는 것을 보여주었다.
⇒ 다른 저자들은 cafestol(카페스톨)과 kahweol(카웨올)이
아플라톡신 aflatoxin B1-유도적 유전독성(genotoxicity)으로부터 보호한다고 보고했다 [82–84].
⇒ 따라서, 다양한 방식으로 마련되는 커피 음료들에서의 디테르펜 존재에 대한 연구는 매우 중요하다 [85–90].
Sehat et al. [86]은
16-OMC esters를 예로 들어,
친유성 디테르펜 에스테르(lipophilic diterpene esters)가
커피 추출액(coffee infusion)으로 유입되고 인스턴트 커피 과립에서도 검출 가능하다는 것을 보여주었다.
⇒ 음료 내 디테르펜 에스테르의 양은
method of preparation에 따라 크게 달라지며, 커피 브루의 총 지질 함량과 직접적인 관련이 있다.
⇒ 일반 가정용 커피 머신으로 마련한 필터 커피의 경우, 총 지질 함량은 커피 분말 지질의 0.2% 미만이었다.
반대로, 에스프레소를 마련할 때는 그 머신과 선택한 매개변수들에 따라 지질의 2~4%가
미세 분쇄 에스프레소 커피에서 커피 브루으로 분산되었고, 따라서 디테르펜도 마찬가지였다.
⇒ 스칸디나비아 스타일로 커피를 마련했을 때는 커피 분말 지질의 최대 22%가 함유되어 있었다.
⇒ 커피 음료 내 디테르펜의 비율 분포는 로스팅된 커피 분말의 분포와 거의 동일했다.
2007년 네덜란드 Consumentenbond [91](소비자연합)은
머신에서 마련된 커피가 혈청 콜레스테롤 수치를 증가시킬 수 있다고 보고했다.
⇒ 부정적인 생리적 효과로 인해 커피 추출 시 이러한 성분을 줄이는 조건이 주목을 받고 있다.
⇒ 에스프레소 머신의 시장 점유율이 증가함에 따라, 그 저자들의 연구 목적은 다양한 방법으로 추출된
에스프레소 커피의 카페스톨 함량을 연구하는 것이었다 (Buchmann et al., 2010) [90].
⇒ 상업적으로 로스팅된 아라비카 커피를
산업용 원심분리 그라인더 (VTA6S, Stahwert Mühlenbau, Germany)를 사용하여 분쇄했다.
⇒ 입자 크기 분포는 sieve shaker AS 200 tap (Retsch, Germany)에서 다양한 체(90~1000 μm)를
사용하여 측정했다.
⇒ 커피 브루는 에스프레소 머신를 사용하여 진행했다.
⇒ 그라인드 사이즈(아래 참조) 외에도 다양한 추출 조건으로
물 온도(80, 95, 110℃), 커피 양(6.5, 7.5, 8.5g), 물 양(40, 65, 90ml)을 조절했다.
⇒ 갓 추출한 커피는 즉시 동결건조했다.
⇒ 그런 다음 건조 잔류물을 비누화하고, 비누화할 수 없는 물질을 분리한 후,
자외선 검출기를 갖춘 HPLC로 카페스톨을 정량했다.
⇒ 비교 가능한 조건을 확보하기 위해, 이 연구 전체에 걸쳐 로스팅된 아라비카 커피 한 잔을 사용했다.
⇒ 카페스톨 함량은 0.46g/100g으로 측정되었다.
⇒ 로스팅된 아라비카 커피 원두를 원심분리형 분쇄기(centrifugal mill)를 사용하여 세 가지 설정으로 분쇄했다.
⇒ 얻어진 전하량을 입자 크기 분포와 관련하여 분석했다.
⇒ 곱게 분쇄된 커피와 중간 분쇄된 커피 사이에는 분명히 약간의 차이만 있었다.
⇒ 주요 입자 크기는 315~500μm였다.
⇒ 중간 분쇄된 커피는 입자 크기가 500~630μm 사이에서만 차이가 있었다.
⇒ 이와 대조적으로, 거칠게 분쇄된 커피는 주로 700μm보다 큰 입자로 구성되었다 (Figure 20.23).

7.5g의 분쇄 로스트 커피로 마련된 95℃의 물 65ml로 뽑은 에스프레소 음료에 대해 분쇄도의 영향을 연구했다.
⇒ 입자 크기가 미세할수록 추출 수율이 높았다 (Figure 20.24).
⇒ 카페스톨 함량과 관련하여, 특히 중간 분쇄 등급과 거친 분쇄 등급 간의 차이가 현저했다.
컵당 2mg에서 0.6mg으로 감소한 것으로 관찰되었다.
그러나 에스프레소의 경우, 거친 분쇄 커피는 적용할 수 없었다.
⇒ 따라서 중간 분쇄 등급과 미세 분쇄 등급을 사용하여 다음 연구를 수행했다.

통계적 스크리닝 디자인을 사용하여 추출 매개변수들을 최적화하고
주효과(main effects), 상호작용 효과(interaction effects), 그리고 이차효과(quadratic effects)를 평가했다.
⇒ 유의한 요인들을 파악한 후, Box–Behnken design을 사용하여 최적의 작업 조건을 도출했다.
⇒ Figure 20.25는 중간 분쇄도에 대한 3차원 반응 표면도를 보여준다.
⇒ 커피의 양이 증가함에 따라 카페스톨 수율은 거의 선형적으로 증가했다.
⇒ 특히 물의 량이 동시에 증가함에 따라 에스프레소 추출에서 카페스톨 추출 수율이 최대치에 도달했다.

예상대로, 곱게 분쇄된 커피는 전반적으로 카페스톨 함량이 더 높았다.
⇒ 곱게 분쇄된 커피 분말의 표면적이 넓어짐에 따라 추출 수율이 증가했다 (Figure 20.26).
⇒ 8.5g의 커피와 90ml의 물에서 2.7mg의 카페스톨을 추출하는 가장 높은 수율을 보였다.
⇒ 중간 분쇄 등급과는 대조적으로, 물 양을 늘리고 커피 양을 일정하게 유지한 경우,
카페스톨 함량은 약간만 감소했다.
입자 크기(particle size) 외에도
⇒ 커피/물 비율이 추출액의 카페스톨 함량에 영향을 미치는 가장 중요한 요인인 것으로 나타났다.
⇒ 에스프레소 음료의 추출 파라미터들을 변경함으로써, 카페스톨 함량은
컵당 2.6mg (110°C에서 중간 분쇄 커피 분말 10g, 물 180mL)에서
컵당 0.9mg (80°C에서 거칠게 분쇄 커피 분말 8g, 물 70mL)으로 감소했다.
그러나 카페스톨 함량이 낮고,
결과적으로 지질 함량도 낮은 커피 음료는 커피 소비자의 감각을 만족시키지 못할 것이다.
따라서 카페스톨 함량과 감각적 인상(sensory impression) 사이에서 적절한 타협점을 찾아야 한다.

20.5 Sterols

지난 몇 년 동안 식물성 스테롤(phytosterols)은 그 유익한 특성으로 인해 더욱 중요해졌다.
피토스테롤은 콜레스테롤 수치를 낮추고 항암 효과도 있는 것으로 보고되었다.
또한, 면역 조절 효과도 보고되었다 [92,93].
커피 오일에는 다른 종자유에서도 흔히 발견되는 여러 스테롤들이 함유되어 있다.
4-desmethylsterols 외에도 다양한 4-methyl- and 4,4-dimethylsterols가 식별되었다.
주요 스테롤들의 구조식은 Figure 20.27~20.29에 제시되어 있다.

커피 오일의 스테롤들은
⇒ 遊離 형태(약 40%)와
에스테르 형태(약 60%)로 모두 기술되었다(Picard et al., 1984) [4].
불검화물(unsaponifiable matter)에서의 그 총량이 GC 또는 GC/MS를 이용하여
TM-derivatives로서 측정되었다.
종종 TLC, HPLC 또는 실리카겔 카트리지를 사용하여,
데스메틸(desmethyl), 4-메틸 및 4,4-디메틸스테롤(dimethylsterols)에서
분획화가 수행되었다 (Alcaide et al., 1971, Itoh et al., 1973, Picard et al., 1984, Horstmann and Montag, 1986, Homberg and Bielefeld, 1989, Speer, 1989) [4,6,94–98].
Desmethylsterols (데스메틸스테롤)은
⇒ 총 스테롤 분획(total sterol fraction)의 90%를 차지하며,
이는 지질의 1.5%에서 2.4% 범위였다 (Picard et al., 1984) [4];
⇒ Nagasampagi et al. (1971)은 5.4%로 더 높은 함량을 보고했다 [99].
다양한 로부스타 및 아라비카 커피 샘플의 주요 desmethylsterols 분포가 Table 20.4에 나와 있다.
주요 스테롤은 약 50%를 차지하는 β-sitosterol (시토스테롤)이며,
그 다음으로 stigmasterol (스티그마스테롤), 캄페스테롤(campesterol), 그리고
Δ5-avenasterol (아베나스테롤)이 있다.
이 중 Δ5-avenasterol은
⇒ 아라비카 커피보다 로부스타에서 훨씬 더 많이 발견되며,
⇒ 로스팅 과정에서도 높은 안정성을 유지하여 커피 블렌드 연구에 적합하다
(Duplatre et al., 1984, Saltor et al., 1989, Frega et al., 1994, Valdenebro et al., 1999,
Dussert et al., 2008) [28,100~103].
⇒ 로부스타 콩들은 아라비카 콩들 보다 Δ5-avenasterol 함량이 5배 더 높다
(1.7g 100g⁻¹ vs. 350mg 10kg⁻¹, Kamm et al., 2002) [31].
그러나 다양한 천연 함량으로 인해 아라비카 커피 혼합물 내의 로부스타 부분을 결정하는데는
약 20% 이상만 적합하다. (diterpene 섹션 참조).

Picard et al.[4]는
⇒ free sterols와 sterol fatty acid esters를 컬럼 크로마토그래피 (aluminium oxide 산화알루미늄)를
이용해 분리했다.
⇒ 12가지 로부스타 커피 샘플들을 분석하면서, 그들은
total sterols에 비해 main sterols의 경우에 변화된 분포를 발견했다.
⇒ Free sterols의 경우에, 그 순서는 stigmasterol > β-sitosterol > campesterol이었고,
⇒ sterols esters의 경우에는 β-sitosterol > campesterol > stigmasterol의 순서였다.
⇒ Picard et al.는 또한 sterol esters 내의 개별 지방산들을 연구했다.
⇒ C18, C16, 그리고 C18:1이 주요 화합물들이었고, 구성비율 분포는 triglycerides에서 보고된 것과 비슷했다.
⇒ Cholesterol, campesterol, stigmasterol, β-sitosterol, stigmastanol, Δ5-avenasterol,
Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, citrostadienol, gramisterol, cycloartenol, 그리고
traces of 24-methylenecycloartenol이 식별되었고
⇒ 여러 coffee infusions, 즉
Scandinavian style coffee, espresso, 그리고 filtered coffee에서 정량화되었다 [105].
식품 및 식이 보충제에 스테롤 글루코사이드(sterol glucosides)가 존재한다는 것이
Phillips et al.[106]에 의해 입증되었다.
최근 Buchmann et al.[107]에 의해
⇒ 아라비카와 로부스타 커피 생두에서 스테롤 글루코사이드가 처음으로 분리 및 분석되었다.
Figure 20.30은
⇒ Oelschlägel et al.[108]이 호박유(pumpkin oils)의 free sterols와 esterified sterols (에스테르化 스테롤)에
대해 처음 개발한 수정된 분석 체계를 보여준다.
⇒ 세 가지 스테롤 분획을 얻었는데,
첫 번째는 sterol fatty acid esters(스테롤 脂肪酸 에스테르)를 함유하고,
두 번째는 free sterols (遊離 스테롤)을 함유하고,
세 번째는 sterol glucosides (스테롤 글루코사이드)를 함유하고 있다.
⇒ 스테롤 脂肪酸 에스테르는 비누화(saponification) 및 誘導體化(derivatization) 후 분석하였고,
遊離 스테롤은 GC/FID를 통해 실릴化(silylation) 후에 분석하고 나서
β-sitosterol를 통해 정량화했다.
⇒ 스테롤 글루코사이드의 분리는
다이오드 어레이 검출기(diode array detector)가 장착된
Phenomenex Synergi 4 μ Fusion 250×3 mm에서 수행되었다.
⇒ 정량 분석은 분자 내 이중결합(double bounds) 수에 따라 β-sitosterol 또는 stigmasterol을
사용하여 수행되었다.

아라비카 커피 생두와 로부스타 커피 생두에서 얻은
스테롤 에스테르(sterol ester) 분획의 전형적인 GC chromatograms는
Figure 20.31에 trimethylsilyl (TMS) derivatives로 표시되어 있다.
후속 스테롤 글루코사이드(sterol glucosides)의 HPLC chromatograms는
Figure 20.32에 제시되어 있다.
식별된 sterol glucosides의 중요한 ESI mass spectrum 데이터는 Table 20.5에 나와 있다.
Figure 20.33은
HPLC로 정량화된 검출된 스테롤 글루코사이드의 ESI 질량 스펙트럼을 보여준다.
Total sterols의 8%에서 12%가 sterol glucosides였다.
결과적으로 sterol fatty acid esters가 주요 분획(main fraction)을 대표하고,
그 다음으로 free sterols이 나타난다 (Figure 20.34).
생두들의 주요 개별 스테롤들에 대한 세 그룹의 퍼센트 分布가 Figure 20.35에 제시되어 있다.
stigmasterol의 분포는 β-sitosterol 및 campesterol의 분포와 다르다는 것이 분명해진다.
네 가지 스테롤 글루코사이드의 개별 함량은 Figure 20.36에 나타나 있다.

20.6 Tocopherols

커피 오일에 토코페롤(tocopherols)이 존재한다는 사실은 Folstar et al.[109]에 의해 처음으로 보고되었다;
α-tocopherol은 명확하게 식별되었고,
TLC와 GC로 분리되지 않은 β- tocopherol과 γ-tocopherol은 하나의 그룹으로 간주되었다 (Figure 20.37).
Cros et al. [110] 또한 HPLC로 β-tocopherol과 γ-tocopherol을 합하여 측정했다.
Folstar et al. [109]는
α-tocopherol의 농도가 89~188 mg kg^-1 oil이고,
β-tocopherol과 γ-tocopherol의 농도가 252~530 mg kg^-1 oil 임을 확인했다.

1988년, Aoyama et al. [111]은
다양한 종류의 커피 콩들에서 α-, β-, γ- tocopherols을 분석했는데, 총 함량은 5.5–6.9 mg/100 g⁻¹ coffee 이었다.
Ogawa et al. [112]은
HPLC를 이용하여 14종의 생두, 그들의 볶은 원두, infusions(우려낸 액), 그리고
38가지의 인스턴트 커피에서 토코페롤 함량을 측정했다.
⇒ 생두의 총 토코페롤 함량은 최대 15.7mg/100^-1 g이었고, 평균은 11.9mg/100^-1 g이었다.
⇒ α- 및 β-토코페롤 함량은 각각 2.3~4.5mg/100^-1 g과 3.2~11.4mg/100^-1 g이었다.
⇒ γ- 및 δ-토코페롤은 검출되지 않았다.
⇒ 로스팅은 α-, β-토코페롤 및 총 토코페롤의 함량을 각각 79~100%, 84~100%, 83~99%로 약간 감소시킨다.
GC-MS와 HPLC를 사용하여 Speer & Kölling-Speer는
일부 로부스타 커피에서 γ-토코페롤을 검출했다 (Figure 20.38) [113].
González et al. [114]의 결과는
⇒ 생두보다 로스팅 된 커피에서 γ-토코페롤 함량이 더 높다는 점에서 약간 이해하기 어렵다.

20.7 Coffee Wax

생두 표면에는 얇은 왁스층(thin waxy layer)이 덮여 있다.
커피 왁스(Coffee wax)는
일반적으로 염소계 유기 용매를 사용하여 커피 콩들로부터 추출에 의해 얻어진 물질로 정의된다.
표면 왁스의 양은 생두 100g⁻¹당 약 0.2~0.3g이다.
커피 왁스의 주요 성분은 ➡ 소위 carboxylic acid-5-hydroxytryptamides (C-5HT)이다.
세로토닌의 아미드들(amides of serotonin) (5-hydroxytryptamine, 5HT) 그리고
다양한 사슬 길이의 지방산들의 아미드인 이 물질군은
Wurziger와 동료들에 의해 처음 소개되었다 [115,116].
⇒ 그들은 arachidic acid (아라키드산)(C20),
behenic acid (베헨산)(C22),
lignoceric acid (리그노세르산)(C24)을 가진
세 가지 5HT를 분리하고 특성 분석했다 (Figure 20.39).
나중에 Folstar는
stearic acid-5HT 뿐만 아니라
20-hydroxy-arachidic-acid-5HT 및
22-hydroxy-behenic acid-5HT도 설명했다 [117,118].

여러 연구팀이 생두, 볶은 커피, 그리고 다양한 처리 과정을 거친 커피들의
C-5HT 함량을 측정하는 분석 방법을 개발했다.
처음에는
thin layer chromatography with spectral photometric or
densitometric determination (분광 광도계 또는 농도계로 측정하는 박막 크로마토그래피)로 분석한 후 [122~124],
liquid chromatography with UV detection at 278 nm로 분석했다 [117,125,126].
280nm 여기 파장(excitation wavelength)과
330nm 방출 파장(emission wavelength)에서
형광 검출(fluorescence detection)를 이용한 HPLC 분석 외에도, LC-MS/MS 분석법도 제시되었다 [119-121].
Figure 20.40은 ➡ 로부스타 커피의 C-5HT에 대한 일반적인 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
분쇄된 콩들은 가속 용매 추출법(accelerated solvent extraction)(ASE)을 사용하여 추출하였고,
주입 전에 고체상 추출법(solid phase extraction)(SPE)으로 추출물을 정제하였다 (Hinkel and Speer, 2005) [121].
⇒ 이 방법의 recovery rate은 약 90%,
limit of detection은 2.5 mg kg⁻¹, variation coefficients는 5% 미만이었다.
⇒ C-5HT 함량은 합성 표준물질(DE-특허 102008025893 A1)128을 기반으로 계산하였으며,
다양한 처리 시료와의 비교를 위해 모든 값은 건조 중량을 기준으로 하였다.

크로마토그램의 처음 15분 동안에는 하이드록시 및 불포화 지방산(hydroxy and unsaturated fatty acids)을 함유한 C-5HT가 용출되는 반면,
포화 지방산(saturated fatty acids)을 함유한 C-5HT는 retention times가 18분 이상이다.
Arachidic acid-5-hydroxytryptamide와
behenic acid-5-hydroxytryptamide dominate, 그리고 기타 아미드들은 미량 성분이다.
Figure 20.41에서는
➡ 로부스타와 아라비카로 구분된, 분석 커피 생두 샘플들의 표준 편차를 포함하여 총 함량을 제시한다.
⇒ C-5HT의 총 함량과 관련하여, 아라비카 커피의 양은 로부스타 커피의 양보다 거의 두 배 높았다.
⇒ 두 種 간의 차이는 다양한 커피들의 C-5HT 量 분포와 관련하여도 분명해졌다.
⇒ 분석된 로부스타 커피의 약 90%가 1.20 mg kg⁻¹ 미만의 C-5HT 함량을 보인 반면,
아라비카 커피의 90%는 1.40 mg kg⁻¹을 초과하는 값을 보였다.
⇒ arachic-5HT 신호의 피크 면적을 참조하여 다양한 C-5HT 신호의 피크 면적비를 비교하면,
아라비카와 로부스타 커피 간의 또 다른 차이점을 관찰할 수 있다.
⇒ 로부스타 샘플에서는 arachic acid-5HT와 behenic acid-5HT의 양이 유사하여 피크 면적비가 1이다;
이와 대조적으로
⇒ 아라비카 커피에서는 arachic acid-5HT의 양이 2배 더 높아서 두 신호의 비율이 2배에 달한다.

┌ 폴리싱(polishing),
├ 왁스제거(dewaxing),
├ 스티밍(steaming), 또는
└ 카페인 제거(decaffeinating)와 같은
기술적 처리를 통해 커피 콩들의 왁스층을 제거하면 소화가 더 잘 되는 커피 브루가 추출된다 [125,129,131].
⇒ 따라서 1933년, 커피 원두가 특정 커피 애호가들에게 미치는 자극 효과를 최소화하기 위해
최초의 스티밍 방법이 개발되었다 [132].
⇒ 시간이 지남에 따라 이 방법은 반복적으로 개선되었다 [133–135].
C-5HT가 커피 왁스의 주요 성분이지만,
이것이 처리되지 않은 커피의 바람직하지 않은 효과의 유일한 원인일 가능성은 낮다.
⇒ 이러한 가정의 한 가지 이유는 C-5HT의 낮은 수용성(2.3 mg l⁻¹)이며,
⇒ 또 다른 이유는 처치 받지 않은 콩들로 만든 퍼콜레이드된 커피 브루에는 존재하지 않기 때문이다 [130].
Fehlau & Netter [136]는
⇒ 쥐의 위 점막에 대한 커피 액(coffee infusions)의 영향을 연구하면서 비슷한 결론을 내렸다.
커피 원두를 증기 처치(steaming)하면
⇒ 왁스층의 부분적 제거를 낳고, 따라서 C-5HT도 부분적으로 제거된다.[137]
未-處置 콩들과 處置된 콩들의 total C-5HT 함량을 비교했을 때, C-5HT 손실량은 30%에 해당한다.
그러나 증기 처치가 다양한 C-5HT에 미치는 영향은 명백하다.
⇒ Hydroxy fatty C-5HT의 감소율은 약 40%인 반면,
불포화(unsaturated) C-5HT는 약 20%의 비율로만 감소했다.
⇒ 프로세싱 파라미터(시간, 온도)를 변경해도 30% 이상의 추가 감소는 발생하지 않는다.
⇒ 즉, 파라미터와 관계없이 트립트아미드(tryptamides) 총량의 약 30%가 항상 동일하게 감소한다.
커피의 C-5HT 함량은 매우 다양하기 때문에,
샘플의 C-5HT 총량만을 보고 "처치됨(treated)" 또는 "미처리됨(untreated)"이라고 단정 지을 수는 없다.
⇒ Kahweol과 cafestol의 유리 함량과 같은 다른 파라미터들도 고려해야 한다.
커피의 또 다른 중요한 가공 방법은 디카페인 프로세싱이다.
⇒ 다양한 디카페인 방법들의 효과를 분석되었고, 그 결과가 ➡ Figure 20.42에 기록되어 있다.
⇒ 한 CO₂ method (A)은 약 20%의 감소를 가져오는 반면,
다른 CO₂ method (B)은 총 C-5HT 함량을 60% 감소시킨다.
⇒ 디클로로메탄(dichloromethane)과 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 사용하여
디카페인 공정을 수행했을 때, 총 C-5HT 함량에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다.
최대 85%의 감소가 관찰되었다.

또한, C-5HT는 로스팅 과정에서 부분적으로 분해된다 [125,138].
Figure 20.43은
➡ 약배전, 중배전, 강배전으로 로스팅한 두 종류의 아라비카 커피와
한 종류의 로부스타 커피의 결과를 보여준다.
⇒ C-5HT 함량의 감소는 커피 콩들을 찐 경우보다 뚜렷하지 않다.
⇒ 로스팅 정도에 따라 약배전에서는 7%, 중배전에서는 12%, 강배전 컬럼비아에서는 약 17%의 분해가 발생한다.
⇒ 로스팅 프로세스는 원두를 찐 것과 유사하기 때문에
hydroxy fatty acids를 가진 C-5HT 그룹에 가장 큰 영향을 미쳤다.
⇒ 약배전 조건에서도 이 그룹의 양은 약 20% 감소하며,
다른 그룹과 달리 로스팅 정도가 증가해도 이 수준을 유지한다.

Viani and Horman [139]은
⇒ carboxylic acid-5HT의 열분해 경로를 제안했지만,
⇒ 추정된 성분 중 일부만 Zahm et al. [140]에 의해 확인되었다 (Figure 20.44).
이들을 상용 표준 화합물들 및 문헌의 질량 스펙트럼들과 비교했을 때,
주요 비휘발성 분해산물은
⇒ serotonin(세로토닌), 5-hydroxyindole (하이드록시인돌) (5HI),
3-methyl-5-hydroxyindole (5-hydroxyskatol, 5HS), 그리고
3-ethyl-5-hydroxyindole로 확인되었다.[141]
⇒ 熱負荷增加로 인해 로스팅 시간이 길어지면서 언급된 화합물의 추가 열분해가 발생했고,
동시에 octadecanamide(옥타데칸아미드), octadecanenitrile (옥타데칸니트릴), 그리고
octadecanoic acid(옥타데칸산)으로 확인된 다른 화합물의 생성도 증가했다.
⇒ 불포화 지방산과 장쇄 지방산(long chain fatty acids )(C21 및 C20:1)으로 구성된 C-5HT를 사용한
로스팅 실험에서 상응하는 분해 화합물들이 식별되었다 [141].

20.7.1 Pyrolysis/GC-MS Experiments

합성된 C-5HT가 열분해 스터디를 위해 사용된 바 있다 [141].
Figure 20.45에서, C18-5HT의 Py/GC-MS chromatogram가
⇒ alkanes 및 alkenes (C6–C17) 그리고
⇒ 다음과 같은 이미 식별된 분해 산물들인
5-hydroxyindole (1),
3-methyl-5-hydroxyindole (2),
3-ethyl-5-hydroxyindole (3), and
serotonin (4)의 homologue rows를 보여준다.
⇒ 또한, 추가적으로
octadecanonitrile (5),
octadecanoic acid (6), and
octadecanoamide (7)도 검출되었다.
⇒ 머찬가지로, 그에 상응하는 분해 산물들이 of C20:1-5HT의 열분해에 의해 분석되었다.

로스팅 실험 결과와 관련하여, C-5HT의 가장 가능성 있는 분해 경로가 Figure 20.46에 제시되어 있다.
C-5HT는
⇒ 먼저 α-cleavage를 통해
⇒ serotonin(세로토닌), 5-hydroxyindole, 3-methyl-5-hydroxyindole, 3-ethyl-5-hydroxyindole,
그리고 이에 상응하는 지방산, fatty acid nitrile, fatty acid amide로 분해된다.
⇒ 열 부하가 증가하면
인돌 프레임(indol frame)이 열분해되어
⇒ 알칸(alkanes)과 알켄(alkenes)이 형성된다.
그러나 Viani and Hormann [139]이 추정했던 것처럼
⇒ 인덴(indene)이나 인돌 프레임(indole-frame)을 갖는 화합물은 검출되지 않았다.

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20.4.1 Free Diterpenes

20.4.2 Diterpene Fatty Acid Esters

20.4.3 Synthesis of Diterpene Esters

20.4.4 Other Diterpene Compounds

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