커피의 쓴맛 물질 3-O-Caffeoyl-epi-γ-quinide

ABSTRACT

커피의 쓴맛뿐만 아니라 5-O-caffeoyl quinic acid roasting mixtures에 관한 최근 연구들은
앞서 식별된 bitter 화합물들
■ 5-O-caffeoyl-muco-γ-quinide,
■ 3-O-caffeoyl-γ-quinide,
■ 4-O-caffeoyl-muco-γ-quinide,
■ 5-O-caffeoyl-epi-δ-quinide, and
■ 4-O-caffeoyl-γ-quinide
이외에 다른 아직 알려지지 않은 bitter lactone의 존재를 가리켰다.

본 연구에서, 이 orphan bitter lactone이
⇒ 5-O-caffeoylquinic acid model의 건열(dry heating)에 의해 생성된
반응산물들로부터 분리되었고,
⇒ 그 구조가
liquid chromatography−mass spectrometry (LC-MS) 그리고
one-/two-dimensional NMR experiments에 의해서
앞서 보고되지 않았던 3-O-caffeoyl-epi-γ-quinide로 결정되었다.

커피 음료 내에서의 이 bitter lactone의 발생이
⇒ 58 μmol/L의 낮은 쓴맛 인식 식역을 보이면서,
⇒ 다중 반응 모니터링 모드에서 작동하는 LC-MS/MS (negative electrospray ionization)에 의해 확인될 수 있었다.

INTRODUCTION

커피의 매력적인 풍미를 개발하는 비결은 커피 원두의 로스팅에 있으며,
로스팅 시간과 온도는 소비자의 마음을 사로잡는 프리미엄 품질의 커피를 개발하는데 매우 중요하다.

◎ gas chromatography/olfactometry을 이용한
냄새 유발 휘발성 물질들에 대한 센서리-기반 스크리닝(sensory-based screening)과
◎ 후속적인 정량 분석(quantitative analysis), 그리고
◎ 아로마 재구성/생략 실험(aroma reconstitution/omission experiments)을 통해

⇒ 커피 음료의 전형적인 냄새 프로파일의 유발에는
30가지 정도의 냄새물질들(odorants)만 필요하다는 것이 인상적으로 입증되었지만 [1-3],
커피 콩 로스팅 시 나타나는 전형적인 쓴맛을 내는 분자들에 관한 지식은 아직 부족하다.

첫째, 체계적인 분석 연구 및 센서리 스터디들을 통해, 커피 쓴맛의 주요 유발 물질들은,
알칼로이드(alkaloids)인 카페인(caffeine)과 트리고넬린(trigonelline) [4]이 아니라,
열로 인해 생성된 화합물인
■ furfurylalcohol [5],
■ 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyde [6],
■ 다양한 pyrazines [6],
■ 2,5diketopiperazines [7]이라는 사실이 밝혀졌다.

아주 최근에,
미디엄-로스팅 커피로 만든 음료에 대한
◎ sensory-guided deconstruction,
◎ liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) 및
◎ one- (1D)/two-dimensional (2D) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, 그리고
◎ synthesis 등을 통해,
커피 생두 내의 non-bitter 5-O-caffeoylquinic acid [1, chlorogenic acid]가
콩을 로스팅하면 트랜스에스테르화, 에피머화 및 락톤화 반응들을 수반하며
5가지 쓴맛이 나는 클로로겐산 락톤(chlorogenic acid lactones)인
■ 5-O-caffeoyl-muco-γquinide (2),
■ 3-O-caffeoyl-γ-quinide (3),
■ 4-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (4),
■ 5-O-caffeoyl-epi-δ-quinide (5), and
■ 4-O-caffeoyl-γ-quinide (6)로 전환된다는 사실이 밝혀졌다. [8] (Figure 1).

마찬가지로,
쓴맛을 내는
■ 3-O-feruloyl-γ-quinide와
■ 4-O-feruloyl-γ-quinide가
O-feruloylquinic acids로부터 생성되는 것으로 발견되었으며,
쓴맛을 내는
■ 3,4-O-dicaffeoyl-γ-quinide,
■ 3,5-O-dicaffeoyl-epi-δ-quinide, and
■ 4,5-O-dicaffeoyl-muco-γ-quinide가
the corresponding O-dicaffeoylquinic acids로부터 생성되는 것으로 발견되었다 [8].

Figure 1. 5-O-caffeoylquinic acid (1)의 열처리 (30분, 230도) 중에 형성된 것으로
선행연구들에서 식별된 苦味 락톤들의 화학구조

5-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (2),
3-O-caffeoyl-γ-quinide (3),
4-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (4),
5-O-caffeoyl-epi-δ-quinide (5),
4-O-caffeoylγ-quinide (6), 그리고
새로운 3-O-caffeoyl-epi-γ-quinide (7).

인간 센서리 연구들에서 이 락톤들의 쓴맛 식역치 수준은
화학 구조에 따라 9.8~180 µmol/L 범위에 있는 것으로 나타났다 [8].

이 락톤들 외에도 O-caffeoylquinic acids 및/또는 상응 퀴나드들의 카페욜 부분(성분)의
열 분해에서 유래하는,
오래 지속되고, 거칠고, 쓴맛이 나는(lingering, harsh, bitter-tasting) 4-vinylcatechol oligomers가
최근 커피 음료에서 확인되었다 [9].

커피 그리고 5-O-caffeoyl quinic acid 로스팅 혼합물들에 관한 예비 스터디들을 수행한 결과,
또 다른, 아직 알려지지 않은 쓴맛 나는 O-caffeoylquinide의 존재가 나타났고,
본 연구의 목적은
◆ 이 孤兒 락톤의 분리와 화학 구조 결정, 및
◆ 그 락톤의 쓴맛 인식 식역의 결정, 그리고
◆ 커피 음료 내에서의 이 화합물의 발생을 LC-MS/MS 실험들로 확인하는 것이었다.

MATERIALS AND METHODS

Chemicals.

모든 화학 물질들은 Sigma-Aldrich(Steinheim, Germany)에서 구입하였고,
용매는 Merck(Darmstadt, Germany)에서 HPLC-grade로 구입하였으며,
중수소화 용매(deuterated solvents)는 Euriso-top(Saarbrucken, Germany)에서 공급받았다.
볶은 커피 원두는 커피 업계로부터 구입하였다.
5-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (2),
3-O-caffeoyl-γ-quinide (3),
4-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (4),
5-Ocaffeoyl-epi-δ-quinide (5) 및
4-O-caffeoyl-γ-quinide (6)의 레퍼런스 화합물은 이전에 보고된 절차[8]에 따라 제조 및 정제하였다.

Analytical Sensory Experiments.

12명의 평가자(남성 5명, 여성 7명, 연령 23-40세)에게
본 연구의 센서리 테스트 참여에 대한 사전 동의를 받았으며,
그들은 알려진 미각 장애 병력이 없었으며,
앞서 설명한 바와 같이 최소 2년 동안 정기적으로 센서리 실험 훈련을 받았으며[10-14],
적용하는 기법에 익숙했다.
센서리 분석은 22-25℃의 센서리 패널실에서 세 차례에 걸쳐 진행되었다.
냄새물질들과의 교차-모달 상호작용을 방지하기 위해 패널리스트들은 코 클립을 사용했다.
Precautions Taken for Sensory Analysis of Food Fractions and Taste Compounds.
식품 분획물 및 맛 화합물들에 대한 센서리 분석을 위해 취해진 사전 주의사항.
센서리 분석 전, 동결 건조된 분획물들(fractions)로부터 용매 흔적을 제거했다.
이를 위해 각 분획물들을 물에 용해시키고,
고진공(<5 mPa, 35 ℃)에서 잔류 휘발성 물질과 용매 흔적을 제거했다.
이후 각 잔류물을 다시 물에 녹여 두 번 동결 건조했다.
High-resolution gas chromatography-MS 분석 및 이온 크로마토그래피 분석 결과,
이 방법으로 처리한 식품 분획물은 사용된 용매와 완충 화합물(buffer compounds)이 거의 없음을 확인했다.
Taste Recognition Threshold Concentrations. (미각 인지 식역 농도).
정제된 쓴맛 화합물들의 식역 농도는
미량의 포름산(formic acid)(물에 1%)을 첨가하여 pH 5.2로 조정한 생수에서
이전에 보고된 절차[10, 12]에 따라 자극 농도를 증가시키는 triangle tests를 사용하여 측정했다.
센서리 그룹의 식역 값들은 세 번의 독립적인 세션에서 각 개인의 식역 값을 평균하여 근사했다.
개인 간 및 개별 세션 간 값은 플러스 또는 마이너스 희석 단계 하나만큼만 차이가 있었다;
즉, 카페인의 식역치 0.5 mmol/L은 0.25~1.0 mmol/L 범위를 나타낸다.

Model Roasting Experiments..

5-O-Caffeoylquinic acid (3.0 mmol)를
물(2 mL)에 현탁시키고,
80 ℃에서 30분간 건조한 후,
실험실 오븐에서 230 ℃에서 각각 18, 24, 30, 36분간 건열하였다.
반응 생성물을
80 ℃에서 물(40 mL; pH 5.2)에 용해시키고, 실온으로 식힌 후,
두 개의 分取液(aliquots)으로 나누었다.
한 分取液(20 mL)은 센서리 분석에 사용하였고,
다른 분취액(20 mL)은 에틸 아세테이트(각각 50 mL)로 5회 추출하였다.
합쳐진 유기층을 고진공(<5 mPa)에서 용매를 제거하고,
잔류물을 메탄올/물(1/1, v/v; 6 mL) 혼합물에 넣고
HPLC/ diode array detection (DAD)로 분리하였다.

Isolation of a Novel Bitter Lactone 7.

위에 자세히 설명한 로스팅 실험에서 얻은 용매 추출물은
250mm×21.2mm i.d., 5µm, phenyl-hexyl 컬럼(Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)을
사용하는 분취용 HPLC로 분리했다.
324 nm에서 유출물을 모니터링하면서
포름산 수용액(0.25mol/L, pH 3.5)과 메탄올의 혼합물(75/25, v/v)로 시작하여
크로마토그래피를 수행한 다음,
38분 이내에 메탄올 함량을 28%로 증가시키고,
7분 이내에 100%로 증가시키고, 마지막으로 메탄올 함량을 5분 더 유지했다.
HPLC 피크 1~7(Figure 2)의 유출물들을 여러 번 실행들(runs)에서 개별적으로 수집했고,
해당 분획들의 분리물들을 합쳤다.
용매를 진공 상태에서 제거한 후,
각 분획을 C-18 E 카트리지(10g)(Phenomenex)를 사용하여
고체상 추출법(solid phase extraction)으로 최종 정제했다.
이 카트리지는 아세토니트릴(3×50mL)로 사전 처리한 다음, 물(3×50mL)로 처리했다.
샘플을 적용한 후,
카트리지를 물(50mL)로 헹구고,
진공 펌프를 사용하여 15분 동안 카트리지를 통해 질소를 흡입한 후,
마지막으로 아세토니트릴(100mL)로 표적 화합물을 용출했다.
고진공(<5 mPa) 상태에서 용매를 제거한 후,
피크 2~7의 분리체들을 UV/vis, LC-MS/MS 및 1D/2D NMR 실험을 통해 스터디했다.
화합물 2~6의 스펙트로스코피 데이터는
5-O-caffeoyl-mucoγ-quinide (2),
3-O-caffeoyl-γ-quinide (3),
4-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (4),
5-O-caffeoyl-epi-δ-quinide (5), 그리고
4-O-caffeoyl-γ-quinide (6)의 경우에 이전에 발표된 데이터[8]와 잘 일치하는 반면,
화합물 7은 ⇒ 이전에 보고되지 않은 3-Ocaffeoyl-epi-γ-quinide로 식별되었다.

3-O-Caffeoyl-epi-γ-quinide

(the arbitrary numbering of the carbon atoms refers to structure 7 given in Figure 1):

UV/vis (water/MeOH; 5/5, v/v): λmax ) 235, 300, 324 nm.
LC-TOF-MS: m/z 335.2971 ([M-H]^-, measured), m/z 335.2976 ([M-H]^-, calcd for C₁₆H₁₆O₈).
LC/ MS (ESI^-): m/z 335.1 (100; [M-H]^-).
¹H NMR [400 MHz; MeOD-d₃; correlation spectroscopy (COSY)]: δ 1.87 [dd, 1H, J=10.8, 11.8 Hz, H-C(2_ax)], 2.22 [d, 1H, J=11.7 Hz, H-C(6_ax)], 2.36-2.44 [m, 1H, J=3.4, 7.4, 11.8 Hz, H-C(2_eq)], 2.48-2.56 [m, 1H, J=3.4, 6.8, 11.7 Hz, H-C(6_eq)], 3.94 [dd, 1H, J=1.0, 8.3 Hz, H-C(4_ax)], 4.71 [dd, 1H, J=1.0, 6.8 Hz, H-C(5_eq)], 4.88-4.96 [m, 1H, J=7.4, 8.3, 10.8 Hz, H-C(3_ax)], 6.30 [d, 1H, J=15.9 Hz, H-C(8’)], 6.80 [d, 1H, J=8.2, H-C(5′)], 6.96 [dd, 1H, J=1.9, 8.2 Hz, H-C(6′)], 7.06 [d, 1H, J=1.9, H-C(2′)], 7.61 [d, 1H, J=15.9, H-C(7′)].
¹³C NMR (100 MHz; MeOD-d₃; HMQC, HMBC): δ 37.1 [CH2, C(2)], 40.1 [CH2, C(6)], 68.3 [C, C(1)], 71.7 [CH, C(4)], 72.0 [CH, C(3)], 78.9 [CH, C(5)], 113.1 [CH, C(8′)], 113.6 [CH, C(2′)], 115.1 [CH, C(5′)], 121.6 [CH, C(6′)], 126.2 [C, C(1′)], 145.2 [C, C(3′)], 146.2 [CH, C(7′)], 148.2 [C, C(4′)], 166.9 [C, C(9′)], 177.8 [C, C(7)].

Preparation of the Coffee Beverage.

커피 콩을
sieve (2 mm pore diameter)가 장착된
초원심분리기 분쇄기 (ultracentrifuge mill) (Retsch, Haan, Germany)로 분쇄한 다음,
그 커피 파우더의 분취량 (54 g)을 커피 필터 (Melitta, Minden, Germany)에 넣었고,
“Melitta Look” 커피 메이커(Melitta)를 사용하여 그 량이 1 L될 때까지 열수로 퍼콜레이트했다.
결과로 나온 음료 (54 g/L)는 온도가 76 ℃였고, HPLC-MS/MS 분석 전에 아이스 바쓰에서 빨리 식혔다.

HPLC.

HPLC 장비 (Jasco, Gross-Umstadt, Germany)의 구성
⇒ 2개의 PU 2087 타입 펌프, 100 or 1000 µL loop의 Rheodyne 인젝터, 그리고
MD 2010 plus 타입 DAD (220~500 nm 범위에서 용출물을 모니터링).
분리는 250 mm×4.6 mm i.d. or a 250 mm×21.2 mm i.d., 5 µm,
phenyl-hexyl 컬럼에서 수행되었고 (Luna, Phenomenex),
각각 0.8 또는 18.0 mL/min의 유속(ﬂow rate)으로 작동되는 것이었음.

LC/Time-of-Flight Mass Spectrometry (TOF-MS).

High-resolution mass spectra (고해상도 질량 스펙트럼)가
Bruker Micro-TOF mass spectrometer (Bruker Daltronics, Bremen, Germany)로 측정되었으며
포름산 나트륨(sodium formate)을 기준으로 했다.

Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템과 Applied Biosystems MDS Sciex 4000 QTrap MS

HPLC/Tandem Mass Spectrometry (MS/MS).

Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템 (Agilent, Waldbronn, Germany)은
펌프(pump), 탈기 장치(degasser), 그리고 자동 시료 주입기(autosampler) 로 구성되었으며,
4000 QTrap triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometer
(삼중 사중극자/선형 이온 트랩 질량 분석기)(Applied Biosystems/MDS Sciex, Darmstadt)에 연결되었다.
이 질량 분석기는 전기분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 장치를 갖추고 있으며,
분무 전압(spray voltage) -4500 V의 네거티브 이온화 모드에서 돌아간다.
사중극자(quadrupoles)는 단위 질량 분해능(unit mass resolution)으로 작동했다.
질소가 커튼 가스(curtain gas) (20psi)로 사용되었으며,
ESI– 모드에서 탈클러스터링 전위(declustering potential)는 -10~-85V로 설정되었다.
질량 분석기(mass spectrometer)는
음이온을 모니터링하기 위해 풀 스캔 모드(full scan mode)로 작동했다.
[M-H]– 분자이온을 특정 생성 이온(product ions)으로 분할하는 것은
질소(5 × 10-5 Torr)와 -15~-70V의 충돌 에너지를 통해 유도되었다.
계측 제어 및 데이터 수집을 위해 Sciex Analyst 소프트웨어(v 1.4.2)가 사용되었다.
커피 음료에 함유된 락톤 7의 HPLC-MS/MS 분석을 위해,
150 mm × 2 mm 내경, 4 µm의 Synergi Fusion 컬럼(Phenomenex)을
multiple reaction monitoring mode (다중 반응 모니터링 모드, MRM)로 작동하는 질량 분석기에 연결하여
음이온들을 검출했다.
150 ms 동안 질량 전이(mass transitions) m/z 335→133, m/z 335→135, 그리고 335→161을
락톤 분석에 사용했다.
질소가 분무 가스(nebulizer gas)(30 psi)와 용매 건조용 터보 가스(turbo gas)(350 °C)(50 psi)로 사용되었다.
샘플(5 µL)을 주입한 후,
포름산 수용액(물에 1%)과 메탄올의 혼합물(75/25, v/v)로 시작하여
메탄올 함량을 10분 이내에 40%, 15분 이내에 60%,
최종적으로 13분 이내에 100%까지 증가시키고
그런 다음 메탄올 함량을 7분 더 유지하는 구배법(gradient)을 사용하여
250 µL/분의 유속으로 크로마토그래피를 수행했다.

NMR Spectroscopy.

1D 및 2D NMR 실험은 Bruker DMX-400 (Bruker, Rheinstetten, Germany)에서 수행했다.
화학적 이동은
양성자 차원에서 테트라메틸실란(tetramethylsilane, TMS)을 내부 표준으로 사용하고,
탄소 차원에서는 MeOD-d₃(49.3 ppm)의 탄소 신호를 사용하여 측정했다.

RESULTS AND DISCUSSION

커피와 5-O-caffeoyl quinic acid (5-O-카페욜퀸산) 로스팅 혼합물에 관한 최근 연구에서는
이전에 보고된 쓴맛을 내는 락톤 2~6 [8] 외에도
아직 알려지지 않은 O-caffeoylquinic acid의 탈수 산물이 존재함을 확인했다.
이 孤兒 화합물을 확인하기 위해,
5-O-caffeoyl quinic acid를 230℃에서 각각 18분, 24분, 30분, 36분 동안 건열 처리하고,
반응 산물을 물에 녹인 후 에틸 아세테이트를 추출했다.
유기 추출물의 HPLC/DAD 분석은
크로마토그래피(RP-HPLC) 및 분광 데이터(LC-MS, UV/vis)를 레퍼런스 화합물들[8]의 데이터와 비교했을 때,
5-O-chlorogenic acid과, 그리고
5-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (2),
3-O-caffeoylγ-quinide (3),
4-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (4),
5-O-caffeoyl-epi-δ-quinide (5), and
4-O-caffeoyl-γ-quinide (6)로 지정된 이전에 보고된 5가지 락톤들의 피크 패턴 사이에서
용출되는 고아 화합물 7의 시간 의존적 생성을 보여주었다 (Figure 2).
5-O-caffeoyl quinic acid를 230℃에서 30분 동안 가열했을 때,
화합물 7의 수율이 가장 높았으므로 ,이 반응 혼합물을 이어지는 구조 결정 실험에 사용했다.
화합물 7은
에틸 아세테이트 추출물로부터 분취용 RP-HPLC를 이용하여 분리한 후,
RP18 카트리지를 이용한 고상 추출법(solid phase extraction)을 이용하여 최종 정제하였다.
정제된 화합물 7의 수용액 센서리 분석 결과, 락톤 2~6에서 보고된 것[8]과 유사한 강렬한 쓴맛이 나타났다.

Structure Determination of Bitter Lactone 7.

화합물 7 용액의 UV/vis spectroscopy는
이전에 보고된 O-caffeoylquinides 2~6 (Figure 1)에서 발견된 것과 동일한
235, 300, 324 nm에서 흡광 최대값을 보였다. 또한,
LC-MS 분석 결과,
m/z 335의 강한 유사 분자 이온(pseudo molecular ion) [M-H]^-가 확인되었는데,
이는 클로로겐산에서 물 분자 하나가 손실되어 형성된 caffeoylquinide와 매우 유사하다.
ESI 모드에서 LC-MS/MS 실험 결과,
daughter ions의 m/z 값이 각각 179.1, 161.0, 135.1로 나타났으며,
이는 각각 caffeic acid와 vinylcatechol 분자가 분해된 결과와 매우 유사하다 (Figure 3).
화합물 7의 LC-MS/MS 데이터를
최근 보고된 3-Ocaffeoyl-γ-quinide 데이터[8]와 비교한 결과,
동일한 단편화 패턴이 나타났으며,
이는 화합물 7이 클로로겐산으로부터 락톤화 반응에 의해 생성되었음을 더욱 뒷받침하는 증거이다.
¹H NMR 스펙트로스코픽 데이터 분석 결과,
총 12개의 공명 신호(resonance signals)가 나타났으며,
각 신호는 양성자 하나에 대해 통합되었다 (Table 1 및 Figure 4).
6.2~7.7ppm 사이의 aromatic/oleﬁnic region의 신호는
각각 6.30 ppm과 7.61 ppm에서 두 개의 올레핀 양성자(oleﬁnic protons) H-C(8')와 H-C(7')를 갖는
caffeoyl acid moiety의 전형적인 결합 패턴을 보였으며,
화합물 7의 caffeic acid residue의 (E)-conﬁguration을 나타내는
예상 결합 상수(expected coupling constant) 15.9Hz를 나타냈다.
또한, 각각 8.2, 8.2/1.9 및 1.9Hz의 결합 상수(coupling constants)를 나타내는
6.30ppm, 6.96ppm 및 7.06ppm에서 공명하는 양성자는
H-C(5'), H-C(6') 및 H-C(2')로 지정될 수 있다.
Homonuclear (H,H) correlated gs-COSY spectroscopy는
3.94 ppm에서 공명하는 메틴 양성자(methine proton)와
각각 H-C(3) 또는 H-C(5) 사이에 강한 결합을 나타냈다.
이 메틴 양성자는 H-C(4)로 분류될 수 있는데,
이는 이 양성자만이 H-C(3) 및 H-C(5)와 동핵 결합(homonuclear couplings)을 나타낼 수 있지만,
H-C(2) 및 H-C(6)과는 각각 동핵 결합을 나타낼 수 없기 때문이다.

이 제안은
H-C(3)이 H-C(2) 및 H-C(4)와 연결성을 보이는 반면,
양성자 H-C(5)는 메틸렌 그룹 H-C(6) 및 메틴 양성자 H-C(4)에 연결되어 있다는 관찰에 의해 더욱 강화되었다.
H-C(3)과 H-C(4) 사이에서 측정된 8.3 Hz의 ³J coupling constant는 의심할 여지 없이
각 양성자의 axial-axial conformation를 식별하는 반면,
양성자 H-C(4)와 H-C(5) 사이에서 관찰된 1.0 Hz의 결합 상수는
제안된 락톤 2 (Figure 2) 구조에서
이들 양성자의 axial-equatorial orientation을 나타낸다 (Figure 1).
이러한 모든 결과는
카페산(caffeic acid)과의 에스테르化(esteriﬁcation)로 인한 것으로 추정되는
H-C(4)의 downﬁeld shift를 제외하고는
epi-γ-quinide (15)에 대해 보고된 데이터와 잘 일치했다 (Table 1).
이 가정은
²J_C,H 및 ²J_C,H 결합 상수에 최적화된
離核多重結合相關分光法(by heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy, HMBC)과
¹J_C,H 결합 상수에 최적화된 離核多重量子相關 (heteronuclear multiple quantum correlation, HMQC)에
의해 더욱 강화되었다.
HMBC 실험은
166.9ppm에서 공명하는 카르보닐基(carbonyl group)와 양성자 H-C(3), H-C(7′), H-C(8′) 사이의
상관관계를 밝혀냈고,
퀴나이드 잔기(quinide residue)의 탄소 원자 C(3)에로의 에스테르 결합(ester bond)을 통해
카페욜일 부분(caffeoyl moiety)이 연결되어 있음을 확인했다.
177.8 ppm의 탄소 신호와 H-C(5), H-C(2), 그리고 H-C(6)의 HMBC 상관관계는
제안된 락톤 구조와 잘 일치하였는데,
이는 H-C(5)와 C(7) 사이의 3J 결합이 락톤화 이후에만 가능하기 때문이다.
모든 스펙트로스코픽 데이터를 고려할 때,
HPLC fraction 7 (Figure 2)에서 분리된 쓴맛 화합물은
이전에 보고되지 않았던 3-caffeoyl-epi-γ-quinide (7, Figure 1)로 명확히 확인되었다.

Bitter Recognition Threshold Concentrations.

센서리 분석에 앞서 락톤 7의 순도는 ¹H NMR spectroscopy와 HPLC-MS를 통해 확인했다.
쓴맛에 대한 인체 식역치 농도를 측정하기 위해
락톤 2의 수용액 (pH 5.2)을 a triangle test (Table 2)으로 평가했다.
새로운 3-caffeoyl-epi-γ-quinide (2)의 쓴맛 식역치 농도(bitter threshold concentration)는
58 µmol/L로 측정되었으며,
이는 다른 γ-quinides 2, 3, 4, 6에서 측정된 농도 범위와 동일했고,
5-O-caffeoyl-epi-δ-quinide (Table 2)의 역치보다 3배 낮았다.

Identiﬁcation of the Bitter Lactone 7 in Coffee Brew.

커피 음료 내에서의 3-caffeoyl-epi-γ-quinide 발생을 확인하기 위해,
MRM mode에서 작동하는 LC-MS/MS(ESI^-)를 통해 갓 만든 커피에서 화합물 7을 스크리닝했다.
분석에 앞서, 튜닝 런에서 맛 화합물에 대한 특징적인 질량 전이들(mass transitions)이 선정되었다.
그 후, 커피에서 화합물 7의
retention time과 특징적인 질량 전이를 기준 화합물의 그것과 비교했다.
Mass transition m/z 335→161의 경우 Figure 5에 표시된 것처럼,
HPLC-MS/MS (MRM)를 통해 커피에서 목표 화합물 7을 명확하게 검출할 수 있었다.
선택한 크로마토그래피 조건에서 다른 락톤들 2~6은 분리되지 않았고 8분 후에 공동 용출되었다.
또한, 커피에서 쓴맛을 내는 화합물 7의 정체는
볶은 5-Ocaffeoylquinic acid model system에서 분리한 해당 기준 화합물을 사용하여
cochromatography 를 통해 확인했다.
우리가 아는 한, 다양한 아라비카와 로부스타 커피에서 검출될 수 있는
쓴맛이 나는 락톤 7(데이터 미제시)은 이전에 문헌에 보고된 적이 없다.
6가지 monocaffeoylquinides 2~7이 커피 음료의 전반적인 쓴맛에 미치는 영향을 보여주기 위해, 이러한 맛을 내는 물질들을 "natural" 농도로 사용하는 정량적 연구와 맛 재구성 실험이 현재 진행 중이며 다른 곳에서 발표될 예정이다.

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커피의 쓴맛 물질 3-O-Caffeoyl-epi-γ-quinide

ABSTRACT

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS AND DISCUSSION

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