커피의 쓴맛 화합물 濃度

 

 ABSTRACT

• Coffee roasting 동안의 쓴맛 나는 전구물질들(bitter precursors)인
  ┌ 3-O-caffeoyl quinic acid (1),
  ├ 5-O-caffeoyl quinic acid (2), and
  └ 4-O-caffeoyl quinic acid (3)의 분해 뿐만 아니라
  bitter tastants의 형성에 대한 roasting time과 temperature의 영향을 탐구하기 위해, 우리는
  ┌ 260 ℃에서 60-600 s 동안, 또는 --┐
  └ 190-280 ℃에서 240 s 동안 -------┘로스트 된 콩들로부터 coffee brews를 마련했다. 
  
  
• HPLC-UV/vis and HPLC-MS/MS에 의하여,
  쓴맛 나는(bitter-tasting)
  ┌ monocaffeoyl quinides (4~8),
  ├ dicaffeoyl quinides (9~11), and
  ├ 4-vinylcatechol oligomers (12~20) 뿐만 아니라
  └ parent bitter precursors 1~3이 ⇒ 이 brews에서 정량적으로 분석되었다. 

• 커피-전형적인 쓴맛 프로파일을 보이는 Quinides 4~11가
  약간 medium 정도의 배전도에서 더 잘 형성되는 것으로 발견되었고,
  더 강한 로스팅 조건들 하에서는
      다시 또 분해하여
      harsh bitter-tasting 4-vinylcatechol oligomers를 형성한다는 것이 관찰되었는데,
  이는 센서리 연구들에 의해서 관찰된 bitter taste quality에서의 변화에 잘 매치되는 결과이다. 
  
  
• 추가적으로
  water percolation 중의 ground coffee로부터의
  bitter compounds의 발산 프로파일에 관한 정량적 연구는
  ⇒ compounds 1~8은 빠르게 추출되었고(rapidly extracted)
  ⇒ dicaffeoyl quinides 9~11는 다소 천천히 발산되었으며,
  ⇒ compounds 12~17은 ground coffee material에의 강한 유지(strong retention)를 보이는 것이
     발견되었음을 나타냈다. 
  
  
• 이 데이터는
  roasting 및 extraction 조건들에 대한 지식-기반 컨트롤이
  커피 음료의 쓴맛 시그니쳐(bitter taste signature)를 조절하는데 도움이 될 수도 있음을 시사한다. 

 

 INTRODUCTION

• Coffee roasting 동안의 Freshly brewed coffee는 전세계적으로 
  ┌ 그 stimulating effect,
  ├ attractive aroma, 그리고
  └ 쓴맛과 신맛 중심의 독특한 맛 때문에 - 소비자들에 의해 높이 평가된다.
• ┌ gas chromatography와 olfactometry에 의한
  │     커피 휘발성물질들의 odor activity에 대한 screening과,
  ├ 안정적인 isotope dilution analyses를 사용한 most odor-active molecules의 정량화, 그리고
  └ aroma reconstitution 실험들이
  ⇒ 1,000가지 휘발성 물질들 중 단 ~25가지만이
      신선하게 마련된 커피 음료의 전반적인 아로마에 공헌한다는 것을 인상적으로 보였다 [1-4]. 
• 반대로, 커피 음료의 전형적인 쓴맛을 유도하는 분자들에 대한 지식은 여전히 포괄적이지 않다.  
  
  
• 지난 30년 동안에 걸쳐 수행된 일련의 연구들은 커피 내의 쓴맛 분자들의 식별에 초점을 맞췄고
  ┌ 알칼로이드(alkaloids) caffeine과 trigonelline [5] 뿐만 아니라, 예를 들어,
  ├ furfuryl alcohol [6],
  ├ 5-hydroxymethyl-2-furanaldehyde [7],
  ├ pyrazines [7], and
  └ diketopiperazines [8]와 같은 열에 의해 생성되는 화합물들을
  ⇒ 핵심적인 쓴맛 화합물들의 추정적 후보들로 제시했다.  
  
  
• 그러나,
  ┌ 커피 음료에 대한 systematic sensory-guided fractionation 뿐만 아니라
  └ LC-MS/MS 및 one- and two-dimensional NMR 스터디들이 수반되는
      suitable model systems이
  ⇒ 커피 로스팅 동안에….생두의 주요 폴리페놀들인
  ┌ 3-O-caffeoyl quinic acid (1),
  ├ 5-O-caffeoyl quinic acid (2), and
  └ 4-O-caffeoyl quinic acid (3)이 각각 
  
  ⇒ bitter-tasting caffeoyl quinic acid lactones (Figure 1)
  ┌ 5-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (4), 
  ├ 3-O-caffeoyl-γ-quinide (5),
  ├ 4-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (6),
  ├ 5-O-caffeoyl-epi-δ-quinide (7),
  ├ 4-O-caffeoyl-γ-quinide (8),
  ├ 3,4-O-dicaffeoyl-γ-quinide (9),
  ├ 4,5-O-dicaffeoyl-muco-γ-quinide (10), and
  └ 3,5-O-dicaffeoyl-epi-δ-quinide (11)로
      열 변환 된다(thermally transformed)는 것을 밝혔다 [9]. 
• 나아가
  일련의 lingering and harsh bitter-tasting 4-vinylcatechol oligomers (12-20, Figure 1)이
  최근에 커피 음료에서 식별되었고 
  ┌ 5-O-caffeoyl quinic acid (2, Figure 1)와
  └ caffeic acid의 열분해(thermal degradation) 동안에 형성된다는 것이 밝혀졌다 [10, 11]
• 비록 어떤 예비 데이터가 
  커피 콩들의 로스팅 동안에 O-caffeoyl quinic acids의 분해에 관해 보고된 바 있지만 [12-16],
  ┌ bitter-tasting caffeoyl quinides 4-11과
  └ harsh bitter-tasting 4-vinylcatechol oligomers 12-20에 대한
  로스팅 파라미터들의 영향에 관한 체계적 연구들은 부족하다. 
  
• 본 연구의 목적은, 그러므로, 
  roasting degree가 다른 커피 콩들로 신선하게 마련된 음료 내의
  ┌ bitter-tasting ┌ O-caffeoyl quinides 4-11 and
  │                       └ 4-vinylcatechol oligomers 12-20 뿐만 아니라
  └ parent O-monocaffeoyl quinic acids 1-3의
  양을 정량적으로 결정하는 것이었다.
  또한 hot water percolation 동안의 이 화합물들의 발산이 정량적 토대 위에서 탐구 되어야 한다. 
  
  

 

 

 MATERIALS AND METHODS

 

Chemicals.

 

• 다음의 화합물들이 상업적으로 구입되었다 : 
• D-(-)-quinic acid (퀸산),
  p-toluenesulfonic acid monohydrate (p-톨루엔 술폰산 수화물),
  chloro formic acid 2,2,2-trichloroethyl ester (크로로포름산 2,2,2-트리크로로에틸 에스테르),
  anhydrous pyridine (무수 피리딘),
  caffeic acid (커피산),
  methyl chloro-formate (메틸 크로로포름),
  ammonium formate (포름산 암모늄),
  5-O-caffeoyl quinic acid (5-O-카페욜 퀴닉산, 5-CQA, 클로로제닉산),
  resveratrol (레스베라트롤) (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany),
• sodium hydrogen carbonate (탄산수소나트륨),
  hydrochloric acid (염산),
  sodium sulfate (황산나트륨),
  trichloroacetic acid (삼염화초산),
  sodium hydroxide (수산화나트륨, 가성소다),
  thionyl chloride (염화 티오닐),
  lithium chloride (염화 리튬),
  sodium carbonate (탄산나트륨),
• sodium chloride (염화나트륨) (Merck, Darmstadt, Germany),
• formic acid (포름산, 개미산) (Grüssing, Filsum, Germany), and
• d₄-methanol (Euriso-Top, Saarbrücken, Germany). 
• Solvents는 HPLC grade의 것들이었다 (Merck). 
  
  
• 최근에 보고된 프로토콜[9]에 따라서,
  3-O-caffeoyl quinic acid (1),
  5-O-caffeoyl quinic acid (2), 
  4-O-caffeoyl quinic acid (3),
  5-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (4),
  3-O-caffeoyl-γ-quinide (5),
  4-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (6),
  5-O-caffeoyl-epi-δ-quinide (7), and
  4-O-caffeoyl-γ-quinide (8)이
  decaffeinated coffee 또는 열처리된 5-O-caffeoyl quinic acid으로부터
  분리되어 정제되었다.
   
• 4,5-O-Dicaffeoyl-muco-γ-quinide (10) and
  3,5-O-dicaffeoyl-epi-δ-quinide (11)는
  열처리된
  ┌ 4,5-O-dicaffeoyl quinic acid and
  └ 3,5-O-dicaffeoyl quinic acid 로부터 각각 분리되었다 [9].
  
  
• 커피 콩들(Arabica Brazil, Santos)은 커피 업계에 의해서 제공되었다.
  

 

Preparation of a Standard Coffee Beverage. 

 

• 커피 콩들이 a batch mill (IKA, Staufen, Germany)로 분쇄된 후에, 
  커피 파우더 aliquots (54 g)을 커피 필터(No. 4, Melitta)에 넣고, 여과물이 1.0 L의 부피가 될 때까지
  끓는 물로 퍼콜레이트 되었다.   
• 그렇게 얻어진 커피 음료는 얼음 통에서 즉시 상온까지 냉각되었다. 

 

Sequential Hot Water Extraction of Ground Coffee. 

 

• 분쇄 커피 Aliquots (5.4 g)을
  ⇒ 빈 고체상 추출관(solid-phase extraction tube)에 넣고(Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)
      (volume of 60 mL),
  ⇒ 필터 페이퍼 디스크로 막았으며,
  ⇒ 고체상 추출 진공 처리기(solid-phase extraction vacuum processor) (Phenomenex)를 사용하여
       10개의 aliquots (10 mL each)에서 끓는 물로 순차적으로 퍼콜레이트하였다. 
• 그 10개의 용출 단계들 각각의 여과물들(filtrates)은 따로 따로따로 부피 측정 플라스크에 수거되었다. 
• 추가적으로, 커피 파우더 aliquots (5.4 g)을
  ⇒ 고체상 추출관(a solid-phase extraction tube)에 넣고
  ⇒ 열수(100 mL)로 퍼콜레이트 했고
  ⇒ 그 용출물(effluent)은 얼음 냉각된 유리병(ice-cooled glass vial)에 수거되었다. 

 

Synthesis of 3,4-O-Dicaffeoyl-γ-quinide (9). 

 

• 문헌[17]에 나온 절차에 따라 일부 수정하여,
  D-(-)-quinic acid (156 mmol)와
  p-toluenesulfonic acid monohydrate (5.89 mmol)를
  ⇒ dry acetone (600 mL)에 suspend하였고,
  ⇒ Soxhleth apparatus에서 20 h 동안 reflux(환류)하였는데,
      여기에는 분자 체(molecular sieve) [15 g, 4 Å (Merck)]로 채워진
      추출 골무(extraction thimble)가 장착되어져 있었다.
• 샘플이 5 ℃까지로 냉각된 후에,
  sodium hydrogen carbonate (95.2 mmol)이 더해졌고,
  그 현탁액이 추가로 60 min 동안 저어졌다. 
  
• Filtration 후에,
  ⇒ 그 솔벤트는 진공에서 제거되었고,
  ⇒ 나머지는 dichloromethane (300 mL)에 넣어졌고
  ⇒ 3,4-O-isopropyliden-1,5-quinide가 n-hexane (300 mL)의 추가 중에 결정화되었다.
• chloroformic acid 2,2,2-trichloroethyl ester (156 mmol) in dichloromethane (50 mL)의 용액이
  3,4-O-isopropyliden-1,5-quinide (146 mmol),
  pyridine (338 mmol), 그리고
  dichloro-methane (300 mL) 혼합물로 0 ℃에서 적상으로(dropwise) 더해졌고,
  그런 다음, 상온에서 2 h 동안 저어졌다.
  
  
• 형성된 백색의 침전물이
  ⇒ filtration에 의해 분리되어
  ⇒ dichloromethane (400 mL)에 용해되었고,
  ⇒ 그 용액은 hydrochloric acid (1 mol/L, 2×150 mL)으로 그리고 그 다음에
  ⇒ water (100 mL)에 의해서 추출되었다.
• 그 유기층이 Na₂SO₄(황산나트륨)로 건조되었고,
• 그 다음에 진공에서 100 mL까지로 농축되었으며,
• ethanol (800 mL)을 추가하여 밤새도록 4 ℃에서 냉각되어
• 1-O-(2,2,2-trichloroethoxycarbonyl)-3,4-O-isopropyliden-1,5-quinide가
  침전되어 filtration으로 분리되었다. 
• Water (6.8 mL)가 trichloroacetic acid (374 mmol)에 더해진 다음,
  맑은 용액이 얻어질 때까지 가열되었고
  그 샘플이 상온까지 식은 후에,
  1-O-(2,2,2-trichloroethoxycarbonyl)-3,4-O-isopropyliden-1,5-quinide (118 mmol)이
  비율에 따라 더해졌다. 
• 그 샘플을 4 h 동안 저은 후에,
  ⇒ ice-cooled water (450 mL), ethylacetate (900 mL), 그리고 그 다음에 
      aqueous NaHCO₃  solution (405 mmol in 900 mL of water)이
      차례로 그 반응 혼합물이 더해졌다.
  ⇒ 그 유기상(organic phase)이 분리되어
  ⇒ aqueous NaHCO₃  solution (2% in water, 120 mL)과 water (120 mL)로 추출되었다.
• 그 유기층이 Na₂SO₄로 건조되었고
  그 솔벤트가 진공에서 제거되었으며
  나머지가 70 ℃에서 toluene (250 mL)에 용해되었다.
• 그 용액은 밤새도록 4 ℃에서 유지되어
  백색의 무정형의 파우더(white amorphous powder)로서
  1-O-(2,2,2-trichloroethoxycarbonyl)-1,5-quinide가 침전되었으며
  이것이 filtration으로 분리되어 진공에서 건조되었다. 
  
  
• Methyl chloroformate (9.4 mL)를
  ⇒ 0 ℃에서 caffeic acid (51 mmol) in aqueous NaOH (1 mol/L, 150 mL)의 용액에
      적상으로(dropwise) 더했고,
  ⇒ 그 다음에, 노란 잔유물을 제공할 때까지 0 ℃에서 20 min 동안 저었다.
• aqueous HCl (2 mol/L)으로 그 반응 혼합물을 neutralization 한 후에,
  ⇒ 남은 것은 filtration에 의해 분리하였다.
• aqueous ethanol (50%, 250 mL)로부터의 재결정화(Recrystallization)가
  ⇒ 백색 결정으로서의 3,4-O-dimethoxycarbonyl caffeic acid를 제공하였다.
• 3,4-O-dimethoxycarbonyl caffeic acid (14.0 mmol)에
  ⇒ Thionyl chloride (96.0 mmol/L)를 적상으로 더했고,
  ⇒ 그 현탁액을 gas 발현이 완료될 때까지 90 ℃로 가열했고
  ⇒ 나머지 thionyl chloride는 nitrogen gas 스트림으로 제거하였다.
• toluene (150 mL)으로의 재결정화(Recrystallization)가
  노르스름한 결정들로서의 3,4-O-dimethoxycarbonyl caffeic acid chloride을 제공했다. 

O-(dimethoxycarbonyl)caffeoyl]-1,5-quinide.

• 3,4-O-dimethoxycarbonyl caffeic acid chloride (14.0 mmol) in dichloromethane (30 mL) 용액을
  1-O-(2,2,2-trichloroethoxycarbonyl)-γ-quinide (4.21 mmol) and
  pyridine (17.9 mmol) in dichloromethane (30 mL)의 용액에
  0 ℃에서 적상으로 더했다.
• 그 혼합물을 밤새 저은 후에,
  ⇒ 그 솔벤트는 진공에서 제거되었고,
  ⇒ 나머지는 ethyl acetate (200 mL)에 용해했으며
  ⇒ 그 다음에 aqueous HCl solution (1 mol/L, 35 mL), 
      an aqueous NaHCO₃ solution (2%, 35 mL), 그리고 
      water (35 mL)로 순차적으로 추출하였다.
• 그 유기층은 Na₂SO₄로 건조되었고,
  ⇒ 솔벤트는 진공에서 분리되어
  ⇒ 순수한
      1-O-(2,2,2-trichloroethoxycarbonyl)-3,4-bis[3,4-O-(dimethoxycarbonyl)caffeoyl]-1,5-quinide를
      만들었다.
• 이 산물의 앨리컷(2.21 mmol)을
  ⇒ lithium chloride (23.6 mmol) in pyridine (20 mL)으로 suspend 했고
  ⇒ 그 다음에 50 ℃에서 7일 동안 저었다.
• 그 솔벤트가 진공에서 제거된 후에,
  ⇒ 그 나머지는 ethyl acetate (100 mL)에 용해되었고,
  ⇒ 그 용액은 an aqueous HCl solution (1 mol/L, 50 mL),
      an aqueous Na₂CO₃ solution (2%, 50 mL), 그리고
      brine (50 mL)으로 순차적으로 추출되었다.
• Na₂SO₄로의 유기층 건조와 진공에서의 솔벤트 분리는
  ⇒ 갈색의 잔유물을 제공하였는데,
  ⇒ 이것이
      an ethyl acetate/methanol mixture (80/20, v/v)에 맞춰진(conditioned)
      Polyamide MN-SC-6 material (Macherey-Nagel, Düren, Germany)의 슬러리로 채워진
      a glass column (300 mm × 30 mm)의 상부에 적용되었다(applied).
• 그 컬럼을
  ⇒ ethyl acetate/methanol mixture (80/20, v/v) (500 mL)로 헹군 다음,
  ⇒ methanol의 양을 늘려 (from 30 to 100%)
      ethyl acetate/methanol mixtures (300 mL each)로 헹구었다.
• 진공에서의 솔벤트 분리 후에,
  ⇒ 70/30 (v/v) 그리고 60/40 (v/v) ethyl acetate/methanol 혼합물이
      표적 화합물인 3,4-O-dicaffeoyl-γ-quinide를 제공했는데,
  ⇒ 이는 열처리된 3,4-O-dicaffeoyl-γ-quinic acid [9]로부터 분리되어진
      3,4-O-dicaffeoyl-γ-quinide에 대해 최근에 보고된 것의
      chromatographic (RP-HPLC) and spectroscopic data (LC-MS/MS, NMR, and UV/vis)의
      비교로 그 identity가 확인되었다.

3,4-O-Dicaffeoyl-γ-quinide (9) 

(the arbitrary numbering of the carbon atoms refers to the structure in Figure 2) :

UV/vis [5/5 (v/v) methanol/ water] λmax = 235, 300, 328 nm;
LC-MS (ESI^-) m/z 497 (100; [M - H]^-);
¹H NMR (400 MHz, d₃-MeOD, COSY) δ 2.20-2.34 [m, 2H, H-C(2_eq), H-C(2_ax)], 
      2.45-2.62 [m, 2H, H-C(6_eq), H-C(6_ax)], 
      4.95 [dd, 1H, J = 5.6, 5.0 Hz, H-C(5eq)],
      5.20 [ddd, 1H, J = 11.5, 6.6, 4.7 Hz, H-C(3ax)], 
      5.63 [dd, 1H, J = 4.7, 5.0 Hz, H-C(4eq)],
      6.16 [d, 1H, J = 15.9 Hz, H-C(5’)], 
      6.40 [d, 1H, J = 15.7 Hz, H-C(5”)], 
      6.70 [d, 1H, J = 8.1 Hz, H-C(3’)], 
      6.81 [d, 1H, J = 8.2 Hz, H-C(3”)],
      6.83 [dd, 1H, J = 8.1, 2.1 Hz, H-C(2’)],
      6.99 [dd, 1H, J = 8.2, 2.1 Hz, H-C(2”)], 
      7.02 [d, 1H, J = 2.1 Hz, H-C(1’)], 
      7.10 [d, 1H, J = 2.1 Hz, H-C(1”)],
      7.50 [d, 1H, J = 15.9 Hz, H-C(4’)],
      7.64 [d, 1H, J = 15.7 Hz, H-C(4”)].

 

 

 

 

Quantitative Analysis of 
O-Caffeoyl Quinic Acids 1-3 and O-Caffeoyl-Quinides 4-8. 

 

• 표준 커피 음료의 분취물들(10 μL)을 
  페닐헥실 루나(Phenyl-hexyl Luna), 250 mm × 4.6 mm(내경), 5 μm 컬럼 (Phenomenex)을 이용하여
  HPLC-UV/vis 분석하였다.
• 이때 메탄올(solvent A)의 gradient를 사용했고, 그리고
  포름산 암모늄 수용액 buffer (0.25 mol/L, pH 3.5, solvent B)을 이동상(mobile phase)으로 사용했다.
  
• Chromatography는 
  Solvent A 25% 농도로 시작하여, 0.8 mL/min의 유속으로 진행하였고, 
  이후 solvent A의 함량을 38분 이내에 28%까지 증가시킨 후, 
  6.5분 이내에 100%까지 증가시키고, 
  마지막으로 용매 A 100% 농도를 5분 더 유지하였다.
• 레퍼런스 화합물들에 대해 얻어진 데이터와
  분석물들의 크로마토그래픽 데이터 (retention time) 및
  스펙트로스코픽 데이터 (UV/vis and LC-MS/MS)를 비교하여,
• 3-O-caffeoyl quinic acid (1),
  5-O-caffeoyl quinic acid (2),
  4-O-caffeoyl quinic acid (3),
  5-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (4),
  3-O-caffeoyl-γ-quinide (5),
  4-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (6),
  5-O-caffeoyl-epi-δ-quinide (7), and
  4-O-caffeoyl-γ-quinide (8)를 식별한 후에, 
• 324 nm에서 얻어진 피크 에리어와 
  메탄올/물 혼합물 (pH 3.5) 내의 5-O-caffeoyl quinic acid 1/1 (v/v) 정의된 스탠다드 용액들의 것들을 비교하여,
  정량화가 수행되었다.

 

Quantitative Analysis of O-Dicaffeoyl-Quinides 9~11.

 

• 스탠다드 커피 음료의 분취물들(aliquots) (10 μL)의 분석은 다음 방법들을 사용해서 이뤄졌다. 
  LC-MS/ MS 
  ⇒ RP-18 Synergi Fusion에서 negative ionization mode로 작동.
  ⇒ 컬럼 = 150 mm × 2.0 mm (inside diameter), 5 μm column (Phenomenex) 
  ⇒ gradient = 메탄올 (solvent A)와 0.1% 포름산 수용액 (solvent B), 유속 = 0.25 mL/min.
• 우리는 solvent A의 함량을 15분 동안 40%에서 60%까지 증가시키고,
  그 다음에 25분 내에 solvent A 함량은 100%까지 증가시킨 후,
  마지막으로 추가 5분 동안 100% solvent A를 유지하여 크로마토그래피를 수행했다. 
• 3,4-O-dicaffeoyl-γ-quinide (9),
  4,5-O-dicaffeoyl-muco-γ- quinide (10), and
  3,5-O-dicaffeoyl-epi-δ-quinide (11)의 식별을,
  이 물질들의 크로마토그래픽 데이터 (retention time)와 스펙트로스코픽 (LC-MS/MS) 데이터와 
  메탄올과 0.1% 포름산 수용액의 혼합물 (1/1, v/v)에 용해된 
  합성 3,4-dicaffeoyl-γ-quinide의 규정된 스탠다드 용액들의 데이터와 비교하여 수행하였다. 
  
• multiple-reaction monitoring (MRM) mode를 사용하여, 
  타겟 퀴니드들 9 (m/z 497.0 → 335.0), 10 (m/z 497.0 → 335.0), and 11 (m/z 497.0 → 335.0)이
  괄호들에 주어진 mass transitions를 사용하여 분석되었다 (Figure 3).  

 

 

 

Quantitative Analysis of 4-Vinylcatechol  Oligomers.

 

• 표준 커피 음료의 분취물들(Aliquots) (900 μL)을 
  ⇒ 염산(hydrochloric acid) (50 μL)을 이용해 pH 2로 산성화한 다음, 
  ⇒ 내부 표준인 레스베라트롤(resveratrol) (50 μL, 2.5 μg/mL) 용액과 함께
       1/1(v/v) 메탄올/물 혼합물(pH 3.5)에 섞었다 (spiked).
• 그 샘플들의 균질화 후에, 분취물들 (20 μL)이 다음 방법에 의해 분석되었다.
• HPLC-MS/MS 
  ⇒ Zorbax Eclipse XDB C18 컬럼, negative ionization mode로 작동 ,
      150 mm × 2.1 mm (inside diameter), 5 μm column (Agilent, Waldbronn, Germany) 
  ⇒ 다음과 같은 괄호들 속에 주어진 mass transitions로 MRM mode를 사용하여 분석. 
  ⇒ resveratrol (m/z 227.0 → 143.1), 
      12 (m/z 271.0 → 109.0), 13 (m/z 271.0 → 109.0), 14 (m/z 271.1 → 109.0),
      15 (m/z 273.2 → 109.0), 16 (m/z 271.1 → 109.1), 17 (m/z 271.1 → 109.1),
      18 (m/z 407.1 → 297.2), 19 (m/z 407.1 → 297.2), and 20 (m/z 407.2 → 161.2). 

Zorbax Eclipse XDB C18

• Chromatography는 다음과 같은 gradient로 수행. 
  ⇒ acetonitrile (solvent A) 그리고 0.1% 포름산 수용액 (solvent B), flow rate는 0.25 mL/min.
  ⇒ 솔벤트 A 25%로 시작하여, 
      5분 내에 솔벤트 A의 함량을 28%로 올리고,
      그 다음 20분 내에 30%까지,
      그 다음 5분 내에 100%로 올린 다음,
      마지막으로 추가 2분 동안 100%에서 유지. 
• 타겟 화합물들 12~20이 내부 스탠다드로서 레스베라트롤(resveratrol)을 거쳐 정량화되었음. 
• 개별 4-vinylcatechol oligomers의 농도들은
  ⇒ 분석물 대 내부 스탠다드의 피크 에리어 비율들을
      각 분석물 대 내부 스탠다드의 농도 비율들 (0.3~3)에 대해 plotting을 하여
      선형회귀분석(linear regression)을 사용하여 만든
      보정 곡선(calibration curves)을 사용하여 계산되었음. 

 

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)..

 

• HPLC 장비 (Agilent)의 구성 
  a series HP 1050-type quaternary pump system, 
  an HP 79855 A/B-type autosampler, and 
  a MWD 79854 A-type multiwavelength detector.

 

High-Performance Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry  (HPLC-MS/MS).

 

• The Agilent 1100 Series HPLC system의 구성 : a pump, a degasser, and an autosampler (Agilent) 
• 다음 장비에 연결하여 사용. 
  a 4000 QTrap triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometer
          (Applied Biosystems/MDS Sciex, Darmstadt, Germany) 
  with an electrospray ionization (ESI) device running in negative ionization mode 
  with a spray voltage of -4500 V. 
  Nitrogen ⇒ curtain (20 psi), nebulizer (35 psi), and heater (45 psi) gas로 적용. 
  Detection ⇒ the multiple-reaction monitoring (MRM) mode로 수행되었음,
• negative pseudomolecular ion [M-H]- 로부터
  collision-induced dissociation 후에 생성된 main fragment로의 transition을 기록. 
• The quadrupoles ⇒ unit mass resolution에서 작동.  
• 소프트웨어 Sciex Analyst (version 1.4.1) ⇒ 장비 컨트롤 및 데이터 분석을 위해 사용. 

Agilent 1100 Series HPLC system connected with AB MDS Sciex 4000 QTrap

 

 

Sensory Analyses..

 

General Conditions and Panel Training. 

• 12명의 평가자들 (남성 5인, 여성 7인, 22~40세), 본 연구의 센서리 테스트 참가 동의를 받음.
• 알려진 미각 장애 병력은 없었음.
• 적어도 2년 동안 앞서 설명된 바와 같이 [18-21] 주단위의 트레이닝 세션들에서 훈련 받았고,
  따라서 적용되는 이 테크닉에 친숙했음. 
• 센서리 분석들은 22℃에서 공조시설이 설치된 분리된 부쓰들이 있는 룸에서 수행되었고,
  3회의 독립적 세션들로 이뤄졌다. 
• 후각 반응들과의 교차-모달 상호작용을 방지하기 위해, 패널리리스트들은 코 클립을 사용했다. 
  
  

Bitter Taste Analysis. 

• 갓 마련된 커피 음료들이 센서리 분석을 위해 사용되었다.
• 센서리 패널리스트들에게 샘플들(5 mL)을 제시하여,
  0 (not detectable)에서부터 10.0 (strong taste impression)까지의 스케일 상에서
     ┌ bitter taste intensity
     └ bitter quality를 채점해달라고 요청하였다

 

 

 RESULTS AND DISCUSSION

• 최근 탐구들이
  monocaffeoyl quinic acid lactones 4-8 (Figure 1),
  dicaffeoyl quinic acid lactones 9-11,
  4-vinylcatechol dimers 12-17, 그리고
  4-vinylcatechol trimers 18-20의 발견으로 이끌었고, 
• 이들은 모두 배전 커피의 강렬한 쓴 화합물들로서 [9, 10], 
  5-O-caffeoyl quinic acid (2)의 열 분해 중에 생성된다. 
• 로스트 커피에서의 Bitter taste 발현 뿐만 아니라 
  이 bitter compounds의 생성에 대한 로스팅 파라미터들의 영향을 탐구하기 위해서,
  coffee brews의 bitter tastants 4-20 뿐만 아니라
  그들의 parent monocaffeoyl quinic acids 1-3에 대한 정량적 분석을 위해 분석 절차들이 개발되었다. 

 

 

Quantitative Analysis of Compounds 1-20 in Coffee Brew.

 

• monocaffeoyl quinic acids (1-3)와 monocaffeoyl quinides (4-8)에 대한 정량적 분석을 위해,
  갓 분쇄된 배전커피의 샘플들을 뜨거운 물로 퍼콜레이팅함으로써 마련된 coffee brews가
  고정상(stationary phase)으로서 Phenylhexyl material를 사용하여
  HPLC-UV/vis에 의해 직접적으로 분석되었다.
• 예비 연구들이
  ┌ monocaffeoyl quinic acids와 
  └ corresponding quinides의 경우에 동일한 소멸계수를 보였기 떄문에
  ⇒ 5-O-caffeoyl quinic acid가 compounds 1-8의 정량화를 위한 외부적 스탠다드로서 사용되었다. 
  
  
• Coffee brew 내의 Dicaffeoyl-quinides
  ┌ 3,4-O-dicaffeoyl-γ-quinide (9),
  ├ 4,5-O-dicaffeoyl-muco-γ-quinide (10), and
  └ 3,5-O-dicaffeoyl-epi-δ-quinide (11)에 대한 분석이 
  ⇒ RP18-HPLC-MS/MS running in the multiple-reaction monitoring (MRM) mode에 의해서
      성공적으로 이뤄졌다 (Figure 3). 
  

 

• bitter compounds 9-11의 정량적 결정은
  ┌ corresponding mass transition의 trace의 경우에 얻어진 peak area와
  └ Figure 2에서 주어진 multistep synthesis에서 quinic acid와 caffeic acid로부터 마련된
       purified 3,4-O-dicaffeoyl-γ-quinide의 정의된 스탠다드 용액들의 그것들과
       비교함으로써 수행되었다. 
  
• 예비 스터디들이
  4-vinylcatechol oligomers 12-20가
  coffee beverages의 pH value (pH 4.9-6.5)에서 다소 불안정하고
                                더 산성인 조건들에서 비교적 안정적이라는 것을 보였기 때문에
  ⇒ 갓 마련된 coffee brews의 앨리퀏들이
  ⇒ 염산수(aqueous hydrochloric acid)로 pH 2.0까지 산성화되었고
  ⇒ 그 다음에 4-vinylcatechol oligomers 12-20의 mass transitions에 대한 모니터링을 위해
      RP18-HPLC-MS/MS system로 직접 주입되었다 (Figure 4).
• 정량적 분석을 위해,
  타겟 분석물질과 유사한 안정성 및 이온화 행태를 보이는 레스베라톨(resveratrol)이
  internal standard로 사용되었다. 

 

Influence of the Roast Gas Temperature on
the Bitterness and Concentration of 1-20 in Coffee Brew.

 

• 커피 콩 로스팅 동안의 쓴맛 화합물의 형성에 대한 로스트 가스 온도의 영향을 탐구하기 위해,
  coffee brews가 190-280 ℃에서 240 s의 일정한 시간 동안 로스트 된 분쇄 커피 콩들로부터 신선하게 마련되었다. 
• 먼저, 훈련된 센서리 패널에 의하여 이 커피 음료들의 쓴맛 강도가
  0 (not detectable) 부터 10 (intense bitterness) 까지의 스케일에서 관능적으로 평가되었다. 
• 이 스터디들은
  190-210 ℃에서 240 s 동안 로스트 된 커피 샘플들은 어떠한 bitterness도 부여하지 않았음을 보였다 (Table 1). 
• roast gas temperature를 220 ℃에서 280 ℃로 증가하니
  coffee brews의 perceived bitterness가 0.25 → 8.0으로 강한 증가를 유도했다 (Table 1).  

 

 

• 가장 흥미로운 것은, 
  적용되는 roast gas temperature에 따라
  ⇒ taste intensity에서의 증가 뿐만 아니라
  ⇒ quality of the bitter taste에서의 변화도 관찰되었다는 것이다. 
• 240 ℃ 이상의 gas temperature가 커피 로스팅에 적용되었을 때,
  ⇒ 더 마일드하게 로스트 된 커피들의 pleasant, typical coffee-like bitterness이
      특히 혀의 뒷부분과 목에서 지각되는
      harsh, burnt, long-lasting, 그리고 espresso-like bitter taste modality(맛 양상)으로 변했다.  
  
  
• Bitter compounds 중에서 어떤 쓴 화합물들이
  roast gas temperature 증가와 함께 bitter taste profile에서의 변화에 공헌할 수도 있는지를 탐구하기 위해
  우리는 각 커피 샘플로부터 마련된 coffee brews 내의
     ┌ bitter compounds 4-20 뿐만 아니라
     └ parent monocaffeoyl quinic acids (1-3)를
         HPLC-UV/vis (1-8) and HPLC-MS/MS (9-20)에 의해 정량적으로 평가하였다 (Figure 5). 
  
  

 

• 정량적 스터디들의 결과,
• 190 ℃에서 240 s 동안 로스트 된 커피 내의 지배적인 폴리페놀들로서
  ⇒ non-bitter 5-O-caffeoyl quinic acid (1), 그 다음이
  ⇒ 4-O-caffeoyl quinic acid (2)와 
      3-O-caffeoyl quinic acid (3)이 나타났다 (Figure 5A).
  ⇒ 비교해보면, bitter compounds 4-20는 미량만이 검출가능했는데,
      이는 그 커피 샘플 내의 부족한 bitterness라는 것과 잘 맞는 결과였다 (Table 1). 
• Roast gas temperature의 증가는
  monocaffeoyl quinic acids의 rapid degradation을 유도했다 ;
  ⇒ e.g., 190 → 280 ℃로의 증가는
      caffeoyl quinic acids 1-3의 sum의 농도를 2274.8 → 33.0 mg/L of coffee brew로 감소시켰다.
• Monocaffeoyl-quinides 4-8의 농도는
  ⇒ caffeoyl quinic acids의 분해와 병행하여, 로스팅 온도 증가와 함께 증가했고,
       240℃에서 maximum을 거쳤다 :
  ⇒ e.g., bitter monocaffeoyl-quinides 4-8의 total amount는
      roast gas temperature가 190 → 240 ℃로 증가했을 때 17.5 → 174.5 mg/L로 10배 증가했다.  
• Monocaffeoyl-quinides 중에서
  3-O-caffeoyl-γ-quinide (5)와
  4-O-caffeoyl-γ-quinide (8)이 양적으로 지배하는 isomers인 것으로 발견된 반면에,  
  5-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (4),
  4-O-caffeoyl-muco-γ-quinide (6), and
  5-O-caffeoyl-epi-δ-quinide (7)의 레벨은 상당히 더 낮았다 (Figure 5B). 
• non-bitter monocaffeoyl quinic acids (1-3)에서
  pleasant, coffee-specific bitter profile을 부여하는
  monocaffeoyl-quinides로의 변환도 [9,10]
  ⇒ 220-240 ℃에서 240 s 동안 로스트 된 커피 샘플들의
      mild and pleasant bitterness의 증가와 일치적이다 (Table 1). 
  
• 240 → 280 ℃로의 roast gas temperature의 추가적인 증가는
  ⇒ monocaffeoyl-quinide 함량의 감소를 유도했다 ;
  ⇒ e.g., 280 ℃에서의 로스팅은 190 ℃에서 만들어진 량에 비해
              다소 낮은 레벨에서 quinides 4-8를 생성했다. 
• 이 데이터는
  ⇒ pleasant bitter-tasting monocaffeoyl-quinides의
      thermal instability를 분명하게 보여주는 것이다. 
  
  
• dicaffeoyl quinic acid lactones
  ┌ 3,4-O-dicaffeoyl-γ-quinide (9),
  ├ 4,5-O-dicaffeoyl-muco-γ-quinide (10), and 
  └ 3,5-O-dicaffeoyl-epi-δ-quinide (11)의 concentration curve의 정량화는
    ⇒ monocaffeoyl-quinides 4-8의 경우에 발견된 것과
        다소 유사한 temperature dependency를 나타냈다 (Figure 5C). 
• 3,4-O-dicaffeoyl-γ-quinide (9)는
  dicaffeoyl-quinides의 total amounts의 80% 이상을 차지하는 main isomer인 것으로 발견되었다. 
  ⇒ 190 ℃에서는, 단 3.2 mg/L의 total amount만이 dicaffeoyl-quinides의 경우에 발견되었고,
  ⇒ 230 ℃에서 최대 17.4 mg/L를 달린 후에
  ⇒ bitter compounds 9-11는 다시 분해하기 시작했고
  ⇒ 280 ℃에서 로스팅이 수행되었을 때에는 not detectable 했다. 
  
  
• 4-vinylcatechol oligomers 12-20의 concentrations은 (Figure 5D and Table 1)
  ⇒ caffeoyl-quinides 4-11와 대조적으로,
      더 높은 roast gas temperature와 함께 계속 증가했고
      250 ℃ 이상으로 로스트 된 커피 샘플들의 harsh and espresso-like bitterness 증가와 병행했다. 
• 기대와 같이, compound 14의 concentration은
  ⇒ 250 ℃에서 최대값이 되었다가 그 다음에 다시 감소했는데,
  ⇒ 이는 4-vinylcatechol dimers 12, 13, 16, and 17의 precursor로서 compound 14를 시사하는 것이며
  ⇒ 최근에 보고된 14의 cyclization를 통해
      hydroxylated phenylindanes 12, 13, 16, and 17를 생성하는 것을 보여주는
      형성 경로를 확인해주는 것이다. 
• Derivatives 18-20의 농도들은
  ⇒ 그것들의 detection thresholds에 있었고, 그러므로 정량적으로 결정되지 않았다. 
  ⇒ roast gas temperature 190 → 280 ℃로의 증가는
      4-vinylcatechol oligomers의 total concentration을
      0 → 452.6 μg/L of coffee brew로 증가시켰다. 

 

Influence of the Roasting Time on
the Concentration of Bitter Compounds 1-20 in Coffee Brew.

 

• 두 번째 세트의 실험들에서는, 
• standard coffee brews가
  260 ℃의 일정한 온도에서 60-600 s 동안 로스트 된 10가지 커피 샘플들로부터 마련되었고
  bitter compounds 4-20과
  parent caffeoyl quinic acids 1-3이
  각각 HPLC-UV/vis와 HPLC-MS/MS에 의해서 분석되었다 (Figure 6). 

 

 

• caffeoyl quinic acids 1-3이 
  roasting time이 증가되었을 때 다소 unstable한 것으로 발견되었다 ; e.g.,
  ⇒ 60 → 600 s까지의 로스팅 시간 증가는
      caffeoyl quinic acids의 total amount를 2350.2 →  25.4 mg/L of coffee brew로
      93배만큼 감소시켰다 (Figure 6A).
  ⇒ 240 s 후에는
      이미, 대부분의 caffeoyl quinic acids이 분해되어 359.1 mg/L 만이 그 coffee brew에 존재했다. 
  
  
• bitter-tasting mono- and dicaffeoyl-quinides의 형성은
  ⇒ caffeoyl quinic acids의 함량 감소와 병행하면서, 
       Roasting time이 60 → 180 s로 증가 되었을 때 더 잘 이루어졌다 ; e.g.,
  ⇒ caffeoyl-quinides (4-8)과
      dicaffeoyl-quinides (9-11)의 total amount는 각각 7배와 4배 증가되었다 (Figure 6B,C). 
  
• caffeoyl quinide 농도는
  maximum을 지난 후에, 빠르게 감소되었다 ; e.g.,
  ⇒ 180 → 600 s로의 roasting time의 연장은
     ┌ monocaffeoyl-quinides 농도를 181.5 → 16.9 mg/L로
     └ dicaffeoyl-quinides 농도를 5.69 → 0.10 mg/L로 감소시켰다. 
  
  
• 4-vinylcatechol oligomers의 정량분석 결과
  ⇒ compound 14 농도의 빠른 증가, 240 s 로스팅 후에 70 μg/L의 최대 레벨에 도달 (Figure 6D). 
  ⇒ 비교하면, compounds 12, 13, 16, 17의 형성은 
      260 ℃에서 180 s 이상 동안 로스트 되었을 때 더 잘 형성 ; e.g.,
  ⇒ 이 4-vinylcatechol dimers의 total amount는 600 s 후에 3.5 → 245.3 μg/L로 증가되었다. 
• 이 데이터 역시 key intermediate로서 compound 14를 거치는
                        phenylindanes 12, 13, 16, 17의 제안된 형성 경로와 잘 들어맞는다 [10].  
• compound 15의 농도는,
  ⇒ roasting degree와 독립적으로, 다소 낮았고,
  ⇒ 그 trimers 18-20이 미량으로만 검출되었다 (데이터는 제시하지 않았음.) 
  
  
• 얻어진 데이터는 
  ⇒ 먼저, 커피 내 bitter-tasting compounds의 조성은
       roasting time과 gas temperature에 강하게 종속적라는 것을 분명하게 보이고 있다.
• monocaffeoyl- and dicaffeoyl-quinides
  ⇒ pleasant coffee-typical bitter taste profile을 나타내는 이들은
      slight to medium 배전도에서 더 잘 형성될 수 있는 것으로 발견되었고
      maximum을 거친 후에 다시 분해될 수 있다는 것이 관찰되어 앞선 문헌 결과들을 확인해준다 [12-16].
• 비교하면,
  long lasting and harsh bitter-tasting 4-vinylcatechol oligomers의 형성은
  더 강한 로스팅 조건들에서 더 잘 된다는 것이 발견되었다. 
• bitter tastants (4-17) 그룹 중에서의 분자 변화들은
  ⇒ 상응하는 커피 음료들에 대한 bitter taste quality perceived에 대한 배전도의 영향과
      잘 들어맞는 것으로 보인다 ; e.g.,
  ⇒ slight to medium 로스트 된 커피는 mild, pleasant, and coffee-like bitter quality를 주는 반면
  ⇒ more severe 로스팅은 lingering, harsh bitter beverage를 초래한다는 것이 발견될 수 있었다. 

 

Release of Monocaffeoyl Quinic Acids and Bitter Tastants from Ground Coffee 
during Sequential Hot Water Extraction.

 

• Water percolation 중에 ground coffee로부터의 선정된 맛 화합물들의 발산에 대한 첫 통찰을 얻기 위해
  우리는 갓 분쇄된 커피를 카트리지에 넣고 끓는 물 10 mL로 연속적으로 퍼콜레이팅하여 모델 실험을 수행했다.  
• 각 소획분의 용출물은 ice-cooled volumetric flasks에 수거되어
  HPLC-UV/vis와 HPLC-MS/ MS에 의한
  monocaffeoyl quinic acids 1-3 그리고 bitter compounds 4-17에 대한 정량분석을 위해 사용되었다. 
• 한 추가 실험에서,
  동일한 량의 커피 파우더를 카트리지에 넣고, 단 1회 용리 단계(single elution step)에서
  total amount의 water volume으로 퍼콜레이트하였다. 

 

 

• caffeoyl quinic acids의 정량분석 결과
  ⇒ 첫 30 mL of water 내에서 1-3의 농도의 빠른 감소를 나타냈다 ; e.g.,
  ⇒ 첫 10 mL aliquot 내의 caffeoyl quinic acids의 total amount는 40mg이었고,
      이는 caffeoyl quinic acids 총량의 56%를 차지하며,
  ⇒ 퍼콜레이션에 사용된 두번째 10 mL aliquot 내에서는 18 mg이었다 (Figure 7A).
• 더 나중의 플랙션들은 
  비교적 소량의 caffeoyl quinic acids를 함유했다 ; e.g.,
  ⇒ <1.0 mg의 1-3이 여섯 번째 aliquot (fraction of 51-60 mL)에 존재했는데, 
  ⇒ 이는 hot water percolation에 의해서
      caffeoyl quinic acids가 coffee powder로부터 빠르게 추출되었음을 보여준다.  
  
  
• bitter-tasting monocaffeoyl quinides 4-8의 발산 패턴
• Lactones의 어느 정도 더 약한 polarity 때문에 기대될 수 있는
  caffeoyl quinic acids의 것과 비교할 때
  ⇒ 비록 용리 커브가 약간 더 평평했지만,
  ⇒ 이 패턴은 quinic acids 1-3의 경우에 발견된 것과 다소 유사한 것으로 발견되었다 (Figure 7B). 
• 첫 10 mL volume은 추출된 quinides 4-8의 총량의 37%를 함유했다. 
• 비교하면, dicaffeoyl-quinides의 농도들은 9-11의 총량의 18%만을 차지해,
  ⇒ 극성이 덜한 dicaffeoyl quinic acid lactones가
      coffee powder로부터 다소 느리게 추출되었다는 강한 증거를 제시하는 것이다 (Figure 7C).
• 퍼콜레이션에 사용된 마지막 10 mL volume (91-100 mL) 내의
  dicaffeoyl-quinide 함량은 아직 12 μg이었는데,
  ⇒ 이는 첫 샘플의 농도의 35%에 달하며,
  ⇒ 따라서 분쇄 커피로부터의 이 부류의 bitter lactones의 다소 덜 효과적인 발산을 보여준다. 
  
  
• Harsh bitter-tasting 4-vinylcatechol oligomers 12-17의 quantitative analysis 결과
• Lactones의 그것과 비교할 때 다른 발산 행태를 나타냈다 (Figure 7D).
• 흥미롭게도, 얻어진 플랙션 당 compounds 12-17의 양들은
  ⇒ 퍼콜레이션의 첫 40 mL 내에서는 증가했고,
      31-40 mL의 플랙션에서 2.5 μg라는 maximum에 도달했다. 
  ⇒ 그런 다음, 플랙션 당 4-vinylcatechol oligomer content는 
      다시 퍼콜레이션에 사용된 마지막 10 mL에서는 ∼1.6 μg으로 다시 약간 감소했고,
      여전히 첫 여과물(filtrate)에서 발견된 함량의 95%에 해당했다. 
• 이 데이터는
  ⇒ 4-vinylcatechol derivatives은 lactones에 비교할 때
      coffee powder로부터 다소 느리게 발산되었고, 
      타겟 화합물들의 극성(polarity)에 병행하여 움직이는 것으로 보인다는 것을 분명하게 가리킨다. 

 

 LITERATURE CITED

 

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(18) Toelstede, S.; Hofmann, T. 
        Sensomics mapping and identification of the key bitter metabolites in Gouda cheese.
        J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 2795–2804. 

 

(19) Stark, T.; Bareuther, S.; Hofmann, T. 
       Sensory-guided decomposition of roasted cocoa nibs (Theobroma cacao) and
       structure determination of taste-active polyphenols.
       J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 5407–5418. 

(20) Scharbert, S.; Holzmann, N.; Hofmann, T. 
       Identification of the astringent taste compounds in black tea infusions
       by combining instrumental analysis and human bioresponse.
       J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 3498–3508. 

(21) Glabasnia, A.; Hofmann, T. 
       Sensory-directed identification of taste active ellagitannins
       in American (Quercus alba L.) and European oak wood (Quercus robur L.) and
       quantitative analysis in bourbon whiskey and oak-matured red wines.
       J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 3380–3390.