스테노필라 커피 (Coffea stenophylla)의 재발견

 

2018년 그리니치 대학교 농생태학 교수인 Jeremy Haggar 박사와 런던의 큐 왕립식물원 커피연구 책임자이자 작물 및 지구 변화 부문의 선임 연구책임자 Aaron Davis 박사는 시에라리온 커피 재배 및 개발전문가 Daniel  Sarmu와 협력하여 야생에서 이 종을 찾아내려고 했다. 그들은 RBG Kew의 역사적 표본을 사용하여 스테노필라 커피의 마지막으로 알려진 지역에 대한 세부 정보를 제공했다. NGO Welthungerhilfe와 시에라리온 임업부의 지원을 받아 그들은 주요 목표 위치를 방문했고, 그곳에서 스테노필라 커피 한 그루만 발견했다. 동쪽으로 이동하여 다른 삼림 지역을 방문했고, 울창한 삼림을 몇 시간 동안 트레킹한 후 마침내 건강한 개체군을 찾았다.

 

Aaron P. Davis and Daniel Sarmu, Image Courtesy Jeremy Haggar

 

 요약

• Coffea arabica (아라비카)와 C. canephora (로부스타)는 거의 전적으로 세계 커피 생산을 지배한다.
• 질병과 해충의 유병률과 심각성 증가, 기후변화를 포함한 생산(농장) 수준의 다양한 과제는 회복력(resilience)과 지속 가능성을 보장하기 위해 커피 작물 포트폴리오를 상당히 다양화해야 함을 시사한다.
• 본 연구에서 우리는 다학제적 접근방식(식물 표본 및 문헌 검토, 현장 작업 및 DNA 시퀀싱)을 사용하여 잘 알려지지 않은 두 가지 커피 작물 종인 C. affinis와 C. stenophylla의 정체성, 소재 및 잠재적 속성을 설명한다.
  
  
• 우리는 100년 이상 전에 아프리카 서부와 더 먼 곳에서 커피 작물 종으로 널리(비록 소규모이기는 하지만) 사용되었음에도 불구하고, 이 종은 현재 야생에서 극히 드물고 재배되지 않는다는 것을 보여준다.
• 현장 조사를 통해 우리는 1954년 이후로 야생에서 기록되지 않았던 C. stenophylla를 시에라리온에서 재발견할 수 있었다.
• 우리는 C. stenophylla가 Guinea, Sierra Leone, Ivory Coast의 토착종임을 확인한다.
• Coffea affinis는 이전에 기니와 Ivory Coast에서만 발견된 적이 있었지만 시에라리온에서는 처음으로 야생에서 발견되었다.
• 우리가 재발견하기 전에 C. affinis는 1941년에 마지막으로 야생에서 발견되었지만, 신원이 확인되지 않은 식물 표본을 샘플링한 결과 2015년 Guinea-Conakry에서 수집된 것으로 나타났다.
• 플라스티드와 ITS 마커를 사용한 DNA 시퀀싱이 다음을 위해 사용되었다.
  (1) 박물관 및 현장에서 수집한 C. stenophylla 샘플의 정체성 확인.
  (2) 새로운 C. affinis 수집 식별.
  (3) C. affinis의 잡종 지위를 반박.
  (4) C. affinis와 혼동되는 액세션들을 식별.
  (5) C. affinis와 C. stenophylla가 밀접한 관련이 있으며 단일 종이 될 가능성이 있음을 제시.
  (6) 하이브리드 C. stenophylla × C. liberica를 입증.
  (7) Coffea에서 F1 및 초기 세대 종간 잡종을 식별하는 간단한 수단으로
       플라스티드 및 핵 마커를 사용하는 것을 보여줌.
  (8) C. liberica가 단계통이 아니라고 추론.
  (9) 모든 주요 아프리카 Coffea 종(커피 작물 야생 친척 우선 그룹 I 및 II)에서
      잡종화가 가능하다는 것을 보여줌.
• Coffea affinis와 C. stenophylla는 맛 차별화, 질병 저항성 및 기후 회복력을 포함하여 커피 작물 식물 개발에 유용한 특성을 가질 수 있다.
• 이 종은 최소한의 작물화만으로도 틈새 시장에서 성장할 가능성이 있지만,
  이러한 속성은 번식 프로그램을 통해 얻는 것이 가장 좋다.

 

 

 

 INTRODUCTION

 

• 커피는 농부에서 소비자까지 긴 가치 사슬을 거치는 수십억 달러 규모의 글로벌 산업을 지원하는 전 세계적으로 중요한 작물이다 (International Coffee Organization (ICO), 2019). 커피 농사만 해도 전 세계적으로 약 1억 명의 사람들이 영농 활동을 한다 (Vega et al., 2003). 두 종이 글로벌 커피 생산을 주도한다 : 아라비카(Coffea arabica)와 로부스타(C. canephora)로 각각 거래되는 커피의 약 60%와 약 40%를 차지한다 (International Coffee Organization (ICO), 2019). 
• 리베리카 커피는 전 세계적으로 소량으로 재배되며 글로벌 무역 측면에서는 중요하지 않지만 필리핀과 말레이시아의 생산량은 상당할 수 있다.
• C. arabica, C. canephora, C. liberica 외에도 과학에 알려진 커피 종이 121종이 있다
  (Davis et al., 2006, 2011, 2019).
• 이 중 일부는 C. congensis, C. eugenioides, C. racemosa와 같이 음료용 커피를 만드는데 사용되고, 일부는 육종 프로그램에 사용되었으며, 다른 일부는 고성능 해충 및 질병 저항성 대목으로 사용되었다 (Davis et al., 2019).
• 훨씬 더 많은 것이 소규모로 지역적으로 사용되거나 아프리카, 마다가스카르, 아시아에서 야생에서 직접 수확된다. 
  이전 세기, 특히 1800년대 말과 1900년대 초에는 오늘날보다 더 많은 음료용 커피 종에 대한 관심과 사용이 상당히 있었다 (Davis et al., 2019).
• 그 이후로 세계 커피 종 다양성의 상당 부분이 과학에 의해 발견되고 명명되었으며, 특히 1960년대 이후로는
  더욱 그렇다  (Bridson, 1988; Davis et al., 2006; Davis and Rakotonasolo, 2009).
  
• 이러한 ‘다른’ 커피 종에 대한 관심의 감소는 주로 로부스타 커피의 압도적인 성공에 기인한다. 
• 로부스타 커피는 야생 식물이자 아프리카의 소규모 작물 종에서 약 150년 만에 주요 글로벌 상품으로 전환되었다
  (Davis et al., 2019).
• 로부스타는
  커피 잎 녹병(CLR; Hemileia vastatrix)(Wrigley, 1988)에 대한 저항성,
  더 광범위한 농생태적 범위(Davis et al., 2006),
  더 높은 생산성 (Wellman, 1961; Wrigley, 1988),
  더 낮은 구매 가격 (International Coffee Organization(ICO), 2019) 및
  기타 특정 속성 (Davis et al., 2019)으로 인해
  1900년대 초반부터 아라비카에 대해 시장 점유율을 확대했다.
  
  
• 그러나 최근에는 재배 및 야생 커피 종 모두에서 활용도가 낮고 잊혀졌으며 잘 알려지지 않은 커피 종에 대한 관심이 다시 높아지고 있다. 이는 특정 해충과 질병에 대처하고 가속화된 기후변화 시대에 회복력을 제공할 수 있는 잠재력 때문이다 (Davis et al., 2019). 또한 커피에서 새롭고 차별화된 감각적 경험을 발견하려는 노력에서 스페셜티 커피 부문의 덜 알려진 커피 종에 대한 호기심이 증가하고 있다.
  
• 특히 관심을 끄는 종으로는 서아프리카의 두 종인 C. stenophylla와 C. affinis가 있는데, 
  주로 C. stenophylla (Cheney, 1925)와 C. affinis(De Wildeman, 1904)의 뛰어난 맛에 대한 역사적 보고 때문이다.
• 이 두 종은 비교적 낮은 고도의 Upper West Africa에서 발견된다는 점을 감안하면 (아래 참조), 기후 회복(climate resilience)의 잠재력도 있을 수 있다.
• 두 종 모두 Coffee Crop Wild Relative Priority Group Ⅱ에 속하는데, 여기에는 주요 작물 종과 밀접한 관련이 있는 종이 포함되며, 작물로의 유전자 전이가 입증되거나 추정된다 (교배 후 생식율이 low~high)(Davis et al., 2019).
• Priority Group Ⅱ에는
  주요 커피 작물 종과 그 조상 (C. arabica, C. canephora, C. liberica, C. eugenioides: Priority Group Ⅰ)과 Priority Group Ⅲ의 아프리카 종을 제외한 모든 아프리카 종이 포함된다. 
• Priority Group Ⅲ에는
  아프리카, 아시아, 오세아니아의 모든 짧은 암술대의(short-styled) 코페아 종(이전에는 Psilanthus 속으로 분류됨)과 모든 Madagascan species 및 Mascarene species가 포함된다 (Davis et al., 2019).
  
• C. stenophylla와 C. affinis에 대한 최근의 지식은 주로 생식질 조사(germplasm surveys)에 국한되어 있다.
• Coffea stenophylla는
  여러 (ex situ) 커피 연구 컬렉션에서 살아있는 식물로 기록되어 있다 (Anthony et al., 2007; Engelmann et al., 2007; Bramelet al., 2017);
• C. affinis는
  이러한 리뷰 중 가장 최근의 것(Bramel et al., 2017)에 포함되어 있지만, 수용된 커피 종에 대한 지식을 기반으로 한 항목으로만 포함되어 있다 (Govaerts et al., 2019).
• 커피 종 다양성에 대한 현대적 평가(Davis et al., 2006, 2011, 2019; Maurin et al., 2007; Hamon et al., 2017)는 C. stenophylla와 C. affinis에 대한 우리의 지식이 부족하다는 것을 분명히 보여준다.
• C. affinis에 대한 문헌의 초기 검토에서는, 1980년대에 Ivory Coast (Côte d'Ivoire)와 Guinea에서 수행한 작업을 제외하고는 (Berthaud, 1983, 1986; Le Pierrès et al., 1989), 1937년 이후로 이 종에 대한 추가 지식이 거의 얻어지지 않았다는 것을 보여주었다 (Portères, 1937a). 
• 재배(상업적 생산 포함)와 야생에서 이 두 종에 대한 지식을 향상시키는 것이 긴요하다.
  
  
• 본 연구에서 우리의 주요 목표는 다음과 같다: 
  📌 C. stenophylla와 C. affinis의 현재 재배 및 야생 상태의 설명;
  📌 잘 알려지지 않은 C. affinis의 분류학적 정체성 및 체계상 위치의 설명;
  📌 작물 식물 속성에 대한 사용가능한 정보의 수집.
  
  
• 이러한 목표를 달성하기 위해 우리는 다음을 수행했다: 
  (1)  literature review;
  (2) 식물 표본관 및 경제 식물학 컬렉션 조사;
  (3) 시에라리온에서의 필드 서베이, 방문 농장, 연구소 및 자연림 현지에서의 필드 서베이;
  (4) 최근 수집된 재료, 역사적 샘플 (식물 표본관 및 경제 식물학 컬렉션 샘플), 
       알려진 종간 잡종들의 DNA 시퀀싱, 그리고
       이전에 발표된 Coffea 시퀀스의 레퍼런스 세트를 통합시키는 이들에 대한 분석.

 

 MATERIALS AND METHODS

 

Literature Review

 

• 우리는 C. affinis와 C. stenophylla에 관한 모든 주요 문헌을 검토했다. 
• 리서치 컬렉션에서 ex situ 재배에 대한 지식은 출판된 연구들 (Anthony, 1982, 1992; Anthony et al., 2007; Engelmann et al., 2007; Bramel et al., 2017; Davis et al., 2019)에서 얻었고, 개인적 관찰(A. Davis, J. Haggar)과 개인적 의사소통으로 뒷받침되었다.

 

 

Review of Herbarium Collections and
Economic Botany Collections

 

• Herbarium specimens (식물표본집 표본)은 공간(위치), 시간(날짜) 및 형태(종 정체성)에서 검증할 수 있고 종종 식물 표본관 라벨에 추가 정보(예: 생태, 고도, 지질 및 용도)가 함께 제공되기 때문에 이러한 유형의 연구에 적합하다.
• 우리는 시에라리온(SL, FBC)을 포함한
  9개 식물 표본관(BM, BR, K, MO, P, UPS, WAG)의 식물 표본집 표본 기록을 참조했다.
• 식물 표본관 코드는 표준 약어를 따른다 (Holmgren et al., 1990; Thiers, 2019).
• 표본 데이터는 고유 기록과 중복 표본으로 구분되었다.
• 고유 기록(Unique records)은 컬렉터의 이름과 번호 (예: Chillou 2381) 또는 컬렉터의 이름과 날짜(예: Cope s.n., 7 iii 1912)의 조합으로 구성된다; s.n.는 sine numero의 약어이며, 소문자 로마 숫자는 월을 나타낸다.).
• 중복 표본(Duplicate specimens)은 동일한 고유 식별자를 가지고 있다. 즉, 동일한 식물 또는 아마도 인근 개체에서 나온 것이지만 별도의 식물 표본집 시트에서 발견된다. 이는 동일한 식물 표본집에서 발견되거나 두 개 이상의 식물 표본집에서 발견될 수 있다.

 

 

Fieldwork in Sierra Leone

 

• 2014년과 2016년에 우리는 시에라리온(Sierra Leone)의 주요 커피 생산지역인 케네마(Kenema), 카일라훈(Kailahun), 코노(Kono) 지구(Districts)에 있는 10,000명의 커피 농부를 대표하는 NGO와 농부 협회에 C. affinis와 C. stenophylla 샘플과 비정형 커피 형태형(morphotypes)을 요청했다. 
• 또한 우리는 카일라훈 지구(Kailahun District) 펜뎀부(Pendembu)에 있는 the Sierra Leone Agricultural Research Institute (SLARI) 연구 컬렉션(Table 1)을 방문하여, C. stenophylla와 C. affinis의 추정 샘플을 샘플링했다.
• 또한 두 가지 재배 커피 종인 로부스타 커피(C. canephora) 및 리베리카(C. liberica)와 C. stenophylla 사이의 가장 명백한 형태적 차이(잎 모양과 크기)를 보여주는 A4 포스터 50장을 인쇄하여 프리타운과 케네마 사이의 남부 시에라리온에 있는 커피 농가 커뮤니티가 있는 지구 농업 사무소에 배포했다.
• 목표는 C. stenophylla 또는 C. affinis를 재배하고 있을 수도 있는 농장을 식별하는 추가 수단을 제공하는 것이었다.
• 2017년에 시에라리온 북부에서 C. stenophylla가 재배된 것으로 기록된 현장을 방문했다 (herbarium survey 기준).
• 2018년 12월에 포스터 조사를 후속 조치로 C. stenophylla 재배를 명시한 5개 농장을 방문했다.
• 같은 여행에서 Kasewe Hills (Southern Province)에서 C. stenophylla의 마지막 알려진(1954년) 포레스트 현장과 여러 가능한 위치를 방문했다: Freetown 주변 (서부 지역), Moyamba Junction 근처(Southern Province), Kenema (Eastern Province)에 인접한 Kambui Hills의 포레스트 지역이다.
• Kambui Hills에 대한 추급 방문은 2019년과 2020년 초에 이루어졌다.

 

 

 

Assembly of DNA Reference Collection

 

• 야생 커피 종에 대한 가장 분류학적으로 포괄적인 DNA 데이터 세트는 
  색소체 (plastid) (trnL–F intron, trnL–F intergenic spacer (IGS), rpl16 intron 그리고 accD–psaI IGS)와 nuclear rDNA의 internal transcribed spacer (ITS) 영역(ITS 1/5.8S/ITS 2)이다 (Maurin et al., 2007; Davis et al., 2011).
• 이러한 마커는 아프리카 커피 종을 구별하고 플라스티드와 핵 게놈의 차등 유전을 통해 최근에 형성된 잡종을 식별하는 능력이 있다 (Maurin et al., 2007).
• 31개의 액세션 (Table 1, 2)이 4개의 마커로 시퀀싱되었다 :  
  14개는 시에라리온에서 수집했다;
  C. stenophylla 3개, C. affinis 4개(농장에서 수집한 2개 포함), 기타 4개 커피 종을 포함하여 RBG Kew(K) 박물관 컬렉션의 9개 레퍼런스 샘플들;
  인위적인 하이브리드 C. arabica × C. racemosa (Medina Filho et al., 1977a,b) 생산과 관련된 5개 샘플; 그리고
  C. zanguebariae의 미공개 시퀀스 1개 (Table 2).
  
  
• C. stenophylla와 C. affinis의 5개 박물관 컬렉션은 시에라리온에서 각각 19세기 말과 20세기 초에 재배된 진짜 자료를 나타내기 위해 선택되었다.
• 게시된 레퍼런스 시퀀스 데이터 세트 (Maurin et al., 2007; Davis et al., 2011)에는 C. stenophylla의 검증된 사례가 하나 포함되었다.
• 이전 연구에서 동일한 마커를 사용하여 식별한 두 가지 알려진 종간 잡종(Maurin et al., 2007)이
  샘플링에 포함되었다 :
  C. arabica (C. canephora × C. eugenioides)와
  C. liberica × C. eugenioides [원래는 C. heterocalyx로 등록됨(Maurin et al., 2007)].
• 초기 분석은 연구 종(위 참조)과 아프리카, 마다가스카르, 마스카렌, 아시아 커피 종의 글로벌 데이터 집합 (Maurin et al., 2007; Davis et al., 2011)을 사용하여 수행되었다.
• 이 분석에 따라 일반적인 액세션 배치를 확인한 후,
  짧은 암술대의(short-styled) Coffea 종(이전 Psilanthus)을 제외한 아프리카 분류군으로 축소하여 Coffee Crop Wild Relative (Priority) Groups Ⅰand Ⅱ와 동일시했다 (Davis et al., 2019).

 

 

 

DNA Extraction, Sequencing, and Data Analysis

 

• 총 DNA는 실리카 건조 잎, 생 종자, 식물 표본 및 기타 보관 자료의 종자 (Table 1, 2)에서, 
  수정된 CTAB 방법(Doyle 및 Doyle, 1987)을 사용하여 추출하고 
  QIAquick PCR purification kit (QIAGEN)를 사용하여 정제했다.
• 액세션 간의 유전적 변이는 4 영역을 채택하여 평가하였다:
  nuclear internal transcribed spacers (ITS1 및 ITS2),
  plastid trnL–trnF (trnL intron 및 trnL–trnF intergenic spacer),
  rpl16 intron 및
  accD–psaI intergenic spacer.
• 증폭은 Maurin et al.(2007)의 프로토콜에 따라 수행했다;
  PCR 산물은 QIAquick PCR purification kit (QIAGEN)를 사용하여 정제하고,
  Maurin et al.(2007)에서 사용한 방법에 따라 시퀀싱했다.
• 모세관 전기영동(Capillary electrophoresis)은
  ABI3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems)에서 수행되었다.
• 시퀀싱 결과는
  GENEIOUS v. 8.1.7(Kearse et al., 2012)에서 검사했다.
• 새로 시퀀싱된 액세션들 및 RBG Kew에서 보관 중인 미공개 시퀀스들은 Coffea 종의 GenBank 액세션들과 대조되었다 (Maurin et al., 2007; Davis et al., 2011).
• 그 시퀀스들은 GENEIOUS에 구현된 MUSCLE(Edgar, 2004)을 사용하여 정렬했다. 
• 갭은 missing 데이터로 처리되었고, 모호성은 IUPAC ambiguity codes로 점수가 매겨졌다.
• 특성 진화 모델은 jModelTest v. 2.1.10 (Posada, 2008)에서 평가되었다.
• 분류군 간의 관계는
  CIPRES Scientific Gateway v3.3에 구현된 MrBayes v. 3.2.7a (Huelsenbeck 및 Ronquist, 2001; Ronquist 및 Huelsenbeck, 2003)에서 재구성되었다; C. rhamnifolia가 outgroup으로 사용되었다.
• 분석은 ITS와 plastid DNA 데이터 세트에 대해 별도로 수행되었으며 정렬하기 어려운 영역은 계통발생학적 분석에서 제외되었다.
  
  
• 또한 우리는 C. canephora와 C. liberica를 outgroups로 하여
  Upper Guinea (UG) clade (C. togoensis, C. affinis, C. stenophylla 포함)의
  concatenated ITS/plastid matrix에 대한 별도 분석을 수행했다.
• MCMC 샘플링은 2 × 10⁷ 세대에 대해 2회 실행과 4개 체인으로 수행되었으며,
  샘플링 빈도는 1,000이고 상대적 번인(relative burn-in)은 25%였다; 지정된 특성 진화 모델은 GTRCG였다.
• 수렴(Convergence)은 Tracer v. 1.6(Rambaut et al., 2013)을 사용하여
  mixing과 높은 effective sampling size (EES)를 확인하기 위해 추적 파일을 결합하여 시각적으로 평가했다.
• Maximum clade credibility trees는 FigTree v. 1.4.4(Rambaut, 2018)에서 그렸다.
• 분기군(Clade) 및 종 연합(species alliance) 용어는 Maurin et al.(2007)과 Davis et al. (2011)의 연구를 따른다.

 

 RESULTS

 

 

Literature Review : Coffea stenophylla

 

Coffea stenophylla
(Highland Coffee of Sierra Leone, Rio-Nunez Coffee, Senegal Coffee, Sierra Leone Coffee)
(Figures 1, 2A)

 

• C. stenophylla와 그 상업적 잠재력에 대한 지식은 시에라리온에서 근무하고 식물을 수집한 Adam Afzelius (1750–1837)의 보고에 근거하여 적어도 1794년으로 거슬러 올라간다 (Hiern, 1876).
• Coffea stenophylla는 1834년에 과학에 새로운 것으로 기술되었고 (Don, 1834), 좁은 잎(따라서 종 별명)과 검은색 과일(대부분 커피 종은 붉은 과일을 가짐)을 기준으로 특징지어졌다.
• Don(1834)은 이것이 ‘그것이 경작되는 곳인, Native of Sierra Leone’이라고 말했다: : :
  그리고 ‘이 종의 씨앗은 볶아서 일반 커피로 사용되며, 심지어 그것보다 더 우수한 것으로 여겨진다’고 말했다.
• De Wildeman (1904)은 C. stenophylla가 Guinea (Southern Rivers 지역과 접한 숲)와 Ivory Coast의 토종이라고 보고했다.
• 적어도 1850년대부터 C. stenophylla의 씨앗은 시에라리온에서 전파되었고, ‘Highland coffee of Sierra Leone’ 또는 ‘시에라리온 커피’라는 토착 명이 수반되었다 (Hooker, 1896). 
• 상업적(재배) 샘플은 1856년에 영국 큐 왕립 식물원에 도착했다 (표본은 Economic Botany Collection, Kew에 있음).
• Chevalier (1929)에 따르면, C. stenophylla는 1890년대(1893년경)에 시에라리온에서 대량으로 재배되었고, Guinea에서는 상업적 제품으로 프랑스에 수출되었다. 
• 프랑스에서는 예외적으로 유리한 시장 가격을 받았다 (Scott Elliot, 1893).
• C. stenophylla의 살아있는 물질(씨앗)이 1894년 5월 큐 왕립식물원으로 보내졌고, 여기서 인도, 스리랑카(당시에는 실론이라고 불렸음), 트리니다드(Fig. 1), 자바로 보내졌다 (Cheney, 1925; Scott Elliot, 1893).

 

 

Kew 영국왕립식물원의 1896년 11월호 소식지 pp.189-192 시에라리온 하이랜드 커피 정보

Kew 영국왕립식물원의 1896년 11월호 소식지 pp.189-192 시에라리온 하이랜드 커피 정보

 

 

• Guinea에서 베트남(Chevalier, 1929)으로 보내졌고, 아마도 당시 프랑스 식민지였던 다른 나라들로도 보내졌을 것이다.
• 1904년, De Wildeman (1904)은 기니에서 C. stenophylla의 재배에 대한 요약을 제공했는데, 기니에서 Nunez 강(기니의 주요 강)의 이름을 따서 Rio-Nunez 커피라는 이름으로 어느 정도 재배되었던 것으로 보인다.
• Ghana, Senegal (Senegal coffee로 알려짐), Ivory Coast에서도 재배되었는데, 아마도 포르투갈의 초기 개입 (Haarer, 1962)을 통해, 우간다 (Tothill, 1940)에서 재배되었을 것이다.
• Chevalier (1929)는 시에라리온과 기니에서 C. stenophylla의 수출이 연간 약 3~5톤(3,000~5,000kg)에 달했다고 한다. 하지만 여기에는 이 생산국에서 소비된 커피의 양은 포함되지 않으며, 상당했을 수 있다.
• Coffea stenophylla는 적어도 1920년대까지 시에라리온 농업의 두드러진 특징이었던 것으로 보이지만 (Dudgeon, 1922), 그 이후로는 쇠퇴했을 수 있으며 (Chevalier, 1929), 그것은 아마도 커피 가격 하락 때문일 것이다 (Dudgeon, 1922).
• 다른 곳에서는, 뛰어난 풍미에 대한 모든 보고 (Don, 1834; Scott Elliot, 1893; De Wildeman, 1904, 1906b; Watt, 1908; Macmillan, 1914; Dudgeon, 1922; Cheney, 1925; Chevalier, 1929; Wellman, 1961; Haarer, 1962)와 다양한 잠재적 농업적 속성(아래 참조)에도 불구하고, 커피 작물 종으로서 널리 퍼지지 못했다. 
• Chevalier (1929)는 많은 사람들이 절묘한(exquisite) 커피로 여겼지만 (“Suivant beaucoup de dégustateurs, c’est un cafe exquis - 많은 테이스터들의 평가에 따르면 아주 맛있는 커피입니다”) 저소출 때문에 전 세계적으로 재배가 널리 퍼지지 않았다고 보고했다.
  
  
• 마찬가지로, 1919년과 1931년에 우간다에 도입되었음에도 불구하고, 작은 콩 크기와 낮은 수확량으로 인해 지속 가능한 커피 작물이 될 수 없었다 (Tothill, 1940).
• 이러한 사실에도 불구하고, C. stenophylla의 경우
  낮은 고도(예: 약 150m)에서 좋은 농업적 성과가 보고되었고 (Watt, 1908; Cheney, 1925; Bramel et al., 2017),
  CLR에 대한 잠재적 내성에 대한 보고가 있다 (Cheney, 1925).
• 이 두 종의 자연적, 그리고 한때 재배되었던 환경이 Upper West Africa에서 비교적 낮은 고도(150~610m)에 있었다는 점 (Watt, 1908)과 C. stenophylla가 건조한 환경을 견뎌내는 것으로 보고되었다는 점 (Wellman, 1961; Wrigley, 1988)을 감안할 때, 주요 작물 종과 비교했을 때 고온과 저강우에 대한 회복력이 있을 수도 있다.
  
  
• 1940년대 이래로 C. stenophylla에 대한 대부분의 문헌은 이전 출판물의 정보를 재활용하는 데 국한되었다 (Wellman, 1961; Haarer, 1962; Wrigley, 1988; Stoffelen, 1998; Davis et al., 2006).
• 이에 대한 예외는 1980년대에 수행된 Upper West Africa의 전담 커피 수집 임무에 대한 보고서이다.
  1984년과 1987년 사이에 Ivory Coast에 대한 다양한 임무에 대한 보고에서 Le Pierrès et al.(1989)은 Ivory Coast의 Sud-Est 지역(Abidjan 북동쪽)의 주요 산림 블록에서 C. stenophylla의 두 야생 개체군을 기록하고; Guinea에서는 지역의 주택 정원 (Boffa와 Boke 사이, 그리고 Boke 주변)에서 이 종을 소규모로 재배한 사례 114개를 기록했다. 
• Berthaud (1986)는 Ivory Coast에서, Ira Forest (Forêt L’Ira), 그리고 그 나라 동부의 다른 세 지역(개체군)에서 C. stenophylla 개체군이 존재한다는 것을 입증했다.
• 또한, Berthaud (1983)는 Ivory Coast 서부의 Ouellé 지역의 건조림에서 이 종을 기록했다. 
• Berthaud (1986)는 Ira Forest (Forêt L’Ira)에서 C. stenophylla, C. liberica, C. canephora를 보고했다;
  C. stenophylla는 그 언덕의 위쪽, 건조한 부분에만 국한되었고, 다른 두 종은 계곡 바닥(아래쪽, 더 습한 지역)에서 발견되었다.

 

 

Literature Review : Coffea affinis (Kamaya Coffee)

 

• 이 종은 1900년경에 Guinea에서 M. Boery의 커피 연구 정원에서 처음 보고되었으며, 원래는 인근 자생림에서 수집되었다 (De Wildeman, 1904).
• 처음 검사했을 때, De Wildeman은 이 식물이 C. stenophylla와 많은 특성이 비슷하다고 생각했다 (즉, 일반적인 붉은색이 아닌 검은색 과일이 있음) 하지만 다른 면에서는 달랐고 특히 잎 크기와 모양이 달랐다 (De Wildeman, 1904).
• De Wildeman이 Rio-Nunez 커피로 집단적으로 재배되고 있는 이 식물을 관찰하기 위해 Guinea를 방문했을 때 (De Wildeman, 1904), 그는 C. stenophylla와 과학에 새로운 종이라고 명명한 또 다른 종이 있다고 선언했다: C. affinis. 
  De Wildeman (1904)에 따르면 C. affinis는 과일의 색상과 모양, 씨앗의 모양에서 C. stenophylla와 유사했지만, 생장적 특성(예: 줄기, 잎, 턱잎)과 주로 더 큰 잎에서 차이가 있었다.
• De Wildeman (1904)은 C. affinis가 활력, 커피의 품질(높은 가치), 일반적인 질병 저항성(아라비카 커피와 비교)으로 인해 새로운 커피 작물 종으로서 상당히 중요하다고 믿었다. 
• C. affinis의 동시대 사진(De Wildeman, 1906b)은 좁은 잎을 가진 C. stenophylla와 다른 더 크고 넓은 잎을 가진 커피 나무를 보여준다.
  
• De Wildeman (1904, 1906b)의 관점과는 달리, Chevalier(1905)는 C. affinis가 Guinea에서 야생으로 자란다는 사실을 전혀 알지 못했기 때문에 시에라리온이 원산지라고 제시했다.
• 그 후, Chevalier (1929)는 C. affinis를 C. liberica와 C. stenophylla의 잡종으로 간주했다.
• C. affinis의 잠재적인 잡종 지위는 Portères (1937a)에 의해 자세히 논의되었으며, 그는 특히 Ivory Coast에서 토착종으로 간주되는 새로운 커피 나무인 ‘Kamaya’로 지역적으로 알려진 것과 관련하여 잡종 기원에 반대했다.
• 그는 ‘Kamaya’와 C. affinis 사이에 밀접한 연관성을 도출했지만, C. affinis의 적용에 대한 불확실성으로 인해 이 식물을 C. stenophylla var. camaya로 명명하기로 결정했다.
• Portères (Portères, 1937a)는 C. stenophylla var. camaya가 Abengourou 근처의 커피 농장에서 단일 사례로 발견되었지만 (Figure 3), Niabli (6° 39’ N  3°16’ W) 근처의 야생에서 유래되었으며, Ivory Coast에 몇 개의 작은 농장이 설립되었다고 보고했다.
• 10년 후, Chevalier (1947)는 C. stenophylla var. camaya와 C. affinis가 같은 종이며, 그의 이전 보고와는 달리 Ivory Coast의 야생 상태에서만 발견되었다고 제시했다.
• Wellman(1961)은 C. affinis가 Guinea와 Ivory Coast의 토착종이라고 생각했으며, C. stenophylla의 고정 돌연변이라고 제시했다.
• 다른 연구자들(Cramer, 1957; Stoffelen, 1998)은 Chevalier(1905)의 이전 의견, 즉 C. affinis가 C. liberica와 C. stenophylla의 잡종이라는 의견을 언급했다 (Davis et al., 2006).

 

 

Herbarium Collection Survey

 

• C. affinis의 경우 식물 표본집 서베이에서 12개의 고유 기록 (7개의 재배 기록과 5개의 야생 기록)이 나왔고, 총 28개의 식물 표본 (중복 포함)이 나왔으며, C. stenophylla의 경우 50개의 고유 기록(29개의 재배 기록, 12개의 야생 기록, 데이터 없는 것 9개)과 72개의 식물 표본이 나왔다.
• 이러한 종과 관련된 식물 표본 기록에는 잡종 C. liberica × C. stenophylla가 포함되며, 이 중 2개의 고유 기록이 있었고, 둘 다 연구 컬렉션에서 발견된 재배 자료에서 나왔다.
• 다른 많은 커피 종과 비교했을 때 식물 표본의 수는 적고, 특히 C. affinis의 경우 그렇다.
• 우리는 C. stenophylla의 두 가지 상업적 종자 컬렉션을 조사했다. 
  하나는 파취먼트가 있는 것과 없는 것 (밀링-전 단계, 내과피가 부착됨)이고, 
  하나는 크린 (녹색, 볶기 전) 커피(내과피 제거)이고, 
  다른 하나는 Royal Botanic Gardens, Kew(K)의 Economic Botany Collection에서 가져온 과일 컬렉션(햇볕에 말린 통 열매)이다.
• 식물 표본을 조사한 결과 문헌 조사의 많은 측면이 확인되었다 (위 참조).
  
  
• 식물표본집 조사에 따르면, C. stenophylla는 기니, 시에라리온, 코트디부아르의 토착(야생) 종으로 확인되었으며 (Davis et al., 2006), 문헌에 따르면 이러한 국가에서도 영농 및 기타 방식으로(예: 연구소 및 농장) 재배되었다 (위 참조).
• 대부분의 식물표본집 표본은 1800년대 후반과 1900년대 초반의 것이다.
• 이러한 국가의 가장 최근 컬렉션은 다음과 같다:
  Guinea (야생, 1941년; (소규모) 농장 재배, 1961년);
  Sierra Leone (야생, 1954년; (소규모) 농장 재배, 1963년);
  Ivory Coast (야생, 1932년; 농장, 데이터 없음).
• 비교를 통해, 문헌 조사는 1980년대 중반에서 후반에 Guinea와 Ivory Coast에서 C. stenophylla의 소규모 재배를 보여준다 (Berthaud, 1983, 1986; Le Pierrès et al., 1989).
• 식물표본집 데이터도 이 종이 아프리카 (Ivory Coast, Guinea, Nigeria, Sao Tomé, Sierra Leone, Tanzania, Ghana, and the Democratic Republic of Congo)와 아시아(Vietnam, Java)의 커피 리서티 컬렉션과 다른 생식질 컬렉션에서 재배되었음을 보여준다.
  
  
• 식물표본집 조사는 C. affinis는 Guinea와 Ivory Coast의 토착(야생) 종이라는 것을 밝혀준다 (De Wildeman, 1904).
• Chevalier는 Guinea에서 야생 상태에 대한 증거를 찾을 수 없었으며, Conakry와 Cameyenne의 정원에서 재배한 재료만 언급했다 (Chevalier, 1905). 
• 하지만 식물표본집 자료는 Guinea의 자연림에서 수집한 것에 대한 명확한 증거를 제공한다 (아래 참조).
• Chevalier (1905)의 견해와 훨씬 최근의 의견(Davis et al., 2006)과는 대조적으로, 우리는 Sierra Leone에서 야생 C. affinis의 증거를 찾을 수 없었으며, 이는 문헌 조사의 경우에도 마찬가지이다 (하지만 아래의 시에라리온의 필드워크 참조).
• 커피 농장에서 수집한 식물표본집 표본이 있는데 [Cope s.n., 7 iii 1912 (K)], C. affinis로 표시되어 있다. 
  이 종은 주요 잎 특성을 가지고 있지만 꽃은 없고 과일 색상은 표시되지 않았다.
• Guinea에서 C. affinis의 토착 상태와 관련하여, Boké (보케 현 Boké Prefecture) 주변에서 수집한 두 개의 컬렉션이 파리 식물표본관 (P)에 있으며, C. affinis로 식별할 수 있으며, 레이블에는 그 식물이 자생(야생)했다고 명확하게 명시되어 있다: Chillou s.n. 20 xii 1923 (중복 3개); Chillou s.n., 17 xii 1923 (중복 2개); 같은 커렉터가 Friguiagbé  (킨디아 현 Kindia Prefecture)에서 수집한 세 번째 표본(Chillou 2381, 3 ii 1941)도 자연적으로 생긴 것일 가능성이 높지만 표본에 토착/재배 여부가 표시되어 있지 않다.
• 이들 국가의 가장 최근 컬렉션들은 다음과 같다:
  Guinea (야생, 1941; 농장, 1905);
  Sierra Leone (커피 농장, 1912);
  Ivory Coast (야생 1930; 농장 1934).

 

 

 

 

Fieldwork in Sierra Leone

 

• 2014년과 2016년 사이에 C. affinis와 C. stenophylla 및 비정형 커피 형태형에 대한 샘플 요청을 통하여, 2014년부터 2016년 사이에 20개의 샘플(잎 샘플, 이미지 및 DNA 샘플)을 수집했다 (“Materials and Methods” 섹션 참조).
  이 중 7개가 DNA 분석을 위해 선택되었다 (Table 1); 나머지 샘플은 C. robusta와 C. liberica의 일반 변종과 일치했다.
• SLARI 리서치 컬렉션으로부터 추정 C. stenophylla와 C. affinis 커피 샘플 3개를 수집했다 (Table 1).
• 10개 샘플은 C. stenophylla 또는 C. affinis의 잠재적 후보로 간주되었거나 이 종들 간의 하이브리드로 간주되었다.
• 북부 Sierra Leone에서 C. stenophylla가 재배되는 것으로 기록된 현장(2017년)을 방문했지만 커피가 발견되지 않았다.
• 2018년 12월에 우리는 농장 조사를 실시하여 C. stenophylla를 재배했다고 명시한 5개 농장을 방문했지만, 이 종이나 C. affinis의 식물은 발견되지 않았다 (C. canephora만 발견됨).
  
  
• Kasewe Hills (Southern Province)를 방문한 결과, 꽃이나 열매가 없는 불임 식물 한 개를 채집했는데, 우리는 이를 C. stenophylla로 예비적으로 확인했다.
• Western Peninsula National Park (Freetown 근처) 또는 Moyamba Junction 근처의 삼림 지대에서는 C. stenophylla와 일치하는 식물을 찾지 못했지만, Kambui Hills의 삼림 지대에서는 이 종과 일치하는 작은 개체군(높이가 7m에 달하는 성숙한 나무)을 발견했다.
• 두 지역 모두 식물은 해발 약 400m의 습한 상록수(저지대) 숲에서 채집했다 —
  Kasewe Hills의 경우 능선 꼭대기에서,
  Kambui Hills의 경우 가파른 경사지의 능선 옆에서 채집했다.
• 2019년과 2020년 초에 Kambui Hills를 더 방문한 결과, 꽃과 열매 모두에서
  C. stenophylla와 C. affinis로 잠정 식별된 나무가 추가로 발견되었다 (Figures 2B-D).
• 두 위치(Kasewe Hills와 Kambui Hills)의 DNA 샘플이 DNA 분석에 추가되었다 (아래 및 Table 1 참조).

 

 

 

 

 

 

DNA Analyses

 

• 이 연구를 위해 31개 액세션들로부터, 4개 DNA 영역의 총 120개 시퀀스를 생성하고 그 시퀀스를 GenBank에 보관했다 (NCBI 액세션 넘버 포함, Table 2 참조). 
• 2개의 선행 연구 (Maurin et al., 2007; Davis et al., 2011)로부터, GenBank에서 35개 종-수준 레퍼런스 시퀀스를 다운로드했다.
• ITS alignment의 길이는 804bp인 반면, concatenated plastid dataset (trnL–trnF, rpl16 및 accD–psaI)의 총 길이는 3253bp였다.
• Upper Guinea (UG) Clade의 멤버들과 2개의 outgroup 종을 포함하는, 종의 하위 집합에 대한 병합된 ITS/ plastid matrix의 길이는 3989bp였다.
• 일부 시퀀스는 시퀀싱 품질이 좋지 않아 누락되었다:
  C. stenophylla (2) SL cult.의 rpl16 그리고 C. stenophylla (6) SL; 그리고
  C. stenophylla (2) SL cult. 및 C. affinis (1) SL의 accD–psaI. 
• 액세션 정보는 Table 1, 2에 나와 있다.

 

 

ITS Analysis (Figure 4) 

• 얻은 결과는 종 관계와 지리적으로 구분된 클레이드들에 대한 배치 측면에서 
  이전에 얻은 ITS 분석(Maurin et al., 2007; Davis et al., 2011)과 일치한다.
• C. arabica와 C. racemosa 사이의 모든 4배체 하이브리드들(4n = 44)은
  C. racemosa (BS = 1)와 함께 East-Central Africa (EC-Afr) Clade에 배치된다.
• 2배체 하이브리드(2n = 22) C. liberica × C. eugenioides는 C. eugenioides와 함께 해결되지 않은 위치에 있는 East-Central Africa (EC-Afr) Clade의 종과 함께 배치된다 (BS = 1).
• 자연 사배체 하이브리드(4n = 44)인 C. arabica (두 액세션들)는 ‘Canephora Alliance’(BS = 1)에서 Lower Guinea/Congolian (LG/C) Clade의 종과 함께 배치되며, C. canephora(BS = 1) 두 액세션들과 자매이다. 
• 시에라리온에서 야생으로 수집한 C. stenophylla 표본 [specimens (5) SL & (6) SL], 이 종의 다른 야생 액세션들, 시에라리온의 C. affinis 야생 액세션들은 모두 C. humilis와 C. togoensis [specimens (1) SL & (2) SL]와 함께 Upper Guinea (UG) Clade에 속한다.
  
  
• 시에라리온에서 원래 C. arabica와 C. affinis(×2)로 분류된 3개의 재배 컬렉션은 Upper Guinea (UG) Clade (Figure 4에서 C. liberica × C. stenophylla SL cult. (1), (2), 및 (3)으로 표시)에 배치되었다.
• 시에라리온에서 재배된 C. affinis의 역사적 액세션들 (Table 1의 C. affinis)는 C. stenophylla 또는 C. affinis와 함께 배치되지 않았지만, LG/C Clade 내의 C. liberica 및 C. montekupensis (BS = 0.79)와 함께 배치되었다 [Figure 4에서 C. sp. (1) 및 C. sp. (2)로 표시됨].

 

 

 

Plastid Analysis (Figure 5)  

 

• 얻은 결과는 종 간의 관계와 지리적으로 구분된 클레이드에 대한 배치 측면에서 동일한 마커를 사용하여 이전에 얻은 plastid analysis와 일치한다 (Maurin et al., 2007; Davis et al., 2011).
• F1 사배체 하이브리드 (4n = 44) C. arabica × C. racemosa는
  C. arabica, C. eugenioides, C. kivuensis 및 C. anthonyi로 구성된 클레이드와
  자매인 East-Central Africa (EC-Afr) Clade에 배치된다.
• ITS 분석과 대조적으로, 역교배된 C. arabica × C. racemosa는
  야생 및 재배된 C. racemosa 액세션들과 함께 EA clade에 배치된다.
• Coffea liberica × C. eugenioides는
  두 종 C. liberica와 C. magnistipula (BS = 0.66)가 3개의 C. liberica 액세션들 (BS = 0.99)과 함께
  해결되지 않은 위치에 있는 Lower Guinea/Congolian (LG/C) Clades 중 하나에 배치된다.
• 사배체(4n = 44) 하이브리드 종 C. arabica는
  EC-Afr Clade의 종인 C. eugenioides, C. kivuensis, C. anthonyi(BS = 0.97)와 함께 배치된다.
  
  
• 원래 C. arabica와 C. affinis(×2)로 액세션된 시에라리온의 세 가지 재배 컬렉션들은,
  다양한 C. liberica 액세션들(BS = 0.97)이 있는 클레이드와
  C. liberica × C. eugenioides, C. liberica 및 C. magnistipula (BS = 0.66)의 하위 클레이드에서 해결되지 않은 위치에서, 두 개의 LG/C clades 중 하나에 배치되었다 [Figure 5에서 C. liberica × C. stenophylla SL cult. (1), (2), 및 (3)로 표시됨]. 
• C. stenophylla의 모든 야생 및 재배된 액세션들과, 그리고 C. affinis의 야생 액세션들은
  C. togoensis와 C. humilis를 포함하는 UG Clade (BS = 1)에 배속된다.
• C. stenophylla의 모든 야생 및 재배 액세션들과, C. affinis의 모든 야생 종만 포함하는 별도의 클레이드(단, C. humilis는 포함)는 미해결 클레이드 (BS = 0.76)에 속한다.
• 시에라리온의 경작된 C. affinis 역사적 액세션들은 (Table 1의 C. affinis) C. stenophylla 또는 C. affinis와 함께 배치되지 않고, C. montekupensis (BS = 1)의 자매인 C. liberica(BS = 0.98)와 함께 클레이드에 속하며, 두 개의 LG/C clades 중 하나에 속한다 [액세션들은 Figure 5에서 C. sp.(1) 및 C. sp.(2)로 표시됨].

 

 

 

Incongruence Between ITS and Plastid Trees   

• ITS와 plastid analyses 사이에는 상당한 불일치점이 몇 가지 있다 (Figures 4, 5). 
• 여기에는 알려진(manmade) 또는 입증된(DNA 연구를 통해) 하이브리드 기원의 분류군인
  C. arabica (C. arabica × C. eugenioides (Maurin et al., 2007),
  C. arabica × C. racemosa (Medina Filho et al., 977a,b), 그리고
  C. liberica × C. eugenioides(Maurin et al., 2007)가 포함된다.
• 이러한 불일치는 그들이 하이브리드라는 지식, DNA 및 기타 정보를 기반으로 예상된다.
• 본 연구에서 우리는 원래 C. arabica와 C. affinis(×2)로 분류된(Table 1) 세 개의 샘플을 식별했으며, 각 분석에서 상당히 불일치했다.
• 분석에서 이러한 액세션들의 특정 위치를 감안할 때 (ITS 및 plastid 결과 및 Figures 4, 5 참조)와 그 형태적 특징을 고려하면, 우리는 이들이 하이브리드 C. stenophylla × C. liberica를 나타낸다고 제시한다.
• 모든 알려지고 식별된 종간 잡종들은 계통수(Figures 4, 5)에 파란색 글자와 별표(*)로 표시되어 있다.

 

 

Combined Analysis for the Upper Guinea (UG) Clade (Figure 6)  

• Upper Guinea (UG) Clade의 모든 구성원인
  C. humilis, C. togoensis, C. affinis, C. stenophylla에 대한 ITS 및 plastid 데이터 세트를 결합하면 동일한 데이터를 사용한 이전 분석과 일치하는 관계가 생성된다 (Maurin et al., 2007; Davis et al., 2011).
• UG Clade의 네 종은 단일계통적(monophyletic)(BS = 1)이며,
  C. humilis는 C. togoensis, C. affinis, C. stenophylla(BS = 1)와 자매이다;
  C. affinis와C. stenophylla는 clade(BS = 0.88)을 형성하지만 각 종은 단일계통적이 아니다.
  
  
• Kambui Hills C. affinis 액세션 [(1) SL 및 (2) SL]과
  Kasewe Hills와 Kambui Hills의 C. stenophylla 액세션 [(5) SL 및 (6) SL]은 단계통성(BS = 0.92)이며,
  Ivory Coast의 두 가지 C. stenophylla 액세션 [(3) IC 및 (4) IC]과 자매이다 (BS = 0.76).
• Guinea의 C. affinis 액세션 [(3) Guinea]는 시에라리온의 알려지지 않은 곳에서 유래한 C. stenophylla 액세션 [(1) SL cult. and (7) Brazil cult]과 함께 속한다 (BS = 0.78).

 

 DISCUSSION

Historical and Present-Day Status of
C. affinis and C. stenophylla

 

• 2018년에 우리는 Sierra Leone의 두 곳에서 C. stenophylla를 재발견했다. 
  한 곳은 이전에 채집되었던 곳(1954년 Kasewe Hills)이고 
  다른 한 곳은 새로운 곳(Kambui Hills)이다 (Figure 3).
• 두 곳 모두에서 C. stenophylla는 매우 국한되어 있으며 위협받고 있는 것으로 보인다. 
• Moyamba 근처의 Kasewe Hills에서는, 삼림 벌채가 심한 지역에서 단 한 그루의 나무만 찾을 수 있었다.
• Kenema 근처의 Kambui Hills에서는 아직 그 규모가 알려지지 않은 소규모 개체군을 발견했지만, 벌목, 인간의 침입, 수공예 금광으로 인한 위협이 지속되고 있다.
• 2019년 후반에 우리는 C. stenophylla 개체군에서 멀지 않은 Kambui Hills에서 C. affinis를 발견했다.
  이것은 시에라리온의 야생에서 이 종을 기록한 첫 번째 사례이다. 
• Guinea와 Ivory Coast에서의 C. stenophylla와 C. affinis의 현재 상태는 잘 알려져 있지 않다.
• Guinea에서 C. stenophylla는 1980년대에 소규모로 제한적으로 재배된 것으로 기록되었지만 (Le Pierrès et al., 1989), 당시에는 야생 식물에 대한 기록이 없었다.
• 위성 이미지(Google Earth, 2019)를 사용하여 Guinea에 남아 있는 산림 피복에 대한 기본 조사를 통해 이전에 토착 식물로 기록된 많은 지역에서 C. affinis와 C. stenophylla를 발견할 가능성은 가능하지만 제한적이다 (섹션 “Results”; Figure 3 참조).
  
  
• Guinea의 더 먼 지역에서, 적절한 환경과 고도에서 필드 서베이를 실시하면 이러한 종의 야생 개체군이 발견될 수도 있을 것이다. 
• 실제로, 우리는 Guinea에서 채취한 불임(sterile) (꽃이나 과일 없음) 커피 표본의 최근 액세션 [2015; Couch 757(K)]에 대해 본고에서 보고한다. 
• DNA 시퀀싱과 형태학을 기반으로 C. affinis로 식별되었다 (아래 참조).
  
  
• 이러한 고무적인 발견에도 불구하고 Guinea의 삼림전용율(deforestation rates)은 매우 높고 지속적이다 (Couch et al., 2019); 1992년에는 원래 삼림의 96%가 이미 파괴되었다고 계산되었다 (Sayer et al., 1992).
• Ivory Coast에서는 C. stenophylla와 C. affinis의 더 광범위한 야생 개체군을 찾을 가능성이 더 높다. 
• 특히 위성 데이터(Google Earth, 2019)에 따르면, 이 種이 이전에 기록되었고 위치할 가능성이 높은 지역에 토착 잔여 식생이 존재하기 때문이다. 
• 그럼에도 불구하고 Ivory Coast에서 이 種이 서식하는 가장 잘 알려진 산림지 중 하나 (Berthaud, 1986), 즉 Ira Forest (Forêt L’Ira)은 2008년경에 대부분 파괴되었다.
  
  
• 요약하면, C. stenophylla와 C. affinis는 토착 서식지 전체, 특히 Guinea에서 위협을 받고 있다.
• IUCN Red List (멸종 위기 목록)에서 C. stenophylla는 Vulnerable (VU, 취약)으로 평가되고, C. affinis는 현재 Data Deficient (DD, 데이터 부족)이다 (International Union for Conservation of Nature (IUCN), 2020).
• 우리의 문헌 고찰, 식물표본관 조사, 현장 조사, DNA 분석에 근거하여,
  C. stenophylla와 C. affinis는 Guinea, Ivory Coast, Sierra Leone의 토착 종들이다 (Figure 3).

 

 

• 역사적 자료에 따르면 C. stenophylla와 C. affinis는 Upper West Africa에서 어느 정도 경작되었으며, 특히 Guinea와 Sierra Leone에서 C. stenophylla가 재배되었다.
• Coffea stenophylla는 아프리카 전역과 다양한 아시아 국가의 연구소에서도 널리 재배되었다; 리서치 스테이션들에서의 C. affinis 존재는 지난 세기 초반 Upper West Africa (Guinea, Ivory Coast)로 제한되었던 것으로 보인다.
• Sierra Leone에서 실시한 우리의 필드 서베이에 따르면, C. stenophylla와 C. affinis는 현재 상업적 경작 (즉, being farmed) 중이거나 다른 방식으로 재배되지 않는다.
• Sierra Leone에서 C. stenophylla 생산에 대한 마지막 확인된 기록은 1980년대에 버려지고 나서 벌채된 것으로 보이는 Njala University 부지의 작은 농장이었을 수 있다 (A. Lebbie 개인 통신).
  
  
• Guinea에서 C. stenophylla는 1980년대에 소규모로 제한적으로 경작된 것으로 기록되었다 (Le Pierrès et al., 1989).
• Coffea stenophylla는 최근에, Ivory Coast의 Centre National de Recherche Agronomique(CNRA)(Figure 2A), 프랑스의 L’Institut de recherche pour le développement(IRD)[A. Davis 개인 관찰], 우간다의 Entebbe Botanical Gardens [A. Davis 개인 관찰]를 포함한 여러 커피 리서치 컬렉션에서 기록되었다.
• 또한 다른 ex situ 컬렉션에서도 존재할 가능성이 있다.
• 그러나 ex situ 커피 생식질 네트워크 전체에서 중복 문제가 있다. 즉, 동일한 유전자형이 여러 사이트에 나타난다  (Anthony et al., 2007; Bramel et al., 2017; Davis et al., 2019).
• 또한 좁은 잎을 가진 C. arabica 'Angustifolia' 변종과 혼동되는 경우도 있는 듯하다.
  좁은 잎 때문에 때때로 C. stenophylla로 잘못 분류된다.
• Coffea affinis는 20세기 초 이후로 커피 리서치 컬렉션에 기록되지 않았다.
• C. stenophylla와 다른 모든 커피 종의 ex situ 컬렉션을 완전히 평가하려면 시퀀싱이나 유사한 방법을 통한 유전자형 분석이 필요하다.

 

Natural Habitat (Growing Environment)
of C. affinis and C. stenophylla

 

• 작물 야생 동류의 위치와 관련 서식지를 아는 것은 작물 식물로서의 환경적 적합성에 대한 초기 평가를 제공할 수 있으므로 중요하다.
• 문헌 조사에 따르면 C. stenophylla는 가뭄 내성(drought tolerance) 특성이 있을 수 있다 (Portères, 1937b; Wellman, 1961; Wrigley, 1988).
• 두 종 모두 비교적 낮은 고도(150~700m)에서 발생한다
  (De Wildeman, 1906a; Watt, 1908; Portères, 1937b).
• Ivory Coast (Ira Forest)에서
  C. stenophylla는 언덕의 위쪽, 건조한 부분에서 발생하고, 같은 위치에서
  C. canephora와 C. liberica는 계곡(즉, 아래쪽, 습한 지역)에서 발견되었다.
• Ivory Coast에서 이 종의 서식지들은 일반적으로 Sierra Leone 보다 건조하며(아래 참조), 연간 강수량은 1,500~1,700mm이고, 건기는 3~4개월이며(Portères, 1937b), 연평균 기온은 약 25.5℃이다.
• Guinea에서, De Wildeman (1906a)은 자연 상태에서 C. affinis가 폭포와 접한 갤러리 숲(강과 관련된 숲)과 습한(상록수) 숲에서 발견되며, 바다에서 100~300km 떨어진 거리에 고도 400~700m에서 자주 발견된다고 보고했다.
  
  
• Sierra Leone에서 우리의 필드워크는 200m까지 충분한 숲이 있었음에도 불구하고 두 곳(Kasewe와 Kambui Hills)에서 정확히 400m에서 C. stenophylla를 발견했다.
  
  
• 우리는 the Western Peninsula National Park 내의 더 높은 고도(최대 600m)를 방문했지만 두 종 중 어느 것도 찾지 못했다.
• Sierra Leone은 일반적으로 산악 국가가 아니며 대부분 땅이 500m 미만이다.
• Kasewe와 Kambui Hills의 기후는 열대몬순기후이며,
  연평균 강수량은 2,350~2,650mm, 연평균 기온은 약 26℃이며 3~4개월의 뚜렷한 건기(11월~3월/4월)가 있다.
• Ivory Coast와 Sierra Leone에서 C. affinis와 C. stenophylla의 야생 지역 사이에, 비록 신중한 검증이 필요하지만, 강수량에 상당한 차이가 있다는 점이 주지되어야 한다. 
  
  
• 우리의 식물표본집 조사는 이 두 종 중 어느 한 종의  서식지에 대한 많은 추가 정보를 제공하지 않았다.
• C. stenophylla에 대한 식물집 표본에 대한 참고 사항은 드물게 ‘언덕’이라고 명시하고, 한 표본은 ‘普通輝石(augite) 언덕의 더 열린 곳에서 매우 흔함’이라고 명시하고, 다른 표본은 ‘시에라리온의 산에서’라고 명시하여 높은 지형과 관련이 있음을 시사했다.

 

 

Species Status and Systematic Affinities
of C. affinis and C. stenophylla

 

• C. affinis의 최근 하이브리드 기원이, C. liberica와 C. stenophylla 간의 교배(Chevalier, 1929; Cramer, 1957; Stoffelen, 1998)의 결과라는 것은 세 가지 이유로 배제되었다 : 
• (1) C. affinis는 문헌 기록(Portères, 1937a), 식물관 표본(종자가 풍부함), 최근(2020) 현장 관찰(D. Sarmu 개인 관찰; 그림 2C)에서 입증된 바와 같이 분명히 결실을 낳을 수 있고(fertile) 생산적이다. 커피의 이배체 종간 하이브리드들은 일반적으로 불임이며, 꽃을 피울 수는 있지만 다배체화(보통 사배체)를 통해 다산성이 회복되지 않는 한 과일 맺기와 생존가능한 씨앗 생산은 최소화된다 (Carvalho and Monaco, 1968; Charrier, 1978).
• (2) C. affinis의 열매는 항상 검은색(black)으로 기술된다; 하이브리드 C. liberica × C. stenophylla(아래 참조)는 보라색 열매를 맺는다.
• (3) 우리의 C. affinis 샘플은 알려진 하이브리드 [C. arabica, C. arabica × C. racemosa, C. liberica × C. eugenioides, C. liberica × C. stenophylla(아래 참조)]에서처럼 ITS와 plastid markers 사이에서 번갈아 바뀌지 않고, 대신 C. stenophylla의 자매로 일관되게 확인된다. C. affinis가 C. stenophylla의 고정 돌연변이라는 생각(Wellman, 1961)도 이 분류군에서 명백한 변이 때문에 배제된다.
  
  
• 우리의 DNA 분석은 C. stenophylla와 C. affinis가 밀접한 관련이 있다고 추론한다. 
• 별도의 ITS (Figure 4)와 plastid analysis (Figure 5)은 4개의 Upper Guinea (UG) clade 종들(즉, C. humilis와 C. togoensis 포함)의 체계상 위치를 해결하지 못하지만, 이러한 데이터 세트의 결합적 분석은
  C. affinis와 C. stenophylla에 대한 단계통성을 되찾는다 (Figure 6).
• Coffea affinis와 C. stenophylla는 특정한 특성들을 공유한다:
  🌱 작은 나무의 습성,
  🌱 뚜렷한 정점 끝(acumen)과
  🌱 drying green을 가진 도란형 잎(obovate leaves),
  🌱 겨드랑이당 2~4개의 꽃,
  🌱 6~8장으로 갈라진 꽃 (즉, 꽃당 6~8개의 화관 엽(corolla lobes)과 꽃마다의 꽃밥(anthers); 그리고
  🌱 검은색 또는 검은색-보라색 열매 (Figure 2 참조).
• Ghana와 Togo의 Coffea togoensis도 작은 나무이며, 뚜렷한 정점 끝(acumen)이 있는 잎, 6~8갈래의 꽃과 검은색 과일을 가지고 있지만, 일반적으로 타원형 잎, drying grayish or gray-green, 겨드랑이당 1~2개의 꽃, 더 작은 과일과 씨앗을 가지고 있다. 
• Coffea humilis는 C. affinis, C. Stenophylla 및 C. togoensis와 달리 monocaul dwarf (single-stemmed woody plant, 최대 높이 1m), 큰 도란형 잎(최대 길이 22cm)과 5~7 갈래의 꽃, 붉은 열매가 특징이다.

 

• Coffea stenophylla와 C. affinis는 상당한 형태적 변이를 보이는데, 특히 잎 크기와 모양에 있어서 그렇다. 
• C. stenophylla의 일부 예는 잎 모양과 치수 면에서 C. affinis에 접근한다.
• 이 두 종 간의 정확한 관계를 파악하려면 형태적 연구와 보다 자세한 분자적 연구를 포함한 추가 작업이 필요하다. 
• C. affinis를 C. stenophylla에, 예를 들어 C. stenophylla var. camaya(Portères, 1937a)처럼,
  포함시킬 근거가 있을 수 있다.
  
  
• 시에라리온의 커피 농장에서 재배된 C. affinis의 역사적 액세션 (싱글 액세션 [Cope s.n., 7 iii 1912(K)]의 두 가지 유전형)은 C. affinis 또는 C. stenophylla와 관련이 없다.
• ITS 및 plastid marker 데이터는 이 액세션을 Lower Guinea/Congolian Clade에 위치시킨다.
• 이 액세션의 표본은 잎이 같은 치수이고 뾰족한 잎 끝이 있어 C. affinis와 형태적으로 상당히 일치하지만 씨앗은 C. affinis보다 다소 크고 좁다; 꽃 형태와 과일 색상은 알려져 있지 않다.
• Cope s.n. 액세션은 Liberica Alliance에 속하지만 이 연합의 알려진 종과는 일치하지 않기 때문에 주목할만하다. 
• 뚜렷하고 길쭉한 잎 끝(leaf tip, acumen)은 모든 C. liberica 변종들과 구별된다 (Stoffelen, 1998).
• ITS (Figure 4)와 plastid (Figure 5) 분석에서 C. liberica는 단계통(monophyletic)이 아니다.
• C. liberica 그리고 밀접한 관련 분류군에 대한 추가적인 분자 데이터가 필요하다.
• 현재 제한되어 있는 대로, C. liberica는 광범위한 형태적 변이를 포함하며 매우 다형적이다 (Bridson, 1985, 1988; Stoffelen, 1998; Davis et al., 2006).

 

Identification of Coffea Species Hybrids

 

• Biparental phylogenetic trees 양친 계통발생수 (e.g., nuclear)와 
  uniparental (plastid) 계통발생수 사이의 불일치(incongruence)를 기반으로 종간 잡종 또는 이입 식물을 식별하는 것은 잘 확립되어 있다 (Linder and Rieseberg, 2004).
• 대부분 꽃 식물에서 plastid DNA는 모계로 유전되는 반면,
  핵 DNA와 리보솜 DNA의 ITS 영역은 그렇지 않다 (Chase et al.,2005).
• Coffea에서 ITS 및 plastid 마커 분석을 사용하여
  이질사배체 (allotetraploid) C. arabica (C. eugenioides × C. canephora)와
  이배체 하이브리드 C. eugenioides × C. liberica의 부모를 식별한 바 있다  (Maurin et al., 2007).
• 이 연구의 일환으로, 우리는 알려진 교배 이력의 추가적인 종간 하이브리드,
  즉 C. arabica × C. racemosa (Medina Filho et al., 1977a,b)에 대한 테스트를 수행했고,
  그 결과, 최소한 최근에 만들어진 하이브리드들의 경우에, 이 방법의 유용성을 입증했다 (Figures 4, 5).
• 이 방법을 사용하여, 우리는 시에라리온에서 수집한 재배되는 재료에서
  종간 잡종 C. liberica × C. stenophylla (Figures 4, 5)를 식별할 수 있었다 (Table 1 참조).
  
  
• 하이브리드 C. liberica × C. stenophylla는 이전에 보고되었지만 (Cramer, 1957), 인증된 적은 없다. 
• 시에라리온에서 구해진 이 하이브리드의 액세션은 부분적으로 또는 완전히 불임인 것으로 보인다;
  어떤 해에는 몇 개의 과일을 생산하지만 씨앗의 생존력이나 번식력은 테스트되지 않았다.
• 과일이 맺히는 수준이 낮아 이 하이브리드는 다배체(polyploid)라기보다는 이배체(diploid)(2n = 22)임을 시사한다;
  사배체(tetraploids)는 일반적으로 번식력이 더 높거나 번식력이 회복된다 (Carvalho and Monaco, 1968; Charrier, 1978).
• 이 하이브리드가 재배 또는 야생에서 교배한 결과인지 알 수 있는 방법은 없다.
• 두 가지 기원 모두 가능하다: 두 종 모두 아프리카와 아시아의 여러 연구소에서 함께 재배되었으며 (Cramer, 1957); 현장 교배(in situ crossings)가 보고되었다.
• Ivory Coast에서는 C. liberica × C. stenophylla의 하이브리드 묘목(성숙한 식물은 아님)이 야생에서 발견되었다 (Berthaud, 1986).
• 일반적으로 Coffea의 자연 개체군에서 종간 잡종화(interspecific hybridization)는 드문 현상이다 (Charrier, 1978; Berthaud, 1986).
  
  
• 종간 잡종은, 번식력(fertility) (따라서 yield)이 
  4배체(4n = 44) 상태로 전환되어 회복되면(Carvalho 및 Monaco, 1968; Nagai 등, 2008), 
  커피 작물 개발의 가치가 있는데, 유용한 형질을 도입할 가능성을 제공하기 때문이다.
• 예를 들어, 아라비카 커피의 경우
  CLR 저항성(C. canephora × C. arabica; Clarindo et al., 2013; Avelino et al., 2015)과
  leaf-miner 저항성 (C. arabica × C. racemosa; Medina Filho et al., 1977b)이 있다.
• 장주성(long-styled) 아프리카 종에 대한 우리의 DNA 조사[Coffee Crop Wild Relative Priority Groups Ⅰand Ⅱ (Davis et al., 2019)]에서 우리는 모든 주요 아프리카 커피 클레이드들(혈통)에서 교잡이 가능하다는 것을 확인했으며, 이는 광범위한 Coffea 종 다양성에서 맞춤형 종간 교잡종을 만들 수 있는 잠재력이 있음을 나타낸다.

 

 

 CONCLUSION

 

• Coffea affinis와 C. stenophylla는 맛, 질병 저항성, 기후 회복력을 포함하여 커피 작물 식물 개발에 유용한 속성을 가질 수 있다. 
• 이러한 속성들은 종간 교배와 사배체화를 포함한 육종 프로그램을 통해 가장 잘 평가될 수 있을 것이다. 
• 여기서 우리는 (초기) 교잡화(hybridization)가 long-styled 아프리카 Coffea 종의 모든 주요 클레이드(Maurin et al., 2007; Davis et al., 2011; Hamon et al., 2017), 즉 Coffee Crop Wild Relative (Priority) Groups I and II에서 가능하다는 것을 확인한다 (Davis et al., 2019).
• C. stenophylla의 경우,
  DNA 시퀀싱을 통해 C. liberica와 교배할 수 있음을 확인했으며, 이는 Louarn (1992)의 연구를 뒷받침한다. 
• Louarn은 C. stenophylla가 C. canephora, C. congensis, C. pseudozanguebariae와 교배될 수 있음을 보여주었다.
• 최소한의 작물화 (예: 특성 특정 유전자형 선택)를 통해 C. stenophylla와 C. affinis를 개발하는 것이 가능할 수 있지만, 이 경로는 우수한 맛에 대한 역사적 보고에 따르면 스페셜티 커피 부문의 상위권과 같은 고가 시장에서만 가능할 것이다.
• 생산성(그린 커피 소출)은 주요 상업용 종(C. arabica, C. canephora, C. liberica)보다 낮은 것으로 보인다.
  
  
• 여기서 중요한 단서는 C. stenophylla가 현대적 환경에서 관능적 평가 또는 농업적 평가를 거치지 않았다는 것이다.
• 이 종에 대한 우리의 이해가 부족함에도 불구하고, 여기에 요약 및 검토된 이용가능한 증거는
  C. affinis와 C. stenophylla에 대한 추가 연구를 보장하고, 야생(in situ) 및 경작(ex situ)에서 생존을 보장하기 위한 조치를 취하기에 충분하다. 
• 삼림 벌채 및 기타 형태의 토지 이용 변화는 시에라리온, 코트디부아르 및 기니에서 야생에서 이 종의 생존을 위협하고 있다.
  
  
• Upper West Africa에서 C. stenophylla를 작물 식물로 사용하는데 있어 쇠퇴는 극적으로, 19세기 후반과 20세기 초반에 널리 사용되던(비교적 소규모이긴 했지만) 것에서 오늘날에는 전혀 사용되지 않는 것으로 나타났다.
• 시에라리온의 지역 농업 공동체에 대한 조사 결과, 이 종에 대한 토착 지식이 없는 것으로 나타났다.
• 그 사용이 감소한 또 다른 주요 이유 중 하나는 로부스타 커피(C. canephora)의 상당한 농업적, 상업적 성공이었을 수 있다. 
• 이 커피는 C. stenophylla와 거의 같은 시기에 세계 재배에 도입되었고 다른 활용도가 낮은 커피 종의 비교적 빈약한 생산성을 크게 앞지르며 성공을 거두었다 (Davis et al., 2019).
• 시에라리온에서의 현장 조사(2018~2020년)에 이어, C. affinis와 C. stenophylla의 야생 식목이 관능적 및 농업적 평가와 그 존재 보호를 위해 현재 대량으로 증식되고 있다.
  
  
• Guinea와 Ivory Coast에서의 필드 워크는 각각 현재의 토착 및 재배(farmed) 상태를 더욱 확인하고, 야생에서 생존을 보장하기 위한 보존 관리 계획을 제공하기 위해 필요하다.
• 유전자형 분석(게놈 뱅킹)을 포함한 커피 리서치 컬렉션에 대한 심층적인 검토는 C. affinis 및 C. stenophylla와 실제로 많은 다른 커피 종에 대한 효과적인 현지외 보존(ex situ conservation) 관리 전략을 수립하는데 필요하다.
• 아프리카 커피 종들은 글로벌 커피 부문의 지속가능성을 위한 핵심 자원을 제공하며 (Davis et al., 2019), 야생(in situ) 및 경작(ex situ)에서 적절한 보존 조치를 받아야 한다.

 

 

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