▣ Taxonomy and History: Hemileia vastatrix Berkeley and Broome (Basidiomycota, Pucciniales)은 1869년에 東아프리카와 실론에서 커피 잎 녹병의 原因菌으로 기술되었고 전세계 모든 커피 栽培地域들로 퍼져왔다. 아시아, 아프리카, 그리고 아메리카에서의 주요 疾病 勃發은 심각한 소출 손실을 유발했고 계속 유발하고 있으며, 아프리카 많은 열대 및 아열대 국가들의 현금 작물인 커피의 가장 중요한 疾病으로 만들고 있다.
▣ Life cycle and Disease symptoms: Hemileia vastatrix는 (유일하지는 않지만) 가장 중요한 接種源으로 夏胞子 라이프 사이클을 가진 半輪生 곰팡이菌 (hemicyclic fungus)이다. 黃白化 斑點 (Chlorotic spots)이 육안으로 보이는 첫 증상이며, 氣孔 위의 分化 (differentiation of suprastomatal), 꽃모양의 오렌지 색의 夏胞子들(uredinia)로 진행한다. 그 질병은 35%까지 소출 손실을 유발할 수 있으며, 다음 해들에 多元力學的 影響(polyetic epidemiological impact)을 미친다.
▣ Disease control: 비록 殺菌劑 使用이 선호되는 즉각적인 防除 措置들 중 하나이지만, 抵抗性 栽培品種들의 使用이 가장 效果的이고 耐久的인 疾病 統制 戰略인 것으로 생각된다. ‘Híbrido de Timor’의 발견이 몇몇 育種 프로그램들에서 사용되어 왔고, 30년 이상 사용되어 옴에 따라, 효과적이고 내구적인 것으로 증명된 抵抗性 源泉들을 제공했다.
▣ Genetic diversity and Molecular pathogenicity: 비록 제한적인 遺傳的 多形性을 나타내지만, H. vastatrix의 매우 큰 게놈 (c. 797 Mbp)은 50가지 이상의 生理學的 菌腫들 가진 큰 病理學的 多樣性을 감추고 있다. 遺傳子 發顯 스터디들이 信號傳達 經路의 活性化와 推定 作動者들(putative effectors)의 生産을 밝혀와 發芽管 段階(germ tube stage)에서 조기에 식물–곰팡이 대화가 시작한다는 것을 제시하며, 그리고 非毒性 遺傳子들(avr genes)의 식별을 위한 단서들을 제공해왔다.
커피는 가장 중요한 농산물로 추정 소매 가치가 700억 달러에 달한다. 이는 60개국 이상의 경제에 매우 중요하며 1억 명이 넘는 사람들의 주요 소득원이다 (Hoffmann, 2014; ICO, 2016). 커피잎녹병(CLR)은 매년 10억~20억 달러의 손실을 일으키며 (McCook, 2006), 전 세계적으로 아라비카 커피(Coffea arabica) 생산을 제한하는 주요 제한요소 중 하나이다.
CLR은 1861년 영국 탐험가가 빅토리아 호수(동아프리카) 근처에서 야생 Coffea 종에 대해 처음 기록되었다.
질병 증상 및 징후에는 잎 아래쪽 표면에 커다란 주황색 포자 덩어리가 생겨 조기 잎이 떨어지게 된다 (Figure 1).
원인 인자는 Hemileia Vastatrix Berkeley and Broome (1869)으로 기술되었다. 첫 번째 보고 직후 이 질병은 사회적, 경제적으로 파괴적인 결과를 가져오면서 실론(스리랑카)의 커피 재배를 휩쓸었다 (Morris, 1880). 이 갑작스럽고 파괴적인 발병 이후, CLR은 식물 병리학 역사상 가장 잘 알려진 질병 중 하나가 되었다.
두 가지 주요 재배 커피종인 C. canephora (로부스타 커피)와 C. arabica는 각각 세계 커피 생산량의 평균 40%와 60%를 차지한다 (ICO, 2016). 아라비카 커피(Coffea arabica)는 에티오피아와 케냐 북부의 상대적으로 건조하고 고지대가 원산지이며 유전자 풀은 다양성이 낮은 것으로 간주된다 (Steiger et al., 2002). 아라비카 커피는 예멘에서 재배되었으며 이후 아시아, 아메리카 및 아프리카의 다른 지역으로 재배가 확산되었다. 작물 재배 중 심각한 유전적 병목 현상으로 인해 작물의 유전적 다양성이 더욱 좁아졌다. 암스테르담 식물원의 커피 나무 하나가 현재 대부분의 커피 품종의 조상 중 하나로 여겨진다.
이러한 유전적 병목 현상은 특히 녹병 반응 특성과 관련이 있는데, 세계에서 가장 건조한 커피 재배 지역인 예멘에서 이 커피를 재배하면 녹병 저항성에 대한 선택 압력이 없기 때문이다 (Rodrigues et al., 1975). 예멘에서 전파된 커피 생식질에는 아마도 녹이 슬지 않았을 것이다. 17세기와 18세기에 아시아와 아메리카의 여러 지역에서 다른 지역과 기후에 대한 추가 선택과 적응은 병원균이 없었지만 그럼에도 불구하고 질병에 유리한 조건에서 일어났다.
Fig. 1 커피잎녹병의 증상과 징후들
(A) 잎 밑면의 黃白化斑點들과 하포자 덩이들
(B) 필드에서 앞쪽에 있는 나무들에서의 이 질병의 결과로 인한 심각한 낙엽 증상과
다른 쪽에 있는 저항성 나무들과 대조적인 모습.
19세기 실론의 전염병은 이러한 유전적, 생물학적, 농업적 상황의 결과였다 (McCook, 2006; McCook and Vandermeer, 2015). 그 이후로 綠病은 전 세계 대부분의 커피 재배 국가로 퍼졌다.
처음에는 1870년부터 1920년까지 인도양 분지와 태평양의 커피 지역을 거쳐 1950년대와 1960년대에 두 번째로 아프리카 대서양 국가에 도달했으며 마지막으로 대륙을 넘어 대서양(Muller, 1971), 아마도 바람의 흐름(Bowden et al., 1971)에 의해 운반되어 1970년대와 1980년대에 중남미 전역으로 퍼졌다.
20세기 후반에 'Hibrido de Timor’ (HDT) 집단의 식별과 특성화는 아메리카 대륙을 포함한 다양한 커피 재배국가에서 녹병 저항성 품종의 출시를 가능하게 하는 육종 프로그램의 기초를 제공했다 (Rodrigues et al., 1975; Silva et al., 2006).
최근 CLR은 여러 농업적, 기후적, 경제적 요인이 융합된 결과, 중앙 아메리카, 콜롬비아, 페루 및 에콰도르 전역에 걸쳐 심각하고 광범위한 전염병으로 인해 악명을 되찾았다 (Avelino et al., 2015; Cressey, 2013; Rozo et al. al., 2012). 수확량 손실은 최대 35%에 이르렀으며 수십만 명의 농민과 노동자의 소득과 생계에 직접적인 영향을 미쳤다.
헤밀레이아 (Hemileia) 屬은
phylum Basidiomycota (擔子菌 門), class Pucciniomycetes (綠菌 綱), order Pucciniales (綠菌 目) (rust fungi)의 멤버이다.
주로 아프리카와 아시아의 열대~아열대 지역에 서식하며 주로 재배되지 않는 Rubiaceae 및 Apocynaceae 식물에서 발생하는 42種으로 구성된다 (Ritschel, 2005). Hemileia vastatrix는 소속 屬의 基準 種이다.
Berkeley and Broome (1869) 그리고 Ward (1889)에 의해 기술된 바와 같이,
▣ H. vastatrix urediniospores (夏胞子)는 크기가 28~36 × 318~28mm로 콩팥 모양(reniform)이다. 夏胞子 壁(urediniospore wall)은 琉璃質 (hyaline)이고 볼록한 면에 강하게 사마귀가 있고(strongly warted), 직선 또는 오목한 면은 매끄러우며, 두께는 1mm이다;
▣ 冬胞子(teliospores)는 球形이고(spherical), 준-구형(subglobose)에서 순무형(napiform)이며, 직경은 20~28mm이다; 冬胞子 壁(teliospore wall)은 투명하고(hyaline) 매끄러우며 두께는 1mm이다.
Hemileia vastatrix는 H. coffeicola와 구별될 수 있는데, 후자는 잎 전체에 흩어져 있는 胞子囊群(sori)를 생성하고 더 적지만 더 큰 가시(spines)를 가진 夏胞子(urediniospores)를 제공하기 때문이다. 두 녹병 모두 C. arabica와 다른 Coffea 種을 숙주로 갖고 있지만, H. coffeicola는 경제적 중요성이 낮고 지리적으로 제한되어 있다 (Ritschel, 2005).
헤밀레이아 屬 (genus Hemileia)은 다른 綠病菌 屬들과 다음과 같은 3가지 형태학적 특징들의 독특한 조합에 의해 구별된다:
▣ 기공 상부의 꽃다발 모양의 胞子囊群들 (suprastomatal bouquet-shaped sori);
▣ 夏胞子(urediniospores)는
卵形(ovoid) 내지 腎腸形(reniform)이며,
배쪽은 매끄러우며(smooth ventral side),
등쪽은 미묘하거나 거칠게 잔가시가 있는 볼록함(echinulated convex dorsal side); 그리고
▣ 각진 구형(angular-globose)에서 매우 불규칙한 冬胞子(teliospores) (Ritschel, 2005).
분자학적 증거에 따르면 Hemileia 屬은 Pucciniales의 보다 기초적인 계통발생 그룹에 속한다 (Aime, 2006; Grasso et al., 2006; McTaggart et al., 2016; Silva et al., 2015a; Wingfield et al., 2004). 헤밀레이이아 (Hemileia)는 아마 가장 오래된 녹병 계통을 대표하며, 지금은 c. 9,100만~9,600만년 前에 분기한 科(family)인 가는혹녹균科 (family Mikronegeriaceae)에 속한다. 이러한 발견들은 조상 녹병들(ancestral rusts)이 계통발생학적 조상 숙주들에 의해 숨겨져 있다는 오래된 개념에 이의를 제기하고, 현존하는 녹병(extant rusts)의 조상이 속씨식물(angiosperms)에서 진화한 열대성 단주기 종(tropical short-cycled species)이었을 수 있다는 견해를 뒷받침한다 (McTaggart et al., 2016).
Hemileia vastatrix는
urediniospores (夏胞子), teliospores (冬胞子) 및 basidiospores (担子胞子, 소생자)를 생성하는
반윤생 곰팡이菌 (hemicyclic fungus)이지만,
pycniospores (柄胞子)및 aeciospores (銹胞子)는 알려져 있지 않다.
Urediniospores와 teliospores는 동일한 胞子嚢群 (sorus)에서 생산되지만 시기는 다르다.
Urediniospores (夏胞子)는 二核性 (dikaryotic)이며 無性生殖 週期 (asexual cycle)를 나타내며, 환경 조건이 좋을 때마다 잎을 다시 감염시킨다.
Teliospores (冬胞子)는 드물게 발생하고 본래의 原地에서(in situ) 發芽하여 4개의 担子胞子(basidiospores)가 형성되는 前菌絲體 (promycelium, 포자가 싹이 트면서 생기는 짧은 균사)를 生成한다 (Chinnappa and Sreenivasan, 1965; Coutinho et al., 1995; Fernandes RC et al.,2009; Rodrigues et al., 1980).
Basidiospores (担子胞子)는 커피를 감염시킬 수 없지만 다른 숙주 식물은 확인되지 않았다 (Kushalappa and Eskes, 1989; Rodrigues et al., 1980).
그러나 몇몇 보고서들에서는 H. vastatrix가 柄胞子 단계(pycnial stage) 및 銹胞子 단계(aecial stage)가 없는 (Hennen and Figueiredo, 1984), 기능적으로 冬胞子(teliospores)로 역할을 하는 夏胞子(urediniospores)를 가진 원시적인 동종기생의 녹병균 (primitive autoecious rust)으로 묘사될 수 있다고 제안된 바 있다 (Carvalho et al., 2011; Rajendren, 1967; Rodrigues et al., 1980). (同種 寄生菌⇒ 한 종류의 기주에서 생활사를 완성할 수 있는 기생균류)
한편 H. vastatrix는 생존에 대한 적응이 대부분 夏胞子 단계(uredinial stage)에서 이루어졌기 때문에, 진화하는 동안 유성 포자(sexual spores)를 생성하는 능력을 상실했을 수 있다.
短世代 녹병균 종들(short-cycled rust species)에서 夏胞子 단계(uredinial stage)의 보편화는 열대지역의 짧은 성장 계절과 이질적인 식생 환경에 대한 적응으로 생각된다 (Berndt, 2012).
Fig. 2 Hemileia vastatrix 感染過程
(A) Urediniospore (u) 夏胞子 주사형 전자현미경 (SEM) 사진.
(B) 커피 잎 밑면 氣孔들 위의 Germ tube 發芽管(gt)과 appressorium 附着器(ap)를 가진
發芽된 夏胞子. 접종 17시간 후 (SEM).
(C) 氣孔 위의 appressorium 附着器(ap)와 penetration hyphae 浸透 菌絲(화살표),
접종 24시간 후, 광학현미경 (LM) 사진.
(D) 氣孔 위의 appressorium 부착기(ap)와, 곁세포 내의 haustorium 吸器(h)가 달린 細胞間 菌絲,
접종 48시간 후, LM.
(E) 表皮細胞와 葉肉細胞(mesophyll cell) 내의 細胞間 菌絲(화살표), 접종 20일 후, LM.
(F) 海綿組織細胞 內의 吸器(h), 접종 20일 후, SEM.
(G) 海綿組織의 細胞間 菌絲(화살표), 접종 20일 후, SEM.
(H)기공을 통해 부케 모양으로 튀어나온 夏胞子 胞子囊群, 접종 21일 후, LM.
(I) 夏胞子 胞子囊群, 접종 21일 후, SEM.
커피 잎에 대한 H. vastatrix 감염의 시작은, 다른 녹병균과 마찬가지로,
▣ 숙주 표면에의 附着(adhesion to the host surface),
▣ 하포자 발아 (urediniospore germination),
▣ 氣孔 위의 附着器 형성 (appressorium formation over stomata),
▣ 침투 (penetration), 그리고
▣ 세포간 및 세포내 집락화 (inter- and intracellular colonization)를 포함한 특정 사건들을 포함한다 (Fig. 2).
기주(숙주)에의 附着(Adhesion to the host)은, 병원체의 성공적인 확립에서의 필수적인 단계인데, 곰팡이 이동 (fungal displacement)을 방지하고, 觸屈性의 반응 (thigmotropic responses)과 관련된 지형학적 신호의 정확한 감지 (correct sensing)와 附着器들(appressoria)의 분화 및 기능에 중요하다 (Braun and Howard, 1994).
H. vastatrix의 경우, 夏胞子 附着(urediniospore adhesion) 및 附着器 分化 (appressoria differentiation)에 에스테라아제 (esterases)의 관여가 식물 내 및 시험관 내에서(in planta and in vitro) 모두 입증되었다 (Azinheira et al., 2007).
Urediniospore germination (夏胞子 發芽)에는 물이 필요하며 약 24℃에서 최적이다.
附着器 形成 (appressorium formation) 후, 그 곰팡이는 氣孔을 통해 宿主에 침투하여, 氣孔下 챔버 (substomatal chamber)로 자라는 浸透 菌絲 (penetration hypha)를 형성한다 (Fig. 2A-C).
이 菌絲는 H. vastatrix의 독특한 특성인 닻(anchor)을 닮은 두 개의 두꺼운 측면 가지(two thick lateral branches)를 만들어낸다. 그 닻의 각 측면 가지는 H. vastatrix의 또 다른 독특한 특징인 氣孔 곁세포 (stomatal subsidiary cells) (Fig. 2D)를 주로 감염시키는 흡기 모세포 (haustorial mother cell, HMC)로 분화되어 흡기(haustorium)를 생성한다.
곰팡이는 계속 자라서 HMC를 포함하여 더 많은 세포 간 균사(intercellular hyphae)를 형성하고, 해면 조직 및 울타리 조직 (spongy and palisade parenchyma)의 세포들과 그리고 심지어 상부 표피(upper epidermis)의 세포들에서, 많은 수의 吸器들 (haustoria)을 형성한다 (Fig. 2E-G). 이 단계에서 황백화 현상(chloroses)을 육안으로 볼 수 있다 (McCain and Hennen, 1984).
菌絲들(Hyphae)은 氣孔下腔 (substomatal cavities)을 침범하여 섞어 짜서(interweave), 최초의 포자낭군(protosori)을 分化시킨다.
감염 후 약 3주가 지나면, 夏胞子 胞子囊群 (urediniosporic sori)이 부케(bouquet) 모양으로 氣孔들을 통해 튀어나온다 (protrude). 이는 이 질병의 전형적인 징후인 오렌지색 膿疱들(pustules, 세균성 융기)로 나타난다 (Fig. 1A, 2H, I).
기공 상부 포자낭군의 형성(formation of suprastomatal sori)이 열대 녹병균들에 국한된 것으로 보이는 특성이며, 많은 녹병균 屬 (rust genera)에서 수렴적으로 진화한 것으로 보인다 (Berndt, 2012).
초미세구조적 스터디들(Ultrastructural studies)에서는 H. vastatrix 하포자의 발아가 하나 또는 두 개의 發芽孔 (germ pores)을 통해 이루어진다는 사실이 밝혀졌다 (Rijo and Sargent, 1983).
발아관 벽(germ tube wall)은 가장 안쪽의 夏胞子 벽층(urediniospore wall layer) 아래에 있는, 발아관 매트릭스(germ pore matrix)에서 분명히 파생된 것으로 보이는 전자 투과성 밴드(electron-lucent band)로 구성된다.
두 개의 핵(two nuclei)과 기타 소기관(organelles)을 포함하는 세포질 내용물이 發芽孔 (germ pore)을 통과한다 (Fig. 3A). 이 단계에서 그 포자는 미토콘드리아(mitochondria) 수의 증가와 소포체 (endoplasmic reticulum, 세포질 網狀構造), 리보솜 (ribosomes), 로마솜 (lomasome, 막상구조물) 및 작은 소낭들(small vesicles)의 생성을 특징으로 하는 높은 대사 활성 (high metabolic activity)을 나타낸다 (Fig. 3B).
β-1,3- Glucans와 chitin이 H. vastatrix 하포자(urediniospores)의 세포벽과 감염구조(infection structures)의 주된 구성요소들이다 (Maxemiuc-Naccache and Dietrich, 1981; Silva et al., 1999). 두 중합체(polymers)들 모두 침입 전 곰팡이 구조들(pre-penetration fungal structures)의 벽에 규칙적으로 잘 분포되어 있다. 그 세포간 균사 (intercellular hyphae) 및 吸器(haustoria)에서는, β-1,3 glucans도 역시 규칙적으로 분포하는 반면, 키틴 (chitin)은 곰팡이 세포벽의 내부 부분에 우선적으로 축적되어, 녹병균의 일반적인 규칙인 숙주 키티나아제의 최종 작용(eventual action of host chitinases)에 덜 노출된다 (Deising et al., 1996; Silva et al., 1999).
초미세구조적 스터디들(Ultrastructural studies)에서는 H. vastatrix 세포간 균사 (intercellular hyphae)와 吸器 (haustoria)는 다른 綠病菌들의 것과 비슷하다는 사실이 밝혀졌다 (Silva et al., 1999에 의해 개정됨). 세포질(cytoplasm)에는 풍부한 小胞體 (endoplasmic reticulum), 가끔 管狀 複合體 (tubular complexes), 미토콘드리아 (mitochondria), 리보솜(ribosomes) 및 脂質 방울들(lipid droplets)이 포함되어 있다. 세포간 균사(Intercellular hyphae)는 숙주 세포벽에 단단히 부착되는 두꺼운 다층 벽(thick multi-layered wall)을 가진 HMCs에서부터 숙주 세포 침투를 시작한다.
Silva et al. (1999)은 H. vastatrix 흡기 형성 동안 식물 세포벽 분해가 다른 세포에 대한 손상을 최소화하면서 숙주 세포 침투 부위로 제한된다는 것을 관찰했다. 이는 살아있는 宿主 細胞에 의존하기 때문에 생물영양 기생곰팡이(biotrophic fungi)의 공통 목표이다 (Mendgen and Hahn, 2002; Schulze-Lefert and Panstruga, 2003).
吸器 (haustorium)는 二電子-不透過性 밴드(two electron-opaque bands)가 있는 링(ring)을 나타내는 목(neck)과 몸체(body)로 구성된다. 식물 세포 깊숙이 까지 도달하면, 그 전체 구조는 새로 합성되고 고도로 변형된 식물 형질막 (plant plasmalemma)으로 둘러싸여 있으며, 이를 外膜(extrahaustorial membrane)이라고 칭한다. 따라서 吸器(Haustoria)는 실제로 세포 내(intracellular)가 아니다. 실제로, 宿主 原形質膜(host plasma membranes)과 그 병원체 사이의 분리 구역(zone of separation)이 확립되어 있으며, 吸器 細胞壁(haustorial cell wall)과 吸器 外 基質(extrahaustorial matrix)로 구성된다 (Harder and Chong, 1991; Mendgen and Voegele, 2005).
다른 生物營養 寄生體들(biotrophs)과 마찬가지로 H. vastatrix는 숙주 세포와의 인터페이스를 통해 긴밀하게 상호작용하여 필요에 따라 代謝 過程을 수정한다. 이러한 相互作用 方式은 이펙터 유발 취약성(effector-triggered susceptibility)으로 알려진 이펙터 단백질(effector proteins)에 의한 숙주 免疫體系(host immune system)의 효과적인 억제를 포함한다 (Doehlemann and Hemetsberger, 2013; Hok et al., 2010).
H. vastatrix에 취약한 커피 나무에서는 감염 과정의 초기 단계 동안 커피 잎의 아포플라스틱 유체(apoplastic fluid)에 구성적으로 존재하는 가수분해효소(hydrolases) (sugar 및 peptides)와 산화효소(oxidases)의 풍부함이 감소하는 것이 관찰되었다 (Guerra-Guimarães et al., 2014, 2015).
그러나 후기 단계에서는,
⊙ 페닐알라닌 암모니아 분해효소(phenylalanine ammonia lyase),
⊙ 페록시다아제(peroxidase),
⊙ 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase),
⊙ 키티나아제(chitinase),
⊙ 발병-관련 유전자1 (Pathogenesis-Related gene, PR1),
⊙ thaumatin-like, NtPRp27 단백질 및
⊙ β-1,3-glucanase와 같은
방어 관련 단백질의 풍부성 증가가 검출되었다 (Guerra-Guimarães et al., 2009a,b; Silva et al., 2002, 2008).
또한, 孔邊細胞(guard cells) 및 곁세포(subsidiary cells)의 과민성 세포 사멸(hypersensitive cell death) (과민성 반응 hypersensitive response, HR)과 일부 흡기들의 포위(encasement of some haustoria)도 관찰되었지만, 감염 부위의 퍼센트는 낮았다. 그럼에도 불구하고 이런 식물 방어반응은 곰팡이 성장과 포자 형성을 효율적으로 방지하기에는 너무 늦게 발생한다 (Silva et al., 1999, 2002, 2006).
CLR 감염은 숙주 식물을 거의 죽이지 않지만, 심각한 감염은 榮養 發育(vegetative development)을 방해하고 연속적인 계절에 걸쳐 다발성 전염병(polyetic epidemics)을 일으킬 수 있기 때문에 다음 해의 소출에 영향을 미친다. 기후(고도 효과 포함), 그늘, 토양 비옥도 및 캐노피 구조는 질병 심각도(disease severity)에 영향을 미친다. 전염병과 모델링에 대한 풍부한 지식이 축적되었음에도 불구하고 질병 관리 전략은 여전히 효과적이지 못한 경우가 많다. 이러한 격차는 매우 많은 수의 환경 변수, 특정 순간의 상호작용 및 시간 경과에 따른 누적효과로 설명될 수 있다 (Avelino et al., 2004). 커피 가격의 변동은 농작물 관리에 관한 생산자의 결정에 영향을 미치며, 이는 결국 녹병 발병률과 심각도를 결정한다. 이러한 과정은 가격 및 재배 할당량의 자유화, 연구 지원 및 농업 확장의 급격한 감소로 인해 최근 수십 년 동안 더욱 심각해진 것 같다 (McCook and Vandermeer, 2015).
농업 집약화와 질병 심각도 사이의 직접적인 연관성이 Ceylon epidemic 동안 보고되었다 (Ward, 1882). 그 이후로 역학은 여러 가지 분석도구를 얻었으며, 로컬 수준, 국가 수준, 그리고 지역 수준의 다변량 연구는 질병 결과에서 관련 변수의 역할을 더 잘 이해하는 데 기여했다. 일반적으로 CLR epidemic의 피크는 과실 수확 중에 발생한다; 따라서 1차 소출 손실은 중요성이 낮은 경우가 많다. 이전의 전염병 유행에 의해 유발되는 영양성장 감소로 결과로서 낮은 소출로 인해 발생하는 2차 손실은 1차 손실보다 더 중요한 경향이 있다 (Avelino et al., 1991). 농생태학적 변수들에 따른 녹병 전염병 유행 모델링을 통해, shade, canopy density, 그리고 soil fertility를 포함한 로컬 농경적 요인들(local agronomic factors)이, 강수량 rainfall과 같은 지역의 환경적 요인들과 상호 작용하면서 관련적이라는 것이 밝혀졌다 (Avelino et al., 2006; Boudrot et al., 2016).
글로벌 수준에서, 기후변화 시나리오도 CLR의 맥락에서 분석되었는데, 더 짧은 잠복기(shorter incubation periods)가 예측되고 (Ghini et al., 2011) 질병에 유리한 시나리오가 매핑 되었다 (Alves et al., 2011). 실제로 이 질병은 최근 몇 년 동안 더 높은 고도에서 보고되는 일이 증가하는 편이다 (Boudrot et al., 2016; Rozo et al., 2012).
녹병 저항성을 위한 커피 나무의 육종(breeding of coffee plants for resistance)은 환경적으로나 경제적으로나 최고의 질병 관리 전략으로 간주된다 (Silva et al., 2006). 저항성 생식질(resistant germplasm)을 선발하기 위한 첫 번째 효과적인 노력은 1911년 인도에서 수행되었으며, 이로 인해 취약성 품종 'Coorg'를 대체한 품종 'Kent's'가 출시되었다 (Rodrigues et al., 1975 개정). 이후 에티오피아에 대한 여러 임무가 수행되었지만 효과적인 저항 원인은 확인되지 않았다 (Rodrigues et al., 1975).
1950년대에 아메리카 대륙에 녹병이 유입될 가능성에 대한 우려로 인해 (Wellman, 1953), F. Wellman & W. Cowgill은 동반구에서 필드 미션을 수행하여 아메리카 대륙에 새로 발견된 100종 이상의 커피 유형을 수집했다. Branquinho d'Oliveira와 협력하면서, 이 연구자들의 작업은 미국과 포르투갈 정부가 포르투갈에 Coffee Rusts Research Center (CIFC, Centro de Investigação das Ferrugens do Cafeeiro) 설립을 위한 재정적 지원을 제공하도록 했고, 이 연구소는 커피 재배지역들과 멀리 떨어져 있기 때문에 국제 수준에서 CLR에 대한 연구를 중앙집중화했다.
1955년부터 CIFC는 커피와 녹병의 생식질을 접수 및 특성 분석했으며, 특성 분석된 저항성 원천들을 갖춘 커피연구기관에 육종 프로그램과 함께 과학적, 기술적 정보 및 교육을 제공했다. CIFC에서 수행된 연구의 첫 번째 실제 결과 중 하나는 당시 아메리카에서 재배된 모든 품종('Typica', 'Caturra', 'Mundo Novo' 및 'Bourbon' 포함)이 이 질병에 취약하다는 사실이었다 (Rodrigues et al., 1975). 커피 재배지역 외의 CLR에 대한 조사를 통해 CIFC는 전 세계 협력기관으로부터 식물 및 곰팡이 물질을 받을 수 있었고, 결과적으로 커피 재배국가의 육종가들은 그런 나라들에는 없었던 종들(races)에 그들의 유전자형들을 저항성을 위한 특징 분석을 할 수 있게 되었다.
HDT (Híbrido de Timor) 개체군은
'Typica' 커피 작물 중 녹병에 대한 저항성을 보이는 1927년 티모르 섬에서 발견된 나무에서 유래되었다 (Bettencourt, 1981). 1950년대에 이들 개체군은 C. arabica와 C. canephora 사이의 자연 잡종으로 나타났으며, 대부분은 당시 알려진 모든 녹병종에 저항성을 나타냈다 (Rodrigues et al., 1975). 1960년 CIFC는 HDT에서 주요 아라비카 품종으로 저항성을 이전하는 것을 목표로 육종 프로그램을 시작했다. 알려진 모든 품종에 저항성이 있는 일부 선발된 F1 및 F2 나무들은 이러한 물질을 요청한 커피 재배국가들의 모든 기관에 무료로 공급되었다.
CIFC에서 합성된 하이브리드들 Caturra 3 HDT CIFC832/1 그리고 Villa Sarchi 3 HDT CIFC832/2는 각각 Catimor 및 Sarchimor 개체군을 발생시켰다. 이들 개체군들은 물론, 콜롬비아(Caturra × HDT CIFC1343)와 브라질 (Catuaí × HDT CIFC2570)에서 개발된 다른 개체군들이 현재 재배되는 녹병 저항성 품종들 대부분의 원천이다.
이들 집단은 HDT에 대한 저항성과 상업용 품종의 우수한 농경학적 특성을 결합하여 (Bettencourt and Rodrigues, 1988; Rodrigues et al., 1975) 순수 아라비카 유전자형에서 얻은 것과 유사한 수준의 음료 품질을 얻는다 (Bertrand et al., 2003; van der Vossen, 2003). 지역 농생태학적 조건에 적합한 HDT 유래 유전자형의 선택과 후속 품종 출시가 다음과 같은 여러 기관에서 수행되었다.
▣ 브라질의
Universidade Federal de Viçosa (UFV) 비코사 연방대학교,
Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (EPAMIG) 미나스 제라이스 농업연구기업,
Instituto Agronômico de Campinas (IAC) 캄피나스 농업연구소,
Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) 파라나 농업연구소,
Fundação Procafé/Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA)
프로카페재단/브라질농업연구기업;
▣ 콜롬비아의 Centro Nacional de Investigaciones de Café (CENICAFE) 국립커피연구소;
▣ 코스타리카의
Centro Agronómico Tropical de Investigación y Ensõnanza (CATIE) 열대농업교육훈련센터,
Instituto del Café de Costa Rica (ICAFE) 코스타리카 커피 연구소 ;
▣ 과테말라의 Asociación Nacional del Café (ANACAFÉ) 전국커피협회 ;
▣ 엘살바도르의 Instituto Salvadoreño de Investigaciones del Café (ISIC) 엘살바도르커피 연구소;
▣ 온두라스의 Instituto Hondureño del Café (IHCAFE) 온두라스 커피연구소 ;
▣ 멕시코의 Instituto Mexicano del Café 멕시코 커피연구소 ;
▣ 미국 하와이에 있는 the Hawaii Agriculture Research Center (HARC) 하와이 농업 연구 센터;
▣ 케냐의 the Coffee Research Foundation (CRF) 커피연구재단 ;
▣ 탄자니아의 the Tanzania Coffee Research Institute (TaCRI) 탄자니아 커피 연구소 ;
▣ 인도 the Central Coffee Research Institute (CCRI) 중앙커피연구소 ; 그리고
▣ 중국 the Dehong Tropical Agriculture Research Institute of Yunnan (DTARI)
윈난성 德洪熱帶農業硏究所.
HDT 집단의 녹병 저항성은 아라비카 저항성 유전자(SH1, SH2, SH4 및 SH5) 외에도, SH6, SH7, SH8, SH9 그리고 아직 확인되지 않은 기타 유전자들과 같은 로부스타-유래 유전자들에 의해 부여된다. 이 유전자들은 SH3 (C. liberica에서 유래)와 함께, Flor’s gene-to-gene theory (Flor의 유전자 대 유전자 이론) (Noronha-Wagner and Bettencourt, 1967)에 따라 녹병에 대한 커피 반응을 조절하여, 알려진 모든 녹병 균종들에 대해 저항적인 것부터 거의 모든 알려진 균종들에 취약한 것까지, 유전자형을 생리학적 그룹까지 분류할 수 있게 해준다 (Bettencourt and Rodrigues, 1988; Várzea et al., 1989; CIFC 기록). 저항성 공여자로서 HDT 개체군의 유용성은 하향식 마커-활용 선발 접근법(downstream marker-assisted selection approaches)을 사용하여 목표로 하는 저항성 유전자에 연결된 마커를 식별하려는 여러 연구로 이어졌다 (Brito et al., 2010; Diola et al., 2011; Romero et al., 2014).
저항성 원천으로서 HDT 집단의 중요성은 어떤 경우에는 30년 이상 사용되어 온 이러한 저항성 요인 중 일부의 긴 내구성에 달려 있다. 예를 들어, 유전자형 HDT CIFC832/2는 다른 유전자형에 비해 추가적인 게놈 유전자 이입 (genome introgressions)을 갖고 (Herrera et al., 2014), 흡기 전 저항성(pre-haustorial resistance) (비숙주 같이)을 나타낸다 (Diniz et al., 2012). 실제로, 吸器 後 抵抗反應(post-haustorial resistance response)은 일반적으로 대부분의 coffee-H.vastatrix 상호작용에서 발견된다 (Silva et al. 2002, 2006).
CLR에 대한 커피 저항성의 세포학적, 생화학적 측면들이 Silva et al. (2006)에 의해 개정되었고, Diniz et al. (2012)에 의해 다뤄졌다. 간단히 말해서, 흡기-전 저항과 흡기-후 저항은 모두 HR 그리고 receptor-like kinases, WRKY transcription factors, glycosyltransferases, lipoxygenases 그리고 PRs를 포함한 여러 유전자들의 활성화와 연관되어 있다 (Cacas et al., 2011; Diniz et al., 2012; Diola et al., 2013; Fernandez et al., 2004; Ganesh et al., 2006; Guzzo et al., 2009; Ramiro et al., 2010; Silva et al., 2006).
여러 HDT-유래 유전자형들에서의 저항성이 사라지면서 (Diniz et al., 2012), 새로운 저항성의 원천들이 조사되고 있다.
C. canephora에서 발견된 충분한 저항성과 HDT의 성공적인 역사를 고려할 때, 아라비카 커피에 대한 새로운 저항성 원천들을 식별하기 위한 한 가지 매력적인 접근법은 C. arabica × C. canephora 교배를 수행하는 것이다. 이러한 연구는 새로운 저항 원천들을 찾을 가망이 있다 (Caicedo et al., 2013; Herrera et al., 2009; Mahe et al., 2007; Romero et al., 2010).
인도에서 가장 대중적인 아라비카 유전자형들 (S.795) 중 하나를 육종하기 위해, Prakash et al. (2011)은 SH3 유전자와 밀접하게 연결된 두 개의 SCAR 마커를 개발했다. 이는 C. liberica로부터 C. arabica로 자연적으로 이입된 매우 효과적인 녹병 저항성 유전자이다 (Prakash et al., 2004). 부분적이고 비-특이적인 다원유전자성 저항성(Partial and non-specific polygenic resistances)이 C. canephora, 일부 C. arabica 유전자형, 그리고 일부 種間雜種(interspecific hybrids)에서 입증되었다 (Silva et al., 2006에 의해서 개정된 바와 같이). 이는 SH 유전자 외에도, 다른 주요 유전자들과 마이너 유전자들이 coffee-rust 상호작용을 조절할 수 있다는 이전 보고서를 뒷받침한다 (Bettencourt and Rodrigues, 1988). 그러나 이러한 연구는 적절한 농경학적 특성과 품질 특성을 갖춘 엘리트 계통에 저항성 인자를 도입하기 위해 힘들고 시간이 많이 걸리는 다운스트림 육종 노력이 필요하기 때문에 방해를 받는다.
야생 C. arabica 개체군에서 저항성을 확인하는 것은 다른 Coffea 種의 바람직하지 않은 특성을 제거하기 위한 육종을 하지 않아도 되기에 흥미로울 것이다. 그러나 야생 C. arabica 생식질 분석은 지금까지 저항성 원천 식별에 대한 근거를 거의 제공하지 못했다. 녹병은 에티오피아의 C. arabica 자생 범위에 걸쳐 포레스트에 있는 나무들에서 자주 발생하기 때문이다 (Samnegard et al., 2014). 다양한 녹병 균종에 대한 야생 생식질의 취약성에 관한 정보는 거의 없으며 (Rodrigues et al., 1975), 야생 개체군 사이의 유전적 다양성이 매우 낮기 때문에 새로운 저항성 원천을 찾는 데 성공할 가능성이 거의 없음을 시사한다 (Davis et al., 2012 ; Steiger et al., 2002).
CLR에 대한 화학적 방제는 저항성 유전자형의 부재와 기타 효과적인 질병 관리 전략이 없는 경우에 확실한 선택이다.
화학적 방제는 경제적 부담 뿐만 아니라 환경적 위험과 사회적 우려(유기농 커피의 가치가 점점 더 높아지고 있음; Iba~nez and Blackman, 2016)를 나타낸다. 예를 들어, 탄자니아에서는 커피 재배 생산비용의 50%가 두 가지 주요 곰팡이 질병인 CLR과 커피베리병의 화학적 방제에 기인할 수 있다 (Kilambo et al., 2013).
예방적 처치는 일반적으로 구리 기반 살균제(copper-based fungicides)를 사용하여 수행되는 반면, 치유적 처치는 전신 살균제 (systemic fungicides) (예: 에폭시코나졸(epoxiconazole), 피라클로스트로빈(pyraclostrobin))를 사용하여 수행된다.
살균제-저항성 녹병 개체군을 선택하는 위험을 피하기 위해, 구리 기반 살균제와 전신 살균제를 병용하거나 교대로 사용하는 것이 좋다 (Zambolim, 2016). 이러한 제품의 적용을 위한 모범 사례에 관한 연구는 농생태계적 변수 및 疫學 (epidemiology)에 따라 현지에서 개발된다 (예: Souza et al., 2011).
건강 및 환경 문제로 인해 효과적인 승인된 살균제의 가용성이 감소함에 따라, 새롭고 효과적이며 지속가능한 질병 통제 솔루션 개발을 위한 연구를 강화할 필요가 있게 되었다.
규산칼륨(potassium silicate)과 精油 (essential oils)의 효과가 최근에 테스트되었지만 성공은 제한적이었다 (각각 Lopes et al., 2013 및 Pereira et al., 2012). 그러나 acibenzolar-S-methyl (Fernandes et al., 2013; Guzzo et al., 2001; Marchi et al., 2002)과 같은 benzothiadiazole (BTH) 그룹의 저항 유도제로 유망한 결과가 얻어졌다. BTH 처리된 커피 잎은 발병 관련 단백질 합성(pathogenesis-related protein synthesis), 산화 파열 (oxidative burst), 그리고 세포벽 강화 (cell wall strengthening)에 관여하는 유전자를 과발현하며, 이는 대사가 관리에서 방어로 일반적으로 전환됨을 시사한다 (Nardi et al., 2006).
CLR 방제를 커피 및 감귤류 산업의 부산물을 기반으로 한 亞燐酸塩 (phosphites)과 식물 포뮬레이션의 효과가 온실 및 현장에서 평가되었다. 일부 제형은 표준 살균제에 비해 중간 내지 우수한 효율성을 보여 커피 녹병 및 기타 질병 관리를 위한 효과적인 대안임이 입증되었다 (Carvalho et al., 2012; Fernandes LHM et al., 2009; Monteiro et al. , 2013; Santos et al., 2007).
Hemileia vastatrix 포자는 Ascomycete 곰팡이 Lecanicillium lecanii에 의해 초기생된다 (hyperparasitized).
CLR을 효과적으로 제어할 수는 없지만, 이 초기생충(hyperparasite)은 포자 생존력과 질병 심각도를 감소시킬 수 있다 (Vandermeer et al., 2010). Lecanicillium lecanii는 주로 그린커피스케일(green coffee scale)인 Coccus viridis의 곤충병원체(entomopathogen)이며, 이는 결국 나무 위에 둥지를 트는 개미(arboreal nesting ant)인 Azteca instabilis와 상호 공생 관계를 가지고 있다.
이들 유기체 사이의 관계는 복잡한 생태적 상호작용이 질병 발생률과 중증도에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사하며, CLR이 때로는 심각한 전염병이고 때로는 골치 아픈 문제이지만 파괴적이지는 않은 이유를 잠재적으로 설명한다 (Vandermeer et al., 2014).
커피 생태계에 존재하는 박테리아와 곰팡이가 H. vastatrix에 대한 잠재적인 생물학적 방제제로서의 용도에 관해 조사된 적이 있다. 두 개의 Fusarium sp. 분리주들과 함께, Pseudomonas putida, Bacillus megaterium, 그리고 Bacillus thuringiensis 박테리아의 특정 균주들이 유망한 수준의 적대감을 제공한다 (Haddad et al., 2009, 2013, 2014; Silva et al., 2012).
CLR의 높은 병원 변이성(pathogenic variability)에 대한 증거는 초기 단계에서 인식되었으며, 저항성 붕괴와 관련이 있었다. 생리학적 특화(Physiological specialization)가 네 가지 녹병균종을 확인한 Mayne (1932, 1942)에 의해 처음으로 기술되었다.
그 이후로 CIFC는 1952년부터 d'Oliveira를 통해 오늘날까지 세계에서 가장 다양한 커피 생산지역의 H. vastatrix 포자 샘플을 기반으로 커피 녹병균종에 대한 세계 조사를 역사적으로 추구하고 확대해 왔다. 규정된 테스트 조건 하에서 다양한 저항성 유전자 조합(격차 differentials)을 갖는 커피 숙주 물질 세트에서 분리주들의 분화를 통해 뚜렷한 균종이나 병원형들(races or pathotypes)이 정기적으로 식별되었다 (d'Oliveira, 1954257).
현재 50개 이상의 녹병균 생리학적 균종들(physiological races)과 23개 이상의 커피 격차들(differentials)이 파악되었다 (Rodrigues et al., 1975; Várzea et al., 2009; and CIFC records).
균종들은 Flor’s gene-to-gene theory에 의해 추론되고, 검출 순서에 따라 순차적인 로마 숫자로 기술되는 구분적이고 독특한 병독성 유전자 조합(combinations of virulence genes)을 가진 분리주들에 기인한다 (Noronha-Wagner and Bettencourt, 1967). 따라서 지금까지 더 이상의 유전적 확인이 가능하지 않았기 때문에, 추정된 녹병 균종 유전자형들은 C. arabica 및 4배체 종간 잡종들(tetraploid interspecific hybrids)에서 파생된 분리주들에서 v1 ~ v9 범위의 독성 유전자(virulence genes)로 구성되는 반면, 2배체(diploid) 커피 종을 공격하는 균종들의 유전자형들은 알려져 있지 않다.
커피 기주 저항성 유전자형들과의 이러한 직접적인 상관관계를 고려할 때, 독성 유전자 v1 ~ v5는 아라비카-타입 기원 ('Geisha'의 v1/SH1 ; 'Kent’s'의 v2/SH2 ; C. liberica introgression의 v3/SH3 ; 'Kaffa'의 v4/SH4 ; 거의 모든 품종의 v5/SH5)으로 거슬러 올라갈 수 있는 반면, v6 ~ v9는 HDT 및 기타 종간 잡종에 존재하는 SH6 ~ SH9 유전자의 추가적인 로부스타 유산을 반영한다.
그러나 특히 HDT 파생물들을 감염시키는 분리균주들의 독성 프로필 특성분석은 이용가능한 커피 격차 유전자형들 (coffee differential genotypes)의 컬렉션이 허용하는데까지만 진행될 수 있으므로, 많은 유전자형들이 불완전하거나 완전히 식별되지 않은 상태로 남는다.
적합도 이점(fitness advantages)을 지닌 병원체 균주의 단기적 선발이 촉진되는, 역동적인 숙주-병원체 공진화의(host–pathogen co-evolutionary) 군비 경쟁에서 추정되는 바와 같이, 독성이 증가된 새로운 병원형이 지속적으로 나타나고 있다. 커피 격차들의 스케일 내에서, race II (v5)가 가장 제한된 감염 스펙트럼을 나타내며, 세계에서 가장 일반적이고 널리 퍼진 녹병 균종으로 간주되며, 아마도 전세계적으로 대부분의 C. arabica 재배품종들의 균일한 유전적 배경의 결과로, 일반적인 발생이 되는 균종일 것이다 (Bettencourt, 1981).
그러나 녹병 균종들의 지리적 분포는 전적으로 지역적에서 재배되는 커피 유전자형에 의존하는 것으로 보이며, 따라서 특정 지역에서 특정 균종의 보급(prevalence)도 그에 따라 발생하는 것으로 보인다 (Bettencourt, 1981). 병원형들의 기원과 분포에 대한 커피 저항성 유전자가 미치는 선택 압력(selection pressure)에 대한 증거는 쉽게 찾을 수 있지만 (Várzea and Marques, 2005), 녹병 균종들이 가장 많이 등록된 곳은 인도이다. 이 나라는 CLR 저항성을 위한 세계에서 가장 오래된 육종 프로그램을 보유하고 있으며, 확대된 병독성 스펙트럼을 갖는 새로운 병원형이 출현하면, 일반적으로, 새롭거나 실험적인 저항성 커피 재료를 현장에 정기적으로 대규모로 도입한다 (Várzea and Marques, 2005). 이 과정을 통해 최근 인도에서 알려진 모든 녹병 균종들에 대해 저항적인 유전자형들에서 CLR의 식별이 초래되었다 (Prakash et al., 2015). 현재, 커피 녹병 독성 프로파일들의 범위는 아마도 지금까지 특성 분석된 균종들의 범위를 훨씬 넘어서는 것일 것이다.
이러한 높은 표현형 다양성(phenotypic diversity)과 분자 다양성(molecular diversity) 사이의 직접적인 연관성은 발견되지 않았다.
H. vastatrix 개체군에서의 변이성을 특성 분석하기 위한 분자 마커들은 파악하기 어려웠다(elusive).
개체군 유전성에 이상적인 단순 서열 반복(Simple sequence repeat, SSR) 마커들은 충분한 분석 해상도를 갖춘 다형성 유전자좌(polymorphic loci)를 제공하지 못했다 (Cristancho and Escobar, 2008; Rozo et al., 2012).
rDNA-ITS region의 염기서열분석(sequencing)도 다수의 복사본 존재 때문에 염기서열 데이터 분석에 적합하지 않았던 반면, 다른 핵 유전자좌(nuclear loci)에서는 변이가 없거나 다형성 부위들(polymorphic sites)이 매우 적게 나타났다 (Batista et al., 2010).
Random amplification of polymorphic DNAs (RAPDs) [다형성 DNAs 무작위 증폭]과 amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) [유전자 증폭 산물 길이 다형성]이 지금까지 문서화된 유일한 정보 마커이며, 이는 유전적 변이가 게놈을 따라 고르지 않게 분포되어 있을 수 있음을 제시한다.
RAPD 마커를 사용하여 Gouveia et al. (2005)은 H. vastatrix 개체군의 전 세계 지리적 범위에서 보통의 유전적 다양성 (moderate genetic diversity)과 높은 유전적 분화 (high genetic differentiation)를 발견했으며, 클론 증식의 징후가 있지만 생리학적 균종, 숙주 또는 지리적 기원과 관련된 개체군 구조에 대한 증거는 없다.
후속된 유전적 다양성 연구는 주로 브라질(Cabral et al., 2016; Maia et al., 2013; Nunes et al., 2009)과 콜롬비아 (Rozo et al., 2012)에 집중되어, 로컬 개체군을 대상으로 이루어졌다. 이들 개체군들은 Gouveia et al. (2005)의 연구에서 유전적 분화 수준이, 아프리카 및 아시아 개체군에 비해 가장 낮은 수준의 분리주들을 나타냈고, 이는 아마도 더 최근의 기원을 제시하는 것이다. 실제로, 남아메리카는 H. vastatrix가 도달한 마지막 대륙이었으며, 아메리카의 분리주(isolates )가 1970년 이후 처음 보고된 브라질에 도입된 몇 가지에서 유래했을 가능성이 있다 (Muller, 1971).
모든 연구들에서 숙주와 지리적 기원을 고려한 H. vastatrix 개체군에서 낮은 분화(low differentiation)와 구조화되지 않은 변이성(unstructured variability)이 지속적으로 보고되고 있으며, 이는 아마도 효과적인 장거리 분산과 숙주 생식질 교환의 결과로, 높은 유전자 흐름(high gene flow)에 의해 뒷받침된다. 더욱이 커피 플랜테이션들의 넓은 연속되는 에리어들은 녹병 유행과 유전자형 분포의 단계적 이동을 촉진한다 (Nunes et al., 2009).
CLR에서 지금까지 발견된 고르게 분할된 유전적 변이의 패턴은 이 곰팡이가 무성생식종(asexual species)으로 오랫동안 인식되어 온 것과 일치한다. 그러나 유전자좌 연결 불균형의 추정(estimation of locus linkage disequilibrium)을 통해 무작위 교배(random mating)의 증거가 발견되었으며 (Cabral et al., 2016; Maia et al., 2013; Nunes et al., 2009), 이는 일종의 재조합 사건(recombination event)을 제시한다. 예를 들어, 체세포 혼성화(somatic hybridization)를 포함한 擬似有性的 현상(parasexual phenomena)이 녹병에 기록되어왔다 (Park and Wellings, 2012). 이와 같이, 이러한 최근 연구에서 제공된 데이터에도 불구하고, H. vastatrix의 개체군 유전적 변이의 메커니즘과 역학은 아직 알려지지 않았다. 이러한 노력은 보다 포괄적인 녹병 샘플링에 대한 차세대 시퀀싱을 사용하여 게놈 규모에서 분자적 개체군 분석의 해상도를 높임으로써 성취에 가까이 가는 중이다 (Silva et al., 2015b).
Rusts는 최근에 곰팡이들 중에서 평균 게놈 크기가 가장 큰 目으로 주목되었다 (Talhinhas et al., 2015; Tavares et al., 2014). 그럼에도 불구하고, H. vastatrix의 c. 800-Mbp genome (Carvalho et al., 2014; Tavares et al., 2014)의 녹병균 중에서 가장 큰 것 중 하나이며 (Ramos et al., 2015; Tavares et al., 2014), 경제적 관련성이 있는 곰팡이 병원체들 중 최대의 게놈이라고 한다.
H. vastatrix의 게놈은 크기도 다양한 것으로 보인다: 서로 다른 균종들을 대표하는 11개의 분리주를 포함하는 예비 연구에서 게놈 크기의 범위는 765~839 Mbp였으며, 전체적 평균 (± 표준 편차)은 797 ± 27 Mbp였다 (CIFC team, 미공개 데이터). 또한, H. vastatrix 核型 (karyotype)에 대한 세포학적 특징에 관한 스터디들이 하포자 발아 (urediniospore germination) 동안 얻은 中期 核 (metaphase nuclei)에 대해 수행되었으며, 10개의 염색체들 (chromosomes)이 밝혀졌다 (Tavares et al., 2013).
생물영양 기생체의 특화와 게놈 사이즈 확장 사이의 연관성이 확립되었다 (Spanu, 2012). Rust 게놈은 비암호화 영역(non-coding regions)으로 광범위하게 분포되어 있는 것으로 알려져 있으며 (예: Duplessis et al., 2011), 이러한 비암호화 영역과 가상적 다배수성 (hypothetical polyploidy)은 H. vastatrix의 방대한 게놈 크기를 설명할 수 있음을 시사한다. 실제로 Cristancho et al. (2014)은 H. vastatrix 조립 게놈(assembled genome)의 74%가 반복 영역 (repetitive regions)을 포함한다고 제시했다.
H. vastatrix에 대한 진행 중인 우리의 게놈 시퀀싱 작업에서 얻은 초안 어셈블리는 예상 게놈 크기의 10% 미만을 차지하지만 Melampsora larici-populina 게놈에서 전체 유전자 수의 약 80%를 나타내는 유전자 세트가 확인되었다 (CIFC team, unpublished data). H. vastatrix의 비정상적으로 큰 게놈 사이즈와 반복 영역을 포함한 풍부한 비암호화 영역은 포화 게놈 시퀀싱을 얻는 데 있어서의 어려움을 설명할 수 있다.
최근 genome sequencing technology의 발전으로 녹병균에 대한 서열 분석이 가능해졌으며, 경제적, 과학적으로 중요한 대규모 게놈을 가진 녹병균의 서열 분석 계획 (예: Phakopsora pachyrhizi and Uromyces fabae; Loehrer et al., 2014 and Link et al., 2014, 각각)이 진행 중이며 가까운 미래에 H. vastatrix의 고품질 게놈 서열을 얻을 수 있는 조건이 충족되고 있음을 시사한다.
H. vastatrix의 게놈이 완전히 밝혀지지는 않았지만, 전사체 접근법(transcriptomic approaches)은 이미 기능적 게놈에 대한 통찰력을 얻는 데 도움이 되었다. 이를 위해 이 병원체의 생물영양성(biotrophic nature) 특성으로 인해 발생하는 어려움을 회피하기 위한 몇 가지 기술 전략이 개발되었다. 이는 곰팡이균 샘플(urediniospores 이외의)이 감염된 잎 샘플에서 숙주와 물리적으로 혼합된다는 것을 의미한다. 여기에는 다음이 포함된다.
- — 곰팡이와 식물 전사체(transcripts)를 구별하기 위해 적용되는 상동성 점수(homology scores)와 코돈 사용 편향(codon usage bias)에 기초한 생물정보적 파이프라인을 사용하는 in silico 어푸로치 (Fernandez et al., 2012)
- — planta에서 분화된 부착기들(appressoria)로부터 양질의 곰팡이 RNA를 분리하기 위해 개발된 프로토콜 (Loureiro et al., 2015)
- — 감염 전반에 걸쳐 planta의 곰팡이 생물량 바이오매스 변이(fungal biomass variation)를 고려하여, 곰팡이 유전자 발현 연구를 위한 reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR, 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응) 준거 유전자(reference genes)를 선택하고 검증하는 방법 (Vieira et al., 2011).
발아하는 urediniospores (하포자), appressoria (附着器) 그리고 in planta haustoria-rich (실제에서 흡기-풍부한) 샘플에 대한 H. vastatrix의 전사체 분석(transcriptomic analysis) (Fernandez et al., 2012; Talhinhas et al., 2014)은 9,234개 전사체의 식별 및 주석(annotation)을 가져왔다 (즉, 서열화된 녹병균 게놈들에서 예측되는 유전자들이 50% 미만). 784개의 시퀀스만이 세 가지 조건들에 의해 공유되었으며, 그리고 75%는 싱글 라이브러리에 고유했다.
데이터베이스 비교를 해보면, 이러한 H. vastatrix 전사체의 절반은 잠재적으로 새롭거나 또는 매우 다양한 유전자들을 나타내는 다른 녹병균의 게놈 데이터 또는 전사체 데이터와 유의한 상동성을 나타내지 않는 것으로 나타났다.
H. vastatrix 전사체의 주석(annotation)과 그리고 세 가지 샘플링 단계 각각에서의 상대적 풍부함의 비교는 특히 활동적인 신진 대사(active metabolism), 변형 활동(translational activity) 및 부착기(appressoria)에서의 새로운 구조 생성, 그리고 강렬한 신호 전달, 수송 및 분비 활동(intense signaling, transport and secretory activity), 그리고 하포자 발아에서의 세포 증식(cellular multiplication)을 제시한다.
Haustoria-rich phase에서는, 결과들은 숙주에서 곰팡이로의 강렬한 신호 전달 그리고 영양분 흡수를 말해준다 (Talhinhas et al., 2014).
추정적 carbohydrate-active enzymes (CAZymes, 탄수화물 활성 효소)를 인코딩하는 148개의 전사체들이 식별되었으며, 이는 포플러(poplar)와 밀(wheat) 줄기 녹병균 곰팡이(stem rust fungi)의 게놈에서 약 CAZyme의 45%를 나타낸다.
이러한 CAZyme 전사체들은 감염 초기 단계에서 더 자주 발현되며, 이는 아마도 용해 메커니즘과 물리적 메커니즘 (lytic and physical mechanisms) 을 결합한 커피 잎 기공의 부착기 매개 침투에 관여함을 시사한다 (Talhinhas et al., 2014).
CAZymes 중에서, 잎 아포플라스트(leaf apoplast)의 세포외 공간(extracellular space)에 존재하는 식물 키틴 수용체 (plant chitin receptors) 및 가수분해효소(hydrolases)에 의한 인식을 피하는 데 잠재적인 역할을 하는 chitin deacetylases 키틴 데아세틸라아제 (CD-As)가 H. vastatrix에서 분석되었다 (Gueddari et al., 2002). 7개의 서로 다른 CD-A-유사 유전자들이 확인되었으며, 계통발생 분석을 통해 CD-As를 두 그룹으로 나누었다. 하나는 H. vastatrix에 특이적이고, 다른 하나는 다른 담자균의 CD-As와 매우 유사한 그룹, 이는 구별되는 생리적 역할들을 제시한다 (Azevedo et al. , 2013).
감염 과정 전반에 걸친 발현 연구에서는 compatible (susceptibility) interaction과 incompatible (resistance) interactions 에서 서로 다른 프로파일들이 나타났으며 (Azevedo et al., 2013), 이전에 U. fabae (Deising and Siegrist, 1995)에서 언급한 바와 같이, 포자 발아 및 부착기 형성과 동시에 일치하는 호환적 상호작용에서 발현의 피크가 나타났다 (Vieira et al., 2012). 516개의 H. vastatrix 유전자들이 분비된 단백질들을 인코딩하는 것으로 추정되는 것으로 식별되었다 (Talhinhas et al., 2014). 이들 예상되는 분비 단백질(secreted proteins)의 최소 50%는 다른 녹병균의 단백질과 상동성이 없으며, 따라서 H. vastatrix에 특이적(specific)일 수 있다. 비록 수는 적지만, 발아하는 하포자(urediniospores) 및 부착기(appressoria) RNA 라이브러리에서 추정 분비 단백질을 인코딩하는 유전자들은 후기 감염 라이브러리(late infection library)에 있는 유전자들보다 더 풍부하게 발현된다.
H. vastatrix secretome (분비물)에 대한 PFAM domains 분석을 통해 121개의 서로 다른 PFAM 도메인을 식별할 수 있었다. PFAM 도메인이 없고 상동성이 없는 전사체들(transcripts)을 새로운 보존 모티프(new conserved motifs) (예: 일 부 공통 기능을 제시하는 특정 포지션들에 있는 특정 단백질 구조; Alfano, 2009; Saunders et al., 2012)의 존재에 대해 추가로 분석하여, 새로운 비독성 단백질들 (avirulence (Avr) proteins)을 확인했다 (Gonc¸alves et al., 2013). 4개의 H. vastatrix 전사체들에서 3개의 위치 모티프(positional motifs)가 확인되었으며, 이는 卵菌(oomycetes)의 RXLR class of effector genes에서 발견된 구조와 유사한 보존된 조직을 나타낸다. 이러한 H. vastatrix 유전자는 비호환적 상호작용 對 호환성 상호작용에서 상향 조절되었으며, 이는 식물 면역 유도에서의 역할이 있음을 제시한다 (Goncälves et al., 2013).
H. vastatrix는 파괴성, 전 세계적인 분포, 커피와 같은 중요한 현금 작물 생산에 미치는 경제적 영향에도 불구하고 다른 녹병균만큼 널리 연구되지 않았다. 병리체계로서 H. vastatrix─커피 상호작용은 생물학적 특이성을 갖고 있으며 역사적, 경제적, 역학적 사례 연구로 사용될 수 있다.
H. vastatrix의 복잡하고 발달적으로 조절되는 감염 과정에는 추가적인 조직 집락화(tissue colonization) 전의 기공 곁세포들에 대한 흡기의 침습(haustorial invasion)과 부착기 단계(appressorial stage)에서 일찍이 HR 유도와 같은, 독특한 집락화 (colonization) 특징이 포함되어 있다.
그러나 분자 수준에서는, 병원성(pathogenicity)과 병독성(virulence)에 관련된 구체적인 메커니즘에 대해서는 아직 알아야 할 것이 많이 남아 있다. 516개의 추정 H. vastatrix 이펙터 단백질(effector proteins)은 표적 단백질 (target proteins)을 인코딩하는 커피 R 유전자의 식별을 촉진하여 질병 저항성 육종을 가속화하고 개선하기 위한 추가 도구를 제공할 수 있다.
HDT 개체군에서의 저항성 발견 및 특성분석과 육종 프로그램을 통한 상업용 재배품종으로의 배치는 여전히 CLR 질병 저항성 육종 역사에서 주요 혁신을 대표한다.
그럼에도 불구하고, 그러한 저항성을 극복할 수 있는 새로운 녹병 균종들의 출현은 H. vastatrix 병독성 진화를 이해하고 알려진 저항성의 원인을 더 잘 특성 분석하거나 새로운 저항성을 발견할 필요성을 높인다.
지금까지, 높은 표현형 다양성(phenotypic diversity)은 연구된 분자 다양성(molecular diversity) 내에 반영되지 않았으며, 집단 유전 구조(population genetic structure)도 발견되지 않았다. 대규모 개체군과 진화 유전체학 연구를 통해, H. vastatrix 집단의 c. 800-Mbp 게놈을 밝히려는 노력들은 그렇게 거대한 게놈 사이즈의 이유 뿐만 아니라 다양성 생성의 특징(signatures of diversity creation)에 대해서도 분명히 해명할 것이다.
게놈 데이터 생성의 실현가능성이 증가하고 통계적 방법들이 정교해짐에 따라, H. vastatrix 適應進化 (adaptive evolution)에 대한 우리의 이해가 가까운 미래에 더욱 높아질 것이다. 이를 통해 상대적으로 쉽게 저항 요인을 극복할 수 있는 매우 성공적이고 적응 가능한 병원균을 만드는 다양성 생성 메커니즘(diversity-generating mechanisms)에 대한 깊은 통찰을 제공할 것이다. 개선된 주석이 달린 게놈 서열(genome sequence)도 H. vastatrix의 분자 연구에 크게 도움이 될 것이다. 그러나 이러한 데이터를 활용하려면 이 중요한 병원체에 대해 아직 답변 되지 않은 질문을 해결하기 위해 기능 분석(functional analysis) 방법의 개발 또는 적용 뿐만 아니라 생화학에서 전사체학에 이르기까지 다양한 도구의 조합이 필요하다.
CLR의 150년 역사 동안 생물학, 전염병학, 그리고 방제에 관해 많은 지식이 얻어졌지만, 진화하는 농경적 및 생태적 조건과 진화하는 병원체 자체로 인해 CLR은 경제와 과학 모두에 어려운 병리체계가 되었다. 농부들에게 효과적인 방제 전략과 내구성 있는 저항성 원천을 제공하려면 생물학과 농경학을 연결하는 CLR 연구에 대한 추가 투자가 절실히 필요하다.
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