커피 잎 녹병(coffee leaf rust, CLR) 및 커피베리병(coffee berry disease, CBD)과 같은 경제적으로 중요한 식물 질병을 방제하기 위해 고전적인 육종을 사용하여 상당한 성공을 거두었다. 유전적으로 저항성 품종을 재배하는 것이 식물 질병을 관리하는 가장 적절하고 비용 효율적인 수단이며, 작물 개선의 핵심 구성 요소 중 하나라는 강력한 합의가 있다. 또한 병원체와 식물 방어 메커니즘에 대한 더 나은 지식을 통해 저항성의 내구성을 향상시키는 새로운 접근 방식을 개발할 수 있다는 것이 인식되었다.
식물 질병 저항성 분야의 개념에 대한 간략한 설명 후, 병원체 감염 및 변이성, 저항성을 위한 커피 육종 및 커피 저항성 메커니즘과 관련된 커피 녹병 및 CBD에 대한 연구 진행 상황에 대한 견해를 제공하려고 한다.
커피는 식량 작물은 아니지만 대부분의 커피 재배 국가에서 외화 수입의 주요 원천이다. 커피 생산을 제한하는 요인으로는
⊙ 곰팡이 Hemileia vastarix Berkeley and Broome에 의해 유발되는 coffee leaf rust (또는 orange rust)와
⊙ 곰팡이 Colletotrichum kahawae Bridge and Waller에 의해 발생하는 coffee berry disease (CBD)와
같은 주요 질병이 있다.
곰팡이 Hemileia coffeicola Maubl and Rog.에 의해 발생하는 다른 커피 녹병들(powdery, yellow rust 또는 grey rust)은 CLR 만큼 경제적으로 중요한 것으로 간주되지 않는다. 이 질병의 증상은 뚜렷한 얼룩(blotches)이나 농포(pustules)를 형성하는 H. vastatrix와 달리, 커피 잎의 밑면을 덮고 있는 노란색 胞子堆(yellow uredosori)의 먼지나 가루 코팅이 특징이다 (Rodrigues Jr. 1990; Adejumo, 2005). Waller (1985)에 따르면, H. coffeicola는 매우 습한 지역에서 재배되는 C. canephora의 일부 품종에 심각할 수 있는 서아프리카에서만 발생하며, 아라비카 커피에는 적합하지 않은 덥고 습한 조건에서 더 잘 발생한다.
Fusarium xylarioides Steyaert (유성생식형(teleomorph): Gibberella xylarioides Heim and Saccas)로 인한 커피 시들음병 (coffee wilt disease) 또는 진균성 관다발병 (tracheomycosis)과 같은 기타 곰팡이 질병은 로부스타 뿐만 아니라 아라비카에서도 중부 및 서부 아프리카의 일부 지역에서 중요해지고 있다. 그것은 나무가 황변 (yellowing)되고 시들게 (wilting) 되는 관다발병 (vascular disease)이다.
커피 수피병(coffee bark disease)의 원인균인 Fusarium stilboides Wollenw (telemorph : Gibberella stilboides)는 일부 아프리카 국가, 특히 에티오피아, 케냐, 말라위, 탄자니아에도 존재한다. 특징적인 증상은 줄기 궤양 (stem cankers)으로 이어지는 껍질의 스케일링과 전체 나무의 점진적인 dying back이다.
갈색 눈 반점 (brown eye spot) 또는 베리 얼룩 (berry blotch) (Cercospora coffeícola Berk and Cooke)은 묘목장과 플랜테이션들에서 널리 발생하는 질병으로, 커피 잎과 열매에도 감염된다.
Mycena citricolor (Berk and Curt.) Sacc에 의해 발생하는 커피 아메리카 잎 반점(American leaf spot)은 아메리카 대륙의 더 높은 고도의 시원하고 습한 지역에서만 보고되었다 (Waller 1985; Wrigley 1988; Chen, 2002; Geiser et al., 2005).
알려진 두 가지 세균성 커피 질병은 Pseudomonas syringae pv.에 의해 유발되는 halo blight of coffee (커피 후광 마름병) (Amaral et al., 1956)과, 그리고 다식성 박테리아(polyphagous bacteria) Xilella fastidiosa (Wells et al., 1987)에 의해 유발되는 coffee leaf scorch (커피 잎 그으름병)이다. 전자의 질병 커피 할로 마름병은 브라질, 케냐, 우간다 및 중국에서 기술되었으며, 발생률과 중증도가 높아 우려의 대상이 되고 있다 (Wen and Chen 1995; Chen, 2002). 이 박테리아는 커피 잎, 가지 끝, 어린 열매를 감염시키며 어떤 경우에는 Phoma sp.와 동일한 증상(불규칙하고 어두운 괴사성 병변)을 나타낸다. 그러나 어린 병변에 세균성 삼출물 (bacterial exudates)이 존재한다는 점에서 곰팡이와 구별할 수 있다. 그 박테리아는 나무의 모든 건강한 표면에 다수 존재하며, 서늘하고 습한 날씨에는 증식하여 전염병을 일으킨다.
커피 잎 그으름병 (Coffee leaf scorch)은 지금까지 박테리아 X. fastidiosa가 몇 가지 작물들, 특히 높은 발병이 되는 감귤류와 자두를 공격하는 브라질과 코스타리카에서만 기록되었다. 커피를 감염시킬 수 있는 한 박테리아 종류가 명사수 매미충 (sharpshooter leafhopper) Dilobopterus cortalimai (Cicadellidae: Cicadellinae)에 의해 전염되는데, 1995년 상파울루 주에서 처음으로 기록되었다 (Leite Jr. et al., 1999; Li er al., 2001). 감염된 커피 나무들에서의 증상에는 절간 단축(shortened internodes), 오래된 잎들의 조기 손실 (premature loss of older leaves), 작고 옅은 녹색에서 노란색의 변형된 잎의 말단 클러스터(terminal clusters of small pale green to yellow deformed leaves), 측면 싹의 고사(lateral shoot dieback), 그리고 전반적인 나무 발육부진 (overall plant stunting) 등이 포함된다 (De Lima et al., 1998; Li et al., 2001).
커피의 바이러스 질병에 대한 일부 기록은 브라질과 콜롬비아에서 산발적으로 이뤄졌지만 (leaf rugosity(잎 주름), leaf curl(잎 말림)), 경제적인 의미가 없었고 결과적으로 진단이 잘못 해석되었다 (Chen, 2002).
그러나 진드기(mite) Brevipalpus phoenicis Geijskes의 존재와 관련된 커피 고리반점 바이러스 (coffee ringspot virus) CoRSV는 브라질의 여러 주(상파울루, 파라나, 미나스 제라이스 및 연방 지구)에서 보고되었으며 최근 코스타리카에서 발견되었다. 잎, 열매에 눈에 띄는 고리반점(ringspot) 증상을 일으키고 나뭇가지에는 덜 자주 발생한다. 비슷한 질병이 필리핀에도 알려져 있지만, CoRSV와의 관계에 대한 정보는 없다. 커피 고리반점(coffee ringspot)은 최근 미나스 제라이스(Minas Gerais)에서 대규모 감염이 보고되어 소출 손실을 초래하기 전까지는 경제적으로 큰 의미가 없었다 (Chagas et al., 2003).
커피 농장의 질병, 특히 녹병 및 CBD를 통제하기 위한 살균제의 비용이 매우 높고 적용의 어려움으로 인해, 커피 실험센터들은 커피 개선 프로그램에서 통합된 글로벌 보호 접근법의 주요 부분으로서 이러한 질병에 대한 저항성을 선발하는 데 우선순위를 두었다 (Bettencourt and Rodrigues Jr., 1988).
잎 녹병 및 CBD에 대한 커피 저항성 개선은 주로 새로운 저항성 원인을 찾고 병원체 다양성과 숙주 방어 메커니즘에 대한 더 나은 이해에 중점을 두었다. 유전학, 세포 생물학, 생화학 및 분자 생물학의 새로운 도구가 사용됨에 따라 점점 더 명백해지고 있는 병원체에 대한 식물 질병 저항성의 복잡성을 고려하여, 본 리뷰에서는 병원체 인식, 신호 전달 경로 (signal transduction pathways) 및 후속 방어 반응, 그리고 숙주 저항의 특이성에 대해서도 중점을 둘 것이다. 병원체 감염 및 변이성, 저항성을 위한 커피 육종, 그리고 숙주 저항 메커니즘과 관련된 측면을 포함하여, 커피 잎 녹병 및 CBD에서 이루어진 발전에 특히 주의를 기울일 것이다.
식물은 잠재적인 침입 병원체를 인식하는 능력을 갖고 있으며 병원체 공격을 막기 위해 다양하고 정교한 방어 메커니즘을 개발해왔다 (Heath 1997a, Mansfield et al., 1997; Staskawicz, 2001). 동시에 병원체는 진화론적 과정에서 식물 저항 메커니즘을 손상시키는 전략을 개발해와서, 진화의 “핑퐁” 게임이었을 것이다 (Keen 1999). 이러한 메커니즘 중 일부는 본질적으로 발현되어 물리적, 화학적 장벽을 제공하는 반면, 다른 메커니즘은 신호전달 네트워크 (network of signal transduction)와 유전자 발현의 빠른 활성화(rapid activation of gene expression)를 포함하며, 병원체 공격 후에만 유도된다 (Dixon and Lamb 1990; Bradley et al., 1992; Heath 1997a).
대부분의 병원체 존재에 대한 식물의 지각(인식)과 신속한 반응에 따라 식물의 생존 여부가 결정된다. 지각은 병원체나 상처받은 식물 자체로부터 분자를 검출하는 것과 관련된다 (Keen 1999). 이러한 분자는 유발인자(elicitors) (비-종-특유적 또는 종-특유적 non-race-specific or race-specific)로 불리게 되었으며, 다양한 구조를 갖고 매우 낮은 농도로 존재하는 펩타이드 또는 단백질, 지방산 유도체(fatty acid derivatives), 스테롤 또는 기타 저분자량 화학물질일 수 있다 (Ebel & Scheel 1997; Somssich & Hahlbrock 1998; Yamaguchi et al, 2000; Peck, 2003). 유발인자의 출처가 무엇이든, 신호 지각 메커니즘은 그 식물 세포 표면의 특정 수용체 (specific receptors)의 존재에 의존하는 것으로 보인다 (Ebel and Scheel 1997; Pontier et al., 2002).
수용체-유사 단백질 키나아제 (receptor-like protein kinase) (RLK) 계열 중 몇몇은 세포질 세린 (cytoplasmic serine)/트레오닌 키나아제 (threonine kinase) 도메인들과 그리고 다양한 세포외 도메인들 (extracellular domains)을 갖는 膜貫通蛋白質 (transmembrane proteins)이다 (Morris and Walker, 2003). 빠르게 활성화되는 키나아제 중 일부는
⊙ 스트레스 반응성 단백질 키나아제 (mitogenactivated protein kinases, MAPK) (Jonak et al., 2002),
⊙ 칼슘 의존성 단백질 키나아제 (calcium-dependent protein kinases) (CDPK) (Romeis et al., 2001), 그리고
⊙ 벽-연관 키나아제 (wall-associated kinase) (WAK)로 확인되었다 (He et al., 1998).
그러나 아직까지 이들 키나아제들이 어떻게 정보를 세포에 전달하는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없다 (Peck, 2003).
인식되면 시그널링 이벤트가 시작되어,
▣ Ca2+의 內向 流動 (inward flux of Ca2+),
▣ 活性酸素種 (reactive oxygen species, ROS)의 생성,
▣ 액틴 세포골격 개입 (actin cytoskeleton involvement),
▣ 전사체 하위집합 수준의 변화 (changes in the levels of a subset of transcripts)
(Grant and Mansfield 1999; Guest et al., 1999; Heath, 2000a, Dangl and Jones, 2001; Peck, 2003),
▣ 아포플라스트 (apoplast 세포와 세포 사이 공간)와 燐蛋白質(phosphoproteins)에서의
원형질막 결합 NADPH 산화효소 (plasma-membrane-bound NADPH oxidases),
세포벽 결합 페록시다아제(cell-wall-bound peroxidases),
아미노 산화효소(amino oxidases)의 개입 (Bestwick et al., 1997; Heath, 2000a; Laloi et al., 2004) 등과 같은 수많은 세포 변화가 발생한다.
원형질막 (plasma membrane)에서의 신호전달 계통의 활성화는 살리실산 (salicylic acid), 자스몬산 (jasmonic acid), 에틸렌, 산화질소 (nitric oxide)와 같은 여러 다른 신호 분자들의 복잡한 네트워크를 유도하여 식물 전체에 걸친 그 병원체의 확산을 죽이거나 제한할 것이다 (Alvarez, 2000; Dixon et al., 2002; Turner et al., 2002; Harrison and Baldwin, 2004; Delledonne, 2005).
병원체의 초기 침입으로부터 보호하는 것은 물리적 및/또는 화학적 장벽과 같은 수동적 방어(passive defences)를 통해 달성된다.
물리적 장벽(Physical barriers)은 주로 식물 표면의 특성, 즉 표피 세포를 덮고 있는 왁스와 큐티클의 양과 질, 표피 세포벽의 구조, 기공의 크기, 위치 및 모양과 관련이 있다 (Agrios 1997). 어떤 식물들은 매우 두꺼운 벽 및/또는 큐티클에 투자하며 나무껍질(있는 경우)도 감염에 물리적 장애를 제공할 수 있다.
화학적 장벽(Chemical barriers)에는 항균 활성(antimicrobial activity)을 갖는 화합물들, 그리고 페놀, 퀴닌, 락톤, 시아노겐 글루코사이드(cyanogenic glucosides), 사포닌, 테르페노이드(terpenoids), 스틸벤(stilbenes) 및 탄닌(tannins)과 같은 식물 바이러스 벡터에 영향을 미치는 화합물들이 포함된다 (Keen 1999).
병원체 공격에 대한 구조적 장벽 외에도 식물 세포벽이 여러 신호전달 경로를 촉발할 수 있다는 증거가 축적되고 있다. 이러한 신호 특성은 방어에서 세포벽의 역할 뿐만 아니라 벽 합성의 조정 및 인접 세포 간의 확장에도 필수적이다 (Pilling and Hofte, 2003).
병원체의 비병원성 분리체에 의한 침입에 반응하여 하나 또는 몇 개의 숙주 식물 세포가 급속히 국소적으로 죽는 과민 반응(hypersensitive response, HR)은 유전자 대 유전자 상호작용의 가장 흔한 반응이다. HR은 감염된 숙주 세포에서 막 완전성 (membrane integrity)이 급속히 손실되고 갈색 페놀 산화 생성물이 축적되는 것이 특징이다 (Goodman and Novacky 1994; Hammerschmidt and Nicholson 1999; Heath, 2000a).
HR은 생존을 위해 살아있는 숙주 세포에 의존하는 생물영양기생 병원체(biotrophic pathogens)에 대한 효과적인 방어일 수 있지만 (Heath 1997b, Mansfield et al., 1997; Richael and Gilchrist 1999), 이 숙주 반응은 그 식물의 전반적인 방어전략의 단 한 부분일 가능성이 높다 (Hammerschmidt and Nicholson 1999).
HR은 이제 계획된 세포 사멸 (programmed cell death, PCD)의 형태로 거의 보편적으로 받아들여지고 있으며 (Ryerson and Heath 1996; De Wit 1997; Heath 1999, 2000a), 국소 및 전신 저항 유도와 일관된 연관성이 있다는 점에서 developmental PCD와 다르다 (Costet et al., 1999; Alvarez, 2000; Heath, 2000a).
HR이 숙주 저항에 어떻게 직접적으로 기여하는지, 그리고 HR의 시작이 다른 추정되는 방어의 표현과 어떻게 관련되는지에 대해서는 추가 설명이 필요하다. 세포가 HR을 겪을 때 페놀성 화합물의 산화는 페놀 산화효소 뿐만 아니라 활성산소종(ROS)의 생성도 증가한다는 것을 암시한다 (Goodman and Novacky, 1994; Bolwell 1999; Hammerschmidt and Nicholson 1999). 그러나 모든 식물-병원체 상호작용에 대한 HR 개발에 ROS (oxidative burst)의 생산이 필요하다는 것은 전혀 명확하지 않다 (Heath 1998, 2000b). 산화 폭발 동안 생성된 ROS는 방어신호 전달경로에서 기능하여 병원체에 대한 다양한 방어 반응을 유도할 수 있다고 제시되었다 (Neill et al., 2002; Laloi et al., 2004).이들 분자는 또한 항균제로서 직접적으로 작용할 가능성이 있다 (Baker and Orlandi 1995).
병원체와 숙주 식물 세포 사이의 상호작용의 또 다른 초기 사건은 phenylalanine ammonia-lyase (PAL)과 같은 페닐프로파노이드 경로(phenylpropanoid pathway)의 효소를 암호화하는 유전자의 발현이다 (Dorey et al., 1997).
PAL은 식물 저항성에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 즉, 이소플라보노이드(isoflavonoids)와 페닐프로파노이드 (phenylpropanoids)에 피토알렉신 활성 (phytoalexin activity)을 제공하고 리그닌 유사 화합물 (lignin-like compounds), 수베린 (suberin) 또는 종종 침전되는 다른 유형의 페놀 물질의 전구체로서 곰팡이 침입 지점에 숙주 세포의 벽에 종종 침전되며 (e.g. papilla formation), 균사의 진행을 차단하는 것으로 보인다 (Hammerschmidt 1999; Dixon et al., 2002; Caño-Delgado et al., 2003).
PAL은 또한 또 다른 방어 관련 화합물이자 PR-유전자, 카탈라아제(catalases), 수용체 유사 단백질 키나아제 (receptor-like protein kinases) 및 전사 인자 (transcription factors)의 활성화에 필요한 핵심적인 시그널링 요소인 살리실산 (salicylic acid, SA)의 생합성 경로에도 연루된다는 것이 밝혀져 왔다 (Mauch-Mani & Slusarenko 1996; Klessig et al., 2000; Dixon et al., 2002; Way et al., 2002; Mold et al., 2003).
저항성 발현(Resistance expression)은 종종 페놀 산화 효소들인 페록시다아제 (peroxidase) 및 페놀옥시다아제 (phenoloxidase), 그리고 지질 과산화 효소 (lipid peroxidizing enzyme)인 리폭시게나아제 (lipoxygenase)의 활성화를 동반한다 (Goodman and Novacky, 1994).
페록시다아제 활성(Peroxidase activity)은 종종 감염에 반응하여 증가하며, 항균제 양의 과산화수소 (hydrogen peroxide) 생산을 통해 방어 기능을 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 세포벽 목질화 (lignification) 및 가교 결합 (crosslinking )에서도 기능할 수 있다 (Peng and Kúc, 1992; Rasmussen et al., 1995; Chittor et al., 1999; Do et al., 2003).
페놀옥시다아제 (phenoloxidases) 활성의 증가와 내생 페놀 (endogenous phenols)과의 상호작용은 HR의 시작과 상관관계가 있다 (Hammerschmidt and Nicholson 1999).
리폭시게나아제 (Lipoxygenase)는 세포막 지질의 파괴 (disruption of cell membrane lipids)를 통해 HR에 기여하고, 독성 지질 산화 생성물 (toxic lipid oxidation products)의 형성을 통해 방어에 기여할 뿐만 아니라 지질 유래 신호의 형성 (formation of lipid-derived signals)에도 기여한다 (Croft et al., 1993; Jalloul et al., 2002; Montillet et al., 2005).
또 다른 유도되는 반응은 감염된 조직에 국소적으로 축적될 뿐만 아니라 전신적으로 유도되는
感染特異的 蛋白質 (pathogenesis-related proteins, PR proteins)의 합성이다 (Van Loon et al., 1994).
기존 17개 패밀리들의 대부분은 저항성에서 역할을 하는 것으로 생각되는 세포외 공간(extracellular space)으로 내보내지는 성분들을 포함한다 (Fritig et al., 1998; Christensen et al., 2002).
PR 단백질의 집합적 세트(예: chitinases 및 β-1,3-glucanases)는 병원체 성장, 증식 및/또는 확산을 억제하는 데 효과적일 수 있다 (Van Loon and Van Strien, 1999).
PR-9 단백질 (peroxidase 활성 포함)과 같은 다른 단백질은 병원균이 침투하는 것을 방지하기 위해 식물 세포벽 구성 요소의 산화적 가교 (oxidative cross-linking)에 영향을 줄 수 있는 효소이다 (Thordal-Christensen et al., 1992).
더욱이, 옥살레이트 산화효소 (oxalate oxidase) (Zhou et al., 2000)와 일부 키티나아제(chitinases )는 다른 식물 방어 반응들의 유도자 역할을 할, 곰팡이 세포벽으로부터의 화학적 신호 방출에 관여하는 것으로 제시되어 온 PR 단백질들이다 (Schlumbaum et al. al., 1986; Ryan, 1987; Lawrence et al., 2000).
새로운 세포외 PR 단백질들이 세 가지 부류의 현상들, 즉 항균 활성 (antimicrobial activity), 세포벽 생물학 (cell wall biology) 및 신호 전달 (signal transduction) 중 하나에서 역할을 할 가능성이 매우 높다 (Van Loon 1999; Tuzun, 2001; Christensen et al., 2002
숙주 저항성은 일반적으로 특정 병원체 종에 국한된다는 점에서 기생충-특이적(parasite-specific)이며, 일반적으로 특정 병원체 유전자형 에 대해 발현된다 (즉, 종-특이적 저항성 또는 病原型-특이적 저항성) (Heath 1997a, 2000b).
이는
⊙ 여러 植物─病原體 상호작용들, 특히 녹병과 같은 생물영양 기생충(biotrophic parasites)과
관련된 상호작용의 경우이며,
⊙ 병원체 비독성 유전자좌(pathogen avirulence (avr) loci)와,
해당 식물 질병 저항성(R) 유전자좌의 대립유전자
(alleles of the corresponding plant disease resistance (R) locus) 사이의
특유적 상호작용에 의해 지배되는 것들이다 (Flor, 1942).
이 유전자 저항성에 대한 유전자는, 지난 10년 동안 최대 12개의 R 및 avr 유전자의 복제와 여러가지 비호환(저항성 유발) 식물-병원체 상호작용에 대한 심층분석을 통해 검증되어 왔다 (Bogdanove, 2002).
"수직 저항성(vertical resistance)(Van der Plank 1963)"으로도 설명되는 종-특유적 단일유전자(또는 올리고제닉) 저항성 (Race specific monogenic (or oligogenic) resistance)은 일반적으로 포자 형성 없음, 괴사 반점 또는 증상의 완전한 결여와 같은 질적 효과를 갖는 명확한 표현형(phenotypes)을 제공하며, 그리고 일반적으로 급속한 숙주 세포 사멸(과민성 반응 – HR)과 관련되어 있는데, 그것에 의해 산화 파열(oxidative burst), PR 단백질 축적(PR protein accumulation), 피토알렉신 생산(production of phytoalexins) 등과 같은 생화학 반응들이 발생한다 (Lindhout, 2002).
아주 소수의 경우에만, 내구성 있는 저항성(durable resistance), 즉 병원체에 도움이 되는 환경에서 대규모로 적용되는, 효과가 오래 동안 유지되는 저항성(Johnson, 1981)이 단일 R 유전자를 사용하여 달성되었다.
일반적으로, 이전에 저항적이었던 품종들에 대한 새로운 독성 病原型(new virulent pathotypes)의 급속한 진화로 인해 육종가들은 새로운 R 유전자를 가진 대체 품종을 생산하게 되었다 (Pink, 2002).
따라서 이러한 유형의 저항성은 식물 육종에서 가장 자주 사용되지만, 가장 큰 단점은 내구성이 없다는 것이다 (Vale et al., 2001; Lindhout, 2002; Niks and Rubiales, 2002; Parlevliet, 2002).
숙주 저항성의 또 다른 유형은 종-비특유적 저항성(race non-specific resistance)으로,
⇒ 병원체의 모든 유전자형에 대해 다소 동일하게 효과적이지만,
⇒ 한 병원체 종에만 특이적인 것으로 보인다 (Parlevliet, 1983).
이러한 유형의 저항성은 단일 R 유전자가 아닌 여러 식물 유전자의 산물들 간의 상호작용을 통해 생성된 식물 질병 저항성을 의미한다 (Simmonds, 1991).
이러한 다중유전자 저항성(multigenic (or polygenic) resistance)은 일반적으로 정량적이다.
분자 기술의 시작으로 정량적 저항과 관련된 염색체 영역(chromosome regions)의 식별이 가능해졌다.
이러한 영역은 "정량적 특성 유전자좌(quantitative trait loci)"(QTL)라고 표기하며,
게놈에서 위치와 저항성에 대한 정량적 효과로 정의되므로, 그 기능에 대한 정보를 제공하지 않는다.
따라서 QTL은 모든 저항 메커니즘과 HR에도 관여할 수 있다 (Lindhout, 2002).
"field-resistance, horizontal resistance, partial resistance” (Van der Plank, 1963)"으로도 설명되는 이러한 유형의 저항성의 유전학은 각 유전자의 효과가 작고 종종 환경의 영향을 받거나 또는 다른 유전자들과의 상호작용(epistasis 상위성)의 영향을 받기 때문에 연구하기 어렵다.
QTL은 결합된 힘으로 높은 수준의 저항을 제공할 수 있으므로, 다유전자성 저항성(polygenic resistance)과 관련된 각 QTL을 무효화하는 병원체의 적응은 단일유전자 저항성(monogenic resistance)의 경우 단 하나의 유전자를 무효화시키는 것보다 이론적으로 더 복잡하다 (Lindhout, 2002).
따라서 HR과 관련된 비내구성 종-특이적 단일 유전자 저항(non-durable race-specific monogenic resistance)에 대한 오랜 경험을 가진 일부 병리체계에서는, 다유전적 정량 저항 (polygenic quantitative resistance)이 좋은 대안을 제공하며, 그리고 마커 지원 육종은 이러한 저항을 상업적 목적으로 활용하는 것을 촉진할 것이다 (Lindhout, 2002).
커피 잎 녹병의 원인균인 H. vastarix는
⊙ 夏胞子 段階 (uredinal stage),
⊙ 冬胞子層 段階 (telial stage),
⊙ 擔子器 段階 (basidial stage)를 생성하지만,
⇒ 오직 二核性 夏胞子들(dycariotic urediospores)만이 이 질병의 원인이다.
H. vastarix는 잎의 아래쪽 표면을 감염시켜 夏胞子들(uredosori) (Figure 1A-B)의
⊙ 큰 주황색 군집을 생성하여
⊙ 조기에 잎이 떨어지고(premature leaf fall) 소출 손실(yield losses)을 초래한다.
잎 녹병은 1861년에 처음으로 기록된 것으로 보인다; 빅토리아 호수 근처에 있었지만, 처음으로 큰 경제적 영향을 미친 곳은 1868년 스리랑카였다 (Wellman, 1957).
잎 녹병은 커피 재배 국가들 전체에 퍼져 있으며 최대 10~40%의 손실을 초래할 수 있다.
녹병과 같은 생물영양기생 균류(Biotrophic fungi)는 성장과 번식을 위해 식물의 살아있는 세포에 전적으로 의존한다 (Heath 1997b, Shulze-Lefert and Panstruga, 2003).
다음과 같은 특성들이 이 곰팡이의 특징으로 보인다;
(i) 고도로 발달된 감염 구조(highly developed infection structures);
(ii) 특히 용해 효소(lytic enzymes)의 제한된 분비 활동(limited secretory activity);
(iii) 곰팡이와 식물 원형질막들(fungal and plant plasma membranes)을 분리하는
탄수화물이 풍부하고 단백질이 함유된 계면층(interfacial layers);
(iv) 영양 흡수 및 대사를 위한 특화된 균사(hyphae)인 吸器 (haustoria);
(v) 생물 영양(biotrophy)의 확립을 위한
숙주 방어의 장기적인 억제(long-term suppression of host defences) 및
특정 숙주 유전자의 유도(induction of specific host genes)
(Mendgen and Hahn, 2002; Shulze-Lefert and Panstruga, 2003; Voegele and Mendgen, 2003).
다른 녹병균들과 마찬가지로 커피 잎에서 H. vastatrix의 dycariotic phase (이핵성 단계)가 시작되는 것은(Heath 1995, 1997a, Mendgen and Hahn, 2002; Mendgen and Voegele, 2005) 기공들(stomata) 위의 부착기 형성(appressorium formation) 및 세포간 및 세포내 집락화(inter- and intracellular colonization)에 의한 침입을 비롯한 특정 사건들이 수반된다 (Rodrigues Jr. et al., 1975; Rijo and Rodrigues Jr., 1977; Tiburzy et al., 1983; Coutinho et al., 1993; Martins and Moraes, 1996; Silva et al., 1999a, 2002).
따라서 취약한 커피 잎들에서는, 하포자 발아 (urediospore germination) 및 기공 위의 부착기 분화 (appressorium differentiation over stomata) (figure 1C) 후에, 곰팡이가 침투하여(접종 후 12시간부터)(figure 1D), 침투 균사(penetration hypha)(figure 1E)를 형성하고, 그 균사는 기공하 챔버(substomatal chamber) 속으로 성장한다.
이 균사는 전진하는 끝 부분(advancing tip)에 두 개의 두꺼운 측면 가지(lateral branches)를 생성한다; 각 균사와 그 가지들은 닻(anchor)과 닮았다 (figure 1F).
그 닻의 각 측면 가지에는 균사(hypha) (흡수 모세포 haustorial mother cell – HMC)가 있으며,
곁세포들(subsidiary cells)은 접종 약 36시간 후에 형성이 시작되는 흡기(haustoria)(그림 1G)에 의해 처음으로 침입 받는다.
그 곰팡이는 HMCs를 포함하여 더 많은 세포간 균사(intercellular hyphae)를 형성하고,
해면조직 및 울타리 조직(the spongy and the palisade parenchyma)과 그리고
심지어 상부 표피(upper epidermis)의 세포들에서
많은 수의 흡기(haustoria)를 형성하며 성장을 추구한다.
접종 후 약 20일 정도 지나면, 침투 부위 아래에 촘촘한 菌絲體 (dense mycelium)가 관찰되고,
하포자 포자낭군(uredosporic sorus)이 기공을 통해 "꽃다발 bouquet "처럼 튀어나온다(protrudes).
녹 하포자(urediospores)가 식물 표면에 부착된 후 정교한 숙주 표면 인식 시스템 (host-surface recognition system)으로 인해 감염 구조가 발달한다.
이핵세포 발아관(dicaryotic germ tube)의 끝(tip)은 식물 큐티클의 지형적 특징을 따라갈 수 있으므로 기공 입구 (stomatal opening)를 만날 확률이 높아진다 (Mendgen and Voegele, 2005).
기공 보호 세포(stomatal guard cells)의 외부 입술(outer lip) 크기(dimension)와 같은 숙주의 특정 특징들은 아마도 잎 알코올(leaf alcohols)과 같은 화학 물질과의 시너지 상호작용을 통해 유도 신호(inductive signals) 역할을 한다 (Collins et al., 2001; Wiethölter et al., 2003).
식물 내에서 추가 곰팡이 발생을 제어하려면 연속적인 신호 시퀀스(successive sequence of signals)도 필요하다 (Heath, 1997b, Mendgen and Voegele, 2005).
H. vastatrix 감염 구조의 분화에 어떤 신호와 신호 전달 경로 (signaling pathways)가 관여하는지 이해하기 위해 다양한 인공 막들을 테스트했다. 오일 콜로디온 막 (oil collodion membranes)의 경우, 포자 발아 (urediospore germination) 및 부착기 형성 (appressoria formation) 비율은 커피 잎에서 얻은 값과 크게 다르지 않았으며, 이는 침투 전 구조의 유도에서 지형 신호의 역할을 가리킨다. 그러나 후속 감염 구조는 매우 낮은 비율(1-2%)로만 발생했으며 대부분의 경우 부착기 (apressorium)로부터 침투 균사 (penetration hypha)를 구분하는 격막 (septum)이 없었다 (Azinheira et al., 2001; Azinheira, 2005). 따라서 H. vastatrix의 경우, 비록 신호의 본성 (nature)은 아직 알려지지 않았지만 곰팡이 분화(fungal differentiation)를 계속하려면 두 번째 자극이 필요한 것으로 보인다 (Azinheira, 2005).
분자연구들은 RT-PCR 전략을 사용하여, MAPK 계열에 속하는 Magnaporthe grisea로부터 pmk1 유전자 상동체 (gene homologue)가 존재하는 것을 보여주었다. 포자 (urediospores) 및 발아관 (germ tubes)에서의 발현에도 불구하고, 부착기 형성 (appressorium formation) 동안 MAPK의 발현에서 관찰된 약간의 증가는 이 단백질이 해당 구조의 형성으로 이어지는 신호 전달 메커니즘에서 중요하다는 것을 제시할 수 있다 (Azinheira, 2005).
H. vastatrix는 하포자들(urediospores)의 세포벽의 주요 구성요소로서 β-1,3- glucans와 키틴(chitin)을 함유하고 있으며 침투 전후 구조를 갖고 있다 (Maxemiuc-Naccache and Dietrich, 1981; Silva et al., 1999a). 두 중합체 모두 침투 전 곰팡이 구조(pre-penetration fungal structures)의 벽에 규칙적으로 분포되어 있다 (Silva et al., unpublished).
세포간 균사(intercellular hyphae)의 세포벽 위에서는 β-1,3-glucans에 대한 규칙적인 표지가 관찰되었으며, 그 내부에 더 축적되는 키틴 (chitin)은 숙주 키티나아제(host chitinases)의 최종 작용에 덜 노출될 가능성이 높다 (Silva et al., 1999a).
다양한 녹들에 대해 Deising et al. (1996)은 잎의 세포간 공간에 형성된 감염 구조에서 키틴은 FITC-labelled WGA로 검출하기 어렵다고 추론했다. 그들은 세포간 및 세포내 숙주 방어 효소(host defense enzymes)와 직접 접촉하지 않는 곰팡이 구조에 키틴 노출을 제한하는 것이 녹병균의 일반적인 룰일 수 있다고 제시했다.
Rijkenberg and Truter (1973), Rijo and Sargent (1974), Silva and Nogueira (1977), Benac (1981), 그리고 Silva et al. (1999a)에 의해 설명된 H. vastatrix의 세포간 균사와 흡근 (intercellular hyphae and haustoria)의 초미세구조는 다른 호환 가능한 호스트-녹 상호작용에서 관찰된 것과 유사하다 (Littlefield and Heath의 리뷰, 1979).
Silva et al.이 수행한 세포화학적 연구 (1999a)는 吸根 (吸器, haustorium) 형성 동안, 식물 세포벽 분해가 생물영양기생 곰팡이균 (biotrophic fungi)의 공통 목표인 숙주 세포에 대한 손상을 최소화하면서 침투하는 부위로 제한된다는 것을 보여주었다 (Mendgen and Hahn, 2002; Schulze-Lefert and Panstruga, 2003).
H. vastatrix의 첫 번째 균종 구별(race differentiation)은 인도의 Mayne (1932)에 의해 수행되었으며, 그는 현지 녹병 샘플을 4개의 생리학적 종족으로 구별했다.
D'Oliveira가 1952년 포르투갈에서 커피 녹병 종족에 대한 세계 조사를 시작할 때까지, H. vastatrix의 생리학적 전문화에 대한 다른 연구는 이루어지지 않았다 (D'Oliveira 1954-1957, 1965).
CIFC (Coffee Rusts Research Center)에서 수행된 작업을 통해 약 45개 녹병 종족들의 특성 분석이 가능해졌다 (D'Oliveira, 1965; D'Oliveira and Rodrigues, 1961; Rodrigues et al., 1965; Bettencourt et al., 1965; Rodrigues et al., 1975; Rodrigues et al., 1993; Várzea et al., 2002a).
H. vastatrix의 유전적 다양성을 탐지하기 위한 분자 스터디들이 Nandris et al. (1998)에 의해 수행되었다.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 방법은 개체 간의 다형성 (polymorphism)을 밝혀냈다.
그러나 얻어진 분자 마커들과 사용된 病原型(pathotypes) 사이의 연관성은 확립되지 않았다.
CIFC의 최근 스터디들에서는, RAPD와 MSP-PCR (Microsatellite-Primed Polymerase Chain Reaction)을 사용하여, 연구 대상 개체군 사이에 상당한 정도의 변이성(variability)이 관찰되었으나, 숙주, 지리적 기원, 그리고 생리적 종족 사이에 명확한 관계가 얻어지지는 않았다 (Gouveia et al. al., 2005).
CIFC에서 수행된 녹병 저항성에 대한 유전 스터디들은 유전자-대-유전자 이론(gene-for-gene theory)이 커피-녹병 상호작용에 적용 가능하다는 것을 보여주었는데 (Noronha-Wagner and Bettencourt 1967), 여기서 커피 나무의 저항성은 적어도 9개의 주요 우세 유전자에 의해 단독으로 또는 연합적으로 결정된다 (SH1-SH9).
동일한 이론에 의해, H. vastatrix에서 9개의 독성 유전자 (v1-v9)를 추론하는 것이 가능했다 (Rodrigues Jr. et al., 1975; Bettencourt and Rodrigues Jr. 1988).
주요 유전자 SH1, SH2, SH4 및 SH5는 에티오피아산 순수 아라비카에서 발견되었으며, SH3 유전자는 C. liberica에서 유래한 것으로 여겨지며, SH6, SH7, SH8 및 SH9는 "Hibrido de Timor"-HDT ( C. arabica × C. canephora) 유래체들에서만 발견되어, 그 하이브리드의 로부스타 쪽에서 유래한 것으로 추정되었다 (Rodrigues Jr. et al., 1975; Bettencourt and Rodrigues Jr., 1988).
이러한 SH 유전자들 외에도 다른 주요 유전자들과 마이너 유전자들이 커피-녹병 상호작용을 조절할 수 있을 가능성이 높다 (Bettencourt and Rodrigues Jr., 1988).
커피 유전자형들(genotypes)은 여러 녹병 균종들(rust races)에 대한 완전한 저항성 또는 취약성(susceptibility) (낮거나 높은 감염 유형)을 포함하는 반응들에 따라 기본적으로 서로 구별되는 생리학적 그룹들로 분류된다.
알려진 모든 녹병 균종들(rust races)에 대한 저항성을 특징으로 하는 그룹 A는 C. arabica × C. canephora 사이의 하이브리드들에서 발견되었으며, HDT에서와 같이 자발적으로 발생하거나 Icatú에서처럼 인공적으로 만들어졌다 (D'Oliveira and Rodrigues Jr. 1961; Marques and Bettencourt 1979).
그룹 A의 나무들은 C. liberica, C. dewevrei, C. eugenioides, C. congensis 등에서도 발견되었다 (D'Oliveira and Rodrigues Jr. 1961). 반면 E-그룹은 알려진 거의 모든 균종들에 대한 취약성이 특징이며, 전통적인 Typica 및 Bourbon 품종이 포함된다 (Bettencourt and Rodrigues Jr., 1988).
비특이적 다유전자성 저항성 (Non-specific polygenic resistance)은 CIFC에서 평가되어 왔고, 다른 국가들에서 더욱 광범위하게 평가되었으며 (Kushalappa and Eskes 1989), 潛伏期(latency period), 포자 형성 병변(sporulating lesions)의 비율, 병변당 포자 생성 (spore production per lesion)과 같은 다양한 매개변수들을 사용하여 주로 실험실 조건에서 평가되었다.
Eskes(1983), Leguizamon(1983), Várzea et al. (1985), Fagioliet al. (1990), 그리고 Holguin (1993)은
특히 C. canephora 그리고 이종간 하이브리드들 및 일부 C. arabica 유전자형들에서 이러한 유형의 저항성의 원인이 존재함을 지적했지만 이러한 유형의 저항성의 유전은 아직 알려지지 않았다.
1927년부터 인도 Balehonnur에 있는 Central Coffee Research Institute (CCRI)는 중요한 국가 육종 프로그램을 수행해 왔다.
그러나 녹병 저항성을 위한 커피 육종이 결정적인 추진력을 얻은 것은 CIFC 설립 이후였다.
저항성 품종을 확보하기 위한 CIFC의 식물 육종 프로그램에서 중요한 돌파구는 1950년대 후반 포르투갈의 옛 식민지인 Timor (현재의 Timor Lorosae)에서 발견된 단일 나무인 Hibrído de Timor (HDT)의 발견이었다. 놀랍게도, 대부분의 HDT 자손은 알려진 녹병 균종들의 전부 또는 일부에 저항성을 보였다.
HDT는 C. arabica와 C. canephora 사이의 자연 잡종(natural hybrid)으로 추정되며, 후자로부터 녹병 저항성을 담당하는 유전자를 받은 것으로 추정된다. 이 종간 잡종(interspecific hybrid)은 C. arabica와 동일한 수의 염색체를 가지며, 그 교배들(crosses)은 생식력이 있다.
CIFC의 육종 프로그램은 본질적으로 저항성 부모로서 HDT의 활용을 기반으로 했다.
HDT를 사용하여 CIFC에서 만들어진 주요 하이브리드는 다음과 같다;
⊙ HW26 = Caturra Vermelho x HDT 832/1;
⊙ H 46 = Caturra Vermelho × HDT 832/2;
⊙ H361 = Villa Sarchi × HDT 832/2;
⊙ H528 = Catuaí Amarelo × HW26/13;
⊙ H529 = Caturra Amarelo × H361/3.
잎 녹병에 관해 CIFC에서 진전된 기초 연구 및 응용 연구와, 여러 커피 재배 국가에서 시작된 연구는 아라비카에서 이 질병에 대한 지속적인 저항성 (durable resistance)을 확보하는 데 상당한 진전을 가져왔다.
이러한 진전은
케냐(Coffee Research Station),
브라질(Instituto Agronômico de Campinas, Instituto Brasileiro do Café,
Sistema Estadual de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais,
Instituto Agronômico do Paraná,
Universidade Federal de Viçosa, 그리고
Universidade Federal de Lavras);
콜롬비아(Centro Nacional de Investigaciones de Café);
중앙 아메리카 (멕시코, 파나마, 도미니카 공화국) - Promecafe 프로젝트
(PROMECAFE: Programa Cooperativo para la Protección,
Modernización de la Caficultura en Centroamerica, México, Paname Y República Dominicana)
등 여러 국가들의 몇몇 커피 실험 센터들과의 공동 협력의 결과로 가능했다 (Bettencourt, 1981; Bettencourt, 1983; Rodrigues Jr. et al., 2000).
그 혈통 선발(pedigree selections)에서, HW26 및 H46의 F3 및 F4 세대가 Universidade Federal de Viçosa로부터 Catimor라는 명칭을 받았다.
하이브리드 H361, H528, 그리고 H529가 1970년에 아메리카 대륙에 도입되었으며, F3 및 그 이상의 세대는 Sarchimor, Cavimor 및 Cachimor라는 명칭을 받았다 (Bettencourt, 1983).
가장 발전된 셀렉션들인 Catimor와 Sarchimor는 라틴 아메리카 뿐만 아니라 아프리카(말라위), 아시아(인도), 오세아니아(파푸아뉴기니) 등의 커피 재배 국가들에 널리 배포되었다.
Catimor는 몇 년 동안 로컬 선발을 거친 후, Oeiras, Tupi, Obata, Iapar59 (브라질), Catrenic (니카라구아), Costa Rica 95 (코스타리카), Ihcafe-90 및 Lempira (온두라스), Catisic (엘살바도르), 그리고 Mida 96 (파나마)와 같은 지역별 이름을 지정 받았다.
콜롬비아에서는, HDT 1343을 Caturra와 교배하여 " Colombia" 품종을 파생시킨 최초의 하이브리드를 만들었다 (Rodrigues Jr. et al., 2000).
지난 몇 년 동안 HDT 및 Icatú와 같은 다른 종간 4배체 하이브리드들에서 개량된 일부 상업용 품종들이 새로운 독성 균종들의 출현으로 인해 일부 국가에서 잎 녹병에 대한 저항성을 점차 잃어가고 있다 (Rodrigues et al., 2000; Várzea et al. al., 2004; Várzea and Marques, 2005).
그러나 참조된 커피 품종들의 일부 유전자형들은 저항성을 유지하고 있으며, 다른 일부는 비록 필드에서 감염되었음에도 불구하고 심각하게 감염된 다른 품종들과 함께 불완전한 유형의 저항성을 나타내고 있는 바, 이는 아마도 Columbia 품종과 같은 다유전자 타입의 저항성 (polygenic type of resistance)을 보유하고 있음을 시사하는 것이다 (Alvarado, 2005).
반면, Rume Sudan 및 Tafarikella와 같은 저소출의 일부 아라비카 품종들은, CIFC에서 취약성 그룹 E에 속하는 것으로 분류되었으며 수년 동안 현장에서 매우 높은 부분 저항성 (partial resistance)을 나타냈다 (Várzea et al., 2000; Várzea et al., 2002a).
CIFC에서는 HDT 파생품종들과 Rume Sudan의 일부 계열들의 저항성 수준이 현재 재평가되고 있다.
그러나 소출이 완전히 억제되면 취약성 품종인 Caturra가 강한 감염 조건에서 부분적으로 저항성이 있는 것처럼 보인다는 점은 흥미롭다 (Bertrand et al., 미공개 데이터).
더욱이, 동일한 저자들은 'Resistant × Susceptible' 사이의 교배(cross)로 인한 F2 개체군에서, 생산성이 낮은 나무들이 매우 높은 빈도로 나타나고, 부분적으로 또는 전체적으로 저항성이 있으며, 생산성이 높은 나무들은 저항성 또는 취약성으로 나타나고 부분적으로 저항적인 경우는 거의 없음을 관찰했다. 결과적으로 일부 부분적인 저항성은 그 나무의 생리학적 상태로 설명될 수 있다.
비록 감염 후에 몇 가지 저항 메커니즘들이 유도되기는 하지만, H. vastatrix의 성장을 제한할 수 있는 미리 형성된 방어 (preformed defences)가 커피에 존재한다는 증거는 없다 (Rodrigues et al., 1975; Kushalappa and Eskes, 1989; Rodrigues et al., 2000 Várzea et al., 2002a, Várzea et al., 2004). H. vastatrix 하포자들(urediospores)은 일반적으로 취약한 커피 나무와 저항적인 커피 나무에서 기공 위에 부착기들 (appressoria)을 똑같이 잘 발아하고 분화한다 (Silva 1996; Silva, et al., 2002).
많은 커피 (Coffea spp.) 유전자형들의 경우에, 저항(성)은 흡근 후의(post-haustorial) 것이며 (그 곰팡이는 감염의 여러 단계들에서 성장을 멈췄지만, 첫 번째 흡근(haustorium)이 형성된 후에는 더 자주 멈췄다), 자가형광 및/또는 갈변 세포의 존재 또는 에반스 블루를 사용한 진청색 염색으로 인식되는 과민성 세포 사멸 (HR) (그림 1H)에 의해 빠른 속도로 표현된다.
세포 사멸은 접종 후 2일 쯤부터 관찰되기 시작했는데, 그 곰팡이가 부착기 단계 또는 침투균사 단계에 도달한 감염 부위들의 공변 세포들 (guard cells)에서만, 또는 공변 세포와 곁세포들 (subsidiary cells) 모두에서 세포 사멸이 관찰되기 시작했다 (Silva 1996; Silva et al., 2000, 2002).
접종 후 3일째부터 吸器(吸根, haustorium)에 의해 침입 당한 곁세포와 엽육세포(mesophyll cells)의 사멸이 관찰되었다.
다른 커피 저항성 遺傳子型들 (Martins et al., 1985; Rijo et al., 1991)의 경우에 그리고 다른 녹병균들 그리고 다른 특정 환경에서만 생활할 수 있는 생물영양 기생체(obligate biotrophs)에 대해 저항적인 나무들에서 일반적으로 기술된 바와 같이, 감염 기간 동안 세포 사멸(cell death)은 인접한 표피 및 엽육 비침습 세포들 (epidermal and mesophyll noninvaded cells)로 퍼진다 (Heath, 2000a, Koga et al., 1990; Huang et al., 1998).
취약한 커피나무들에서는, 접종 후 3일째부터 공변세포와 곁세포의 사멸이 관찰되었으나, 초기 단계에서 그 곰팡이가 성장을 멈춘 감염 부위들의 매우 작은 비율(대체로 20% 미만)에서만 사멸이 관찰되었다 (Silva , 1996; Silva et al., 2002).
HR을 겪는 숙주세포들에 대한 투과형 전자현미경(Transmission electron microscope) 관찰은 원형질막 (plasma membrane)의 수준에서, 그리고 다른 세포 소기관들 (organelles), 즉 엽록체 (organelles), 핵 (nucleus), 미토콘드리아 (mitochondria)에서 막 파괴 (membrane breakdown)가 나타났고, 아울러 엽록체 및 핵 모양의 변화와 細胞質 凝固 (coagulation of cytoplasm)가 나타났다 (Silva et al. , unpublished data).
세포학적 수준에서 초기에 발견된 또 다른 비호환성 신호(signal of incompatibility)는 흡기 포위 (haustoria encasement)였다 (figure 1I). 이 숙주 반응은 호환 가능한 상호작용(compatible interactions)에서도 관찰되었지만, 후자는 감염 과정(접종 후 7일째부터)과 소수의 흡기들 (haustoria)에서만 관찰되었다 (Rijo and Vasconcelos, 1984; Silva, 1996; Silva et al., 1999a, 2002). 저항적 잎 또는 취약한 잎들에서의 흡기 포위된 물질(haustoria encased material)은 β-1,3-glucans와 엑소글루카나아제-금 복합체 (exoglucanase-gold complex)에 대해 일으켜진 다클론 항체 (polyclonal antibodies)의 사용으로 알 수 있듯이, 癒合組織 (callose)과 β-1,3-glucans에 대해 양성 반응을 보였다.
항-갈락투론산 단일클론 항체(anti-galacturonic acid monoclonal antibodies) (JIM7)의 사용은 침투 페그 (penetration pegs) 주변의 포위 물질 (encasing material)에서 펙틴의 위치 (localization of pectins)를 허용했지만, 흡기체 (haustorial bodies) 주변에서는 그렇지 않았다 (Silva et al., 1999a, 2002).
녹병 및 기타 필수 생물영양 기생체들에 대해 저항적인 몇몇 나무들에서, 흡기 포위(haustorium encasement)는 비호환성(incompatibility )의 한 표현으로 간주되어 왔다 (Littlefield and Heath 1979; Cohen et al., 1990; Skalamera et al., 1997).
흡기 포위(haustorium encasements)의 주요 화합물인 癒合組織 (callose)는 다른 세포벽 구성 요소보다 작은 분자들에 대해 투과성이 덜 한 것으로 보고되었으며 (Heslop-Harrison, 1966), 따라서 영양분이 곰팡이로 이동하는 것을 제한하고 결과적으로 곰팡이 성장을 늦출 수도 있을 것이다 (Rijo and Vasconcelos, 1984).
저항성 커피 잎에서, 초기에 검출된 세포의 표면 형광(epifluorescence) 및/또는 갈변(browning)은, 플로로글루시놀-HCl 시험(phloroglucinol-HCl tes)에 의해 나타난 바와 같이, 접종 후 7일부터 발생한는 세포벽의 목질화(lignification)로 이어졌다 (Tiburzy et al., 1983; Rijo and Vasconcelos, 1984; Martins et al., 1985; Silva et al., 2002).
생화학적 스터디들은, 커피 저항성 遺傳子型(resistant genotypes)을 가지고, 세포 사멸 관찰이 시작되기 직전 또는 그와 동시에 페닐알라닌 암모니아 분해효소(phenylalanine ammonia-lyase PAL) 및 페록시다아제 활성(peroxidase activity)이 조기에 증가한 것을 보였으며, 이는 이러한 효소들이 HR에 관여함을 가리키는 것일 수 있다. 접종 후 4~5일에 PAL 및 페록시다아제 활성의 두 번째 증가가 관찰되었으며, 이는 나중에 페놀성 화합물의 축적 및 세포학적으로 검출된 숙주 세포벽의 리그닌화와 관련될 수 있다 (Silva et al., 2002, 2003a,b).
IEF gels에 의해 얻은 페록시다아제의 동위효소 패턴(isoenzyme pattern)은 비호환적 상호작용들에서 검출된 페록시다아제 활성(peroxidase activity)의 첫 번째 피크와 동시에 음이온성 동위효소들(anionic isoenzymes) 및 새로운 양이온성 동형 (new cationic isoform)의 활성 증가를 보여주었다 (Silva et al., 2003a,b).
이때 DAB(Diaminobenzidine)를 사용하여 세포 화학적으로 국소화된 퍼록시다아제 활성(peroxidase activity)이, 감염 및 침투 부위의 기공 및 해면체 세포들(stomatal and spongy cells)의 벽, 중엽(중간 박막층, middle lamella), 세포질 내용물(cytoplasmic contents), 엽록체 및 소포체(endoplasmic reticulum) 뿐만 아니라, 숙주 큐티클-진균 침투 전 구조(fungal pre-penetration structures)의 경계면에서 검출되었다.
저항성 커피 잎을, 페록시다아제 기타 산화효소의 활성화제인 2,4-다이클로로페놀 (2,4-dichlorophenol)로 처리하면 세포 사멸이 크게 증가했다.
반대로, 동일한 효소의 억제제인 살리실 하이드록삼산(salicyl hydroxamic acid)과 NADPH 산화효소의 억제제인 염화디페닐렌요오도늄 (diphenyleneiodonium chloride)은 세포 사멸을 감소시켰다.
이러한 결과는 페록시다아제(peroxidases), NADPH 옥시다아제 그리고 결국 다른 옥시다아제들이 커피 - 녹 상호작용의 HR에 관여함을 시사한다.
활성 산소종 제거제(scavengers of active oxygen species) (카탈라아제(catalase), 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 그리고 만니톨(manitol))를 사용한 동일한 종류의 처리에서는, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제만이 세포 사멸을 유의하게 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 또한 HR에서 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 O2 (superoxide anion radical O2)의 관여를 시사한다 (Silva et al., 2001, 2003b).
반면 Rojas et al. (1993)은 비호환적 커피 - 녹병 상호작용 동안 리폭시게나아제 활성(lipoxygenase activity)이 증가한 반면, 호환적 상호작용에서는 효소의 활성이 상당히 일정하게 유지되었음을 밝혔다.
Maxemiuc-Naccache et al. (1992)은 커피 잎의 조추출물(crude extracts)을 사용하여, 커피─잎녹병 간 비호환성 상호작용에서 키티나아제(chitinase) 및 글루카나아제(glucanase) 활성의 초기 증가가 관찰되었지만, 호환 가능 상호작용에서는 그렇지 않은 것으로 관찰되었다. 비호환적 커피─녹 상호작용의 세포간액 (intercellular fluids, IF)에서 키티나아제 활성을 연구할 때 유사한 결과가 얻어졌다. 커피 잎의 IF에서 나온 키티나아제의 기본 동형(isoforms)은 호환 가능 상호작용과 비호환 상호작용 모두에 존재했지만, 호환 가능하지 않은 상호작용에서는 더 일찍 발견되었다.
클래스 I 키티나아제에 특이적인 항체를 사용하여 수행된 면역 검출분석(Immunodetection analyses)은 비호환 상호작용에서 이러한 동형의 중요성을 보여주었다 (Guerra-Guimarães et al., 2001, 2003).
다양한 커피 저항성 유전자형에 대한 미세구조적 관찰을 통해, 접종 후 약 5~7일 동안, 노화 균사(senescent hyphae) 주변의 세포간 공간에서, 죽은 숙주 세포의 옆에 그리고 중간 판(middle lamella)과 밀접하게 연관되어 있는, 부분적으로 결정화된 물질의 축적을 발견했다 (figure 1J). 그러나 그런 물질은 건강하거나 취약한 조직에서는 전혀 검출되지 않았다.
세포 및 면역세포화학적 테스트에 따르면, 축적이 시작될 때 그 물질에는 약하게 에스테르화된 펙틴(esterified pectins)이 포함되어 있는 것으로 나타났다. 또한 다당류와 페놀 유사 화합물도 포함되어 있다. 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 익스텐신(extensins), 하이드록시프롤린이 풍부한 당단백질(hydroxyproline-rich glycoproteins) 및 단백질은 검출되지 않았다.
이 물질의 역할은 알려져 있지 않지만, 병원체에 의한 조직 침입의 둔화와 관련된 식물 세포 사멸의 결과일 수 있다 (Silva et al., 2002, 2005).
다양한 커피 저항성 유전자형들에서 접종 후 약 12일 동안 관찰된 또 다른 반응은, 감염 부위에서 숙주 엽육세포의 비대 (hypertrophy of the host mesophyll cells)였으며 (Rijo et al., 1990; Silva et al., 2002), 이는 가능한 성장 조절자들의 개입을 제시한다 (figure 1K).
세포간 균사를 둘러싸고 있는 이러한 큰 세포들은 국부적인 肿大 (localized tumefaction, 부어 오름)를 일으키고, 육안으로 보기에는 비호환적 커피-녹 상호작용의 가장 일반적인 반응유형인 flt에 해당한다.
커피의 방어 및 저항성 유전자 활성화에 대한 통찰력을 얻기 위해, 녹병 병원체의 공격을 받았을 때 커피 잎에서 초기에 발현되는 유전자 목록이 확립되었다 (Fernandez et al., 2004; Santos et al., 2004). 2개의 감산형(subtractive) cDNA 라이브러리를 구축하고, cDNA 클론의 무작위 서열 분석(random sequencing)을 통해 EST(Expressed Sequence Tags)이 생성되었다.
라이브러리 1에는 12시간 동안 녹병균을 접종한 커피 잎에서 얻은 subtracted cDNAs가 나와 있다.
라이브러리 2에는 접종 후 24시간 및 48시간에 수집된 커피 잎에서 얻은 mRNA 풀에서 파생된 subtracted cDNA가 포함되어 있다 (Fernandez et al., 2004).
기생충에 대한 커피 나무의 초기 저항 메커니즘들의 발현과 관련된 유전자들이 두 개의 cDNA 라이브러리들로부터 분리되었다 (Fernandez et al., 2004) (그림 1L).
적어도 EST의 13%는 식물 방어 반응(질병 저항성 단백질, 스트레스 및 방어 단백질, 저항 신호 경로의 구성 요소)에 관여하는 유전자들을 나타내고, 13%는 세포 신호 전달 과정(이온 채널, MAP kinases, 수용체 키나아제 (receptor kinases)), 그리고 13%는 유전자 조절(전사 인자(transcription factors), 프로테아좀 기계(proteasome machinery, 단백질분해효소복합체 머신류))에 관여한다.
가장 높은 비율의 cDNA (34%)는 기능이 알려지지 않은 식물 유전자들와 상동성이었으며 기생충에 대한 커피 방어 반응 발현에 참여하는 유전자의 추가 공급원일 수 있다. 완벽하지는 않지만 분리된 EST는 병원균에 대한 커피 저항성에 대한 지식을 향상시키는 데 중요한 데이터 세트를 제공할 수 있다.
분리된 많은 유전자들은 C. arabica 및 기타 식물의 병원체들에 대한 신호 경로 및 저항 메커니즘의 보존을 암시하는 알려진 식물 유전자와 상동성을 나타냈다. 라이브러리를 비교해보면, 라이브러리 1 (10%)보다 라이브러리 2 (15%)에서 세포/생물 방어 범주에 정량적으로 더 많은 EST가 할당되었다. 반면, 라이브러리 2 (12%)보다 라이브러리 1 (18%)에서 일반 대사 범주에 더 많은 EST가 관련되었다. 감염 중 이러한 범주에서 EST 비율의 변화는 병원체 공격에 맞서 싸우기 위해 식물 숙주 대사의 재구성을 반영할 수 있다. Arabidopsis thaliana에서, 하우스 키핑에서부터 병원체 방어 대사로의 전환이 Pseudomonas syringae에 대한 HR 유도와 상관관계가 있다는 것이 최근에 밝혀졌다 (Scheideler et al., 2002).
양적 차이 외에도 두 라이브러리 간의 세포/생물체 방어 범주에서 질적 차이도 관찰되었다. 예를 들어, 알려진 R 단백질(Hammond-Kosack and Jones, 1997)과 유사성을 가진 ESTs는 라이브러리 2에서만 발견되었다.
녹병 감염에 대한 커피 분자 반응과 비생물적 처치에 대한 반응을 semi-quantitative RT-PCR로 조사했다 (table 1).
기생충에 대한 저항성과 관련 것으로 알려진 식물 유전자와의 상동성 (homology)을 기준으로, 그리고 두 라이브러리의 cDNA 클론에 대한 차별적인 스크리닝을 기준으로 후보 유전자 세트를 선택했다 (Fernandez et al., 2004).
그 중에는
♣ 질병 저항성 신호 단백질 (disease resistance signalling proteins),
♣ 스트레스 반응 단백질 (stress response proteins),
♣ 질병 저항성 및 방어 단백질 (disease resistance and defence proteins),
♣ 전사 인자 (transcription factors) 및 알려지지 않은 기능의 유전자 코딩 단백질(gene coding proteins)을
인코딩하는 것으로 추정되는 유전자가 있었다 (table 1).
호환적 및 비호환적 녹 상호작용들 모두 동안에, 그리고 salicylic acid (SA) 처리 (500μM) 또는 상처(잎 절단) 시에, 전사체 축적 (Transcript accumulation)을 검사했다. 대조 식물(모의 접종)과 비교하여 시간 경과에 따른 실험에서 많은 유전자가 녹 접종 식물(호환 또는 비호환 상호작용)에서 향상된 전사체 축적을 분명히 보여주었다. 또한, 9개 유전자는 호환가능한 상호작용과 비교할 때 비호환 상호작용 (HR) 동안 일시적으로 향상된 전사체 축적 (transcript accumulation)을 보여주었다 (Fernandez et al., 2004). 비생물적 처치 시 유전자 발현 패턴은 조사된 유전자들의 약 절반이 SA 또는 상처에도 반응하는 것으로 나타났다.
알려진 유전자들과의 서열 유사성 (sequence similarity)에 기초하여, HR-상향조절된 서열들 9개 중 4개가 스트레스-관련 단백질 또는 질병 저항성 신호 전달 경로의 구성 요소를 암호화하는 것으로 추정된다 (Table 1).
HR-상향조절된 두 서열들은 cytochromes P450 및 HSP70과 일치했다.
Cytochrome P450 유전자들은 Alternaria Brassicicola에 대한 저항반응에서 카말렉신 합성(camalexin synthesis)에 필요한 Arabidopsis PAD3 유전자와 같은 방어-관련 화합물의 생합성에 관여될 수 있을 것이다 (Zhou et al., 1999).
최근 Kanzaki et al. (2003)은 HSP70과 90 계열의 구성원이 식물 방어신호 전달경로(plant defence signal transduction pathway)의 필수 구성요소임을 보여주었다.
저항-신호 구성요소를 인코딩하는 HR-상향조절 서열과 관련하여, 두 커피 서열들은 A. thaliana DND1 및 NDR1 단백질과 가장 잘 일치했다.
DND1 (defense, no death) 단백질은 P. syringae에 대한 HR 신호 전달경로에 관여하는 순환 뉴클레오티드 개폐 이온 채널 (cyclic nucleotide-gated ion channel) (AtCNGC2)이다 (Clough et al., 2000).
NDR1 (non race-specific disease resistance, 비 균종-특유적 질병저항성) 단백질은 많은 CC-NBSLRR resistance proteins의 신호 전달경로의 핵심 구성요소이다 (Century et al., 1997).
DND1 및 NDR1과 유사한 발현 패턴 및 서열 상동성(sequence homology)을 나타내는 ESTs의 분리는
이들이 H. vastatrix에 대한 C. arabica의 저항성에 잠재적인 역할을 할 수 있음을 시사하고, 커피 나무에서 R-유전자매개 저항신호 전달 경로 (R-genemediated resistance signalling pathways)의 일부 구성요소가 보존됨을 나타낸다.
마지막으로, 4개의 다른 HR-상향조절 cDNA 클론들이 방어 메커니즘과 관련하여 잠재적인 관심을 끌었다 (Table 1).
한 EST는 receptor-like kinase를 인코드하는 것으로 추정된다. 신호 단백질(signal proteins)의 이런 종류는 다양한 발달 및 방어 기능에 관여한다 (Du and Chen, 2000; Morris and Walker, 2003).
다른 유전자는 UDP-glucose와 가장 잘 일치되었다: salicylic acid glucosyltransferase.
글루코실트랜스퍼라아제 (Glucosyltransferases)는 포도당 잔기(glucose residues)를 수많은 기질들(substrates)에게로 전달하는 것을 촉매하고, 살리실산(salicylic acid)과 같은 병원균에 대한 식물 방어에 중요한 역할을 하는 화합물의 활성을 조절한다 (Chong et al., 2002).
두 개의 ESTs가 AP2-type transcription factor와 WRKY transcription factor (전사 인자)를 인코딩한 것으로 추정된다.
다수의 gain-of-function 스터디들이 병원체 감염에 대한 식물 반응을 강화시키는데 있어 몇 가지 전사 인자들의 직접적인 영향을 보여주었다. 특히 병원체 방어를 포함한 여러 생물학적 과정의 조절과 관련된 여러 WRKY 단백질이 관련되어 있다 (Dong et al., 2003; Ülker and Somssich, 2004).
Real-time quantitative RT-PCR 실험들이 커피 녹병 감염 동안 유전자 발현 수준을 정량화하기 위해 수행되었다.
세 가지 후보 유전자가 선발되었다: CaNDR1(EST CO773976), CaWRKY1(CO773974), 그리고 EST CaR111은 기능이 알려지지 않은 단백질과 상동성을 가지며, 식물 질병 저항성의 새롭고 흥미로운 구성요소일 수 있다.
유전자 발현의 내부 준거로 뽑힌 유비퀴틴 유전자(ubiquitin gene)를 후보 유전자들과 병행하여 분석했다.
2-ΔΔCt method(Livak and Schmittgen, 2001)을 사용하여 추정된 유전자 발현의 상대적 변화가 Figure 1M에 제시되어 있다.
- 테스트된 3개의 후보 유전자들의 경우에, mRNA 수준의 향상이 병원체 감염 초기에 관찰되었다 (12-20 hpi).
- 시간 경과 실험 분석에 따르면, 식물/균류 상호작용 동안에 3개의 유전자들가 일시적으로 유도되는 것으로 나타났다.
- CaR111과 CaWRKY1에 대한 호환가능 상호작용과 비호환가능 상호작용 간에 상대적 발현(relative expression)에서 통계적으로 유의한 차이(P<0.05)가 발견되었다.
- CaR111은 약 12-16 hpi에서 비독성(avirulent) H. vastatrix 균주에 의해 유도되었지만, 그 독성 균주(virulent strain)에 의해서는 약하게 활성화되었다.
- CaWRKY1 유전자의 활성화는 두 상호작용 동안 발생했지만, 약 16hpi의 비호환 샘플에서 더 높았고, 호환가능 샘플에서는 24hpi에서 더 높았다.
- CaNDR1 유전자와 관련하여, 12-16 hpi에서는 부실한 유도(< 3배)만이 관찰되었으며, 독성 및 비독성 병원체 모두에 대한 반응으로 발생했다 (통계적으로 유의미한 차이 없음).
- 분석된 3개 유전자는 CaR111 및 CaNDR1 (Figure 1M)의 경우 24hpi, CaWRKY1 (데이터는 표시되지 않음)의 경우 48hpi에서 기본 발현 수준으로 돌아왔다.
- 우리가 약 12-18 hpi에서 관찰한 커피 유전자 유도는 곰팡이가 기공하 챔버(substomatal chamber)에 침투한 직후에 병원체의 인식이 일어날 수 있음을 보여준다.
몇몇 plant-rust interactions에서, 기주의 특정 저항 반응은 일반적으로 첫 흡기 (haustorium)의 형성과 동시에 발현된다 (Heath, 1997b; Mold et al., 2003). 동부콩(cowpea) (Vigna unguiculata) / Uromyces vignae 병태체계 (pathosystem)에서는, 저항성 품종에서 동부콩 유전자들의 구체적인 상향조절(specific upregulation)이 곰팡이에 의한 표피 세포벽 침투 직후에 발생했다 (Mould et al., 2003). 곡물 녹병 (cereal rusts) Puccinia graminis tritici 및 P. graminis avenae에서는 방어 관련 유전자들의 활성화가 보리 (Rostoks et al., 2004)에서 관찰되었고, 귀리에서는 거의 모든 감염 부위에서 흡혈 모세포 (haustorial mother cells, HMC)가 형성되었다 (Lin et al., 1998).
커피─ H. vastatrix 상호작용의 경우, H. vastatrix는 24~48 hpi 사이에 吸器 段階 (haustorium stage)에 도달할 수 있을 것이다 (Martins and Moraes 1996; Silva et al., 1999a, 2002). 저항성 커피 잎들에 대한 세포학적 관찰을 통해 많은 감염 부위(기공)에서 곰팡이가 흡충 전 단계(pre-haustorium stage HMC)에서 성장을 멈춘 것으로 나타났으며 (Silva et al., 2002), 이는 초기 기주 저항성 반응이 발현될 수 있음을 시사한다. 12~18hpi 부근에서 관찰된 유전자 활성화는 커피 저항성 반응의 일부일 수 있으며 커피-녹 상호작용의 결과를 결정할 수도 있을 것이다.
따라서 우리가 분리한 유전자들은 H. vastatrix에 대한 식물 방어 반응의 다양한 발현에 참여할 수도 있을 것이다. High-density cDNA filters 기술의 가용성으로 인해, 수백 개의 ESTs의 발현 프로필(expression profiles)이 여러 가지 커피─녹 상호작용에서 동시에 모니터링되어 이러한 생물학적 과정의 메커니즘을 결정하는 데 도움이 된다. 또한 질병 저항성을 위한 후보 유전자들을 식별하면 커피 유전자원을 활용하기 위한 대립유전자 채굴(allelic mining)과 커피 유전학 프로그램을 지원하는 분자 마커(molecular markers) 개발이 가능해진다.
Colletotrichum의 3종들이 커피 열매, 잎 및 가지에서 분리되었다:
▣ C. kahawae (원래 C. coffeanum으로 지명된 유일한 기생 종),
▣ C. gloeosporioiedes Penz 그리고
▣ C. acutatum Simmond (Hindorf, 1970; Masaba 및 Waller, 1992; Waller et al., 1993).
Colletotrichum kahawae는 꽃에서 부터 잘 익은 과일까지, 때때로 잎까지, 작물의 모든 단계를 감염시키지만, 녹색 열매에 감염되면 포자형성(sporulation) (acervuli, 분생포자층)으로 인해 어둡게 가라앉은 병변(dark sunken lesions)이 형성되어(그림 2A-B) 조기 낙하(premature dropping)와 미라화(mummification)를 초래하여 최대 작물 손실이 발생한다.
1922년 케냐에서 처음 보고된 이 질병(McDonald, 1926)은 통제 조치를 취하지 않으면 최대 70~80%의 손실을 초래할 수 있다 (McDonald, 1926; Saccas and Charpentier, 1969; Kibani, 1982; Waller, 1985). CBD는 지금까지 아프리카로 제한되어 있지만 다른 커피 재배지역에서는 이 질병의 유입을 방지하기 위해 예방조치를 취해야 한다.
Colletotrichum 질병의 병인은 다양하며, 이는 그 屬(genus) 내의 기본적인 영양 및 생태학적 다양성으로 인해 발생한다 (Latunde-Dada, 2001). 식물 표면에서의 곰팡이 발달의 초기 단계는 모든 Colletotrichum 종에서 본질적으로 동일하다. 分生子(condia)가 큐티클에 붙어서 발아하여 발아관(germ tubes)을 생성하고, 그 후 큐티클을 직접 관통하는 부착기들(appressoria)을 형성한다 (Perfect et al., 1999; O'Connell et al., 1996, 2000). 부착기 (appressorium)의 성숙은 그 세포 기저부에 관통 구멍의 형성 (formation of a penetration pore), 새로운 벽 층의 퇴적 (deposition of new wall layers), 그리고 세포외 기질 물질의 분비 (secretion of extracellular matrix materials)를 수반한다. 그 다음에, 멜라닌(melanin)이 원형질막(plasma membrane)에 가까운 세포벽 층에 침착된다 (Bailey et al., 1992; O'Connell et al., 2000).
숙주로의 곰팡이 침투는 멜라닌화된 부착기들(melanized appressoria), 큐틴 분해 효소의 분비 (secretion of cutin degrading enzymes) 또는 두 과정의 조합에 의해 가해지는 기계적 압력에 기초할 수 있다 (Bailey et al., 1992). C. kahawae의 분생포자가 “시험관 내(in vitro)”와 “생체 내(in vivo)” 모두에서 발아하여 멜라닌화 부착기들을 분화하며 (그림 2C), 여러 커피 기관들(배축(hypocotyls), 잎 및 녹색 열매)의 침투도 표피 세포벽(epidermal cell walls)을 통해 직접 발생한다 (Garcia et al., 1997; Garcia, 1999; Várzea et al., 2002b, Chen, 2002; Chen et al., 2003, 2004b).
Chen(2002) 및 Chen et al. (2004b)는 약 44 bar의 C. kahawae appressorium 팽압(turgor pressure)이 커피 녹색 열매의 삼투압 (osmotic pressure) 보다 4배 더 높다고 결론지었다. 반면, 살균제 트리시클라졸(tricyclazole)을 사용하여 유발된 비-멜라닌화 부착기들은 멜라닌화 부착기들에 비해 팽압이 1/4만큼 낮았으며 결과적으로 커피 잎과 녹색 열매에 대한 감염 비율이 훨씬 낮았다. 그들은 또한 큐티나아제(cutinase)가 C. kahawae 분생포자 점액(conidial mucilage)과 시험관 내 및 생체 내에서 발아된 분생포자의 細胞外液 (extracellular fluid)에 존재한다는 것을 보여주었다. 큐티나아제 억제제인 디이소프로필 플루오로인산 (diisopropyl fluorophosphates)의 사용은 培養濾液(culture filtrates) 및 세포외액(extracellular fluids)의 큐티나아제 활성(cutinase activity)을 완전히 억제했지만 감염을 예방하지는 못했다. 이러한 결과를 바탕으로 그들은 C. kahawae 부착기들의 의 팽압이 커피 큐티클 침투에 중요한 역할을 할 수 있다는 결론을 내렸다.
침투 후, Colletotrichum 종들은 숙주 조직을 성공적으로 집락화하고 숙주 방어반응을 피하기 위해 두 가지 주요 전략을 사용한다 : 즉 표피하 벽내 집락화(subcuticular intramural colonization)와 세포내 집락화 (Benhamou et al., 1991; O'Connell & Bailey, 1991; Bailey et al., 1992; Pring et al., 1995, Latunde-Dada et al., 1996, O'Connell et al., 1996, Latunde-Dada et al., 1997, O'Connell et al., 2000, Latunde-Dada, 2001, Mendgen & Hahn, 2002; Diéguez-Uribeondo et al., 2005).
표피하 벽내 감염 방식(subcuticular intramural mode of infection)을 나타내는 Colletotrichum 종들의 경우, 침투 후에 큐티클 아래에서 그리고 표피 세포(epidermal cells)의 주변면 및 背斜의 壁 (periclinal and anticlinal walls) 내에서 괴사 방식(necrotropic manner)으로 균사(hyphae)가 성장하며, 이는 세포벽 분해 효소의 대량 분비를 수반한다. 따라서 이러한 병원체들은 자신들이 죽인 숙주 세포로부터 영양분을 얻으며, 따라서 사물영양체(necrotrophs)(예: C. capsici)로 분류되고 있다.
대조적으로, C. kahawae (Garcia et al., 1997; Garcia, 1999; Silva et al., 1999b, Várzea et al., 2002b)를 포함한 대부분의 Colletotrichum 종들은 일시적인 침투 후 무증상 생체영양 기생(transient post-penetrative asymptomatic biotrophy)을 나타냈다가, 질병 증상의 출현과 병원체 재생산(pathogen reproduction)에 이르는 파괴적인 괴사 단계(phase of destructive necrotrophy)로 빠르게 이어지므로, 반-생체영양 기생체(hemibiotrophs)이다. 증상이 없는 생물영양 단계(biotrophic phase)에서는, 그 병원체는 숙주세포를 죽이지 않고 침입하여 살아있는 세포를 먹는다. 그 후, 그 병원체는 괴사 영양 모드(necrotrophic mode of nutrition)로 전환하여 죽은 숙주 조직을 먹는다.
세포내 반생물영양(intracellular hemibiotrophic) Colletotrichum 종은 두 그룹으로 추가로 분류될 수 있다:
i) 생물영양 단계(biotrophic phase)가 많은 숙주 세포들로 확장되는 그룹
(예: Phaseolus vulgaris의 C. lindemuthianum 및 Coffee spp.의 C kahawae),
ii) 생물영양 단계가 처음 감염된 표피세포 내부에서만 발생하는 그룹
(예: Medicago sativa(자주개자리)의 C. destructivum).
소수의 Colletotrichum 종들(주로 C. gloeosporioides 및 C. acutatum)은
相利共生 內生寄生植物 (mutualistic endophytes)이거나 또는
잠복기 후에 괴사 현상에 의존하는 停止 內生寄生植物(quiescent endophytes)이다(Prusky and Plumbley, 1992; Latunde-Dada et al., 1999).
內生寄生 種(植內棲性 種, Endophytic species)은 종종 숙주 잎(host leaves)을 직접적으로 침투하거나 기공 구멍(stomatal openings)을 통해 침투한 다음, 증상 없이 세포간 방식으로(intercellularly) 엽육(mesophyll)을 분파한다(ramify). 停止(休止) 種(Quiescent species)은 감염된 기관의 생리학적 상태와 일치하여 정지되는 오래 계속되는 침투 성장 단계(prolonged phase of penetrative growth)를 갖는다.
Garcia et al. (1997), Garcia (1999), Silva et al. (1999b), 그리고 Várzea et al. (2002b)에 따르면, C. kahawae에 감염된 커피의 녹색 열매, 배축 그리고 잎에서, 表皮 細胞壁(epidermal cell wall)을 관통한 후, 그 감염 侵入絲 (peg)가 부풀어 올라 세포 내강(cell lumen) 내부에 구형 감염 소포(globose infection vesicle)를 형성한다 (Figure 2D).
취약성(susceptibility)은 살아있는 寄主 細胞에서 감염 소포(infection vesicle)의 세포내 및 세포간 파문(ramification)과 관련이 있다 (Figure 2D). 곰팡이가 살아있는 세포를 먹는 이 기간은(Figure 2D) (생물영양 biotrophy) 곰팡이 分離株의 공격성(aggressiveness)의 정도에 따라, 각각 접종(inoculation) 후 48시간 또는 72시간 동안 지속될 수 있다 (Varzea et al., 1999). 감염 과정의 초기 단계에서는 육안으로 보이는 증상(macroscopic symptoms)이 없다. 투과 전자 현미경 (Transmission electron microscope)으로 관찰해보면, 세포 내 감염(intracellular infection) 소포(vesicles)와 균사(hyphae)는 식물 원형질막 외부에 남아 있으며 곰팡이 주변에 함입되어 있다. 생체 영양은 괴사 성장으로 이어졌다. 후자의 경우, 곰팡이의 집락화는 심각한 세포벽 변화 및 숙주 원형질체의 사멸과 관련이 있었다 (그림 2E-F).
어떤 숙주 세포들에서는 세포질(cytoplasm)이 현저하게 감소되었으며, 종종 미세한 가닥(fine strands)으로 자주 나타났는데, 이는 막성 잔해(membranous debris)가 기존 세포소기관(organelles)의 유일하게 인식할 수 있는 특징이었다.
곰팡이가 새로운 숙주 세포의 집락화를 시작함에 따라 생물영양 단계(biotrophic phase)가 반복되었다. 결과적으로, 죽은 숙주 세포와 살아있는 숙주 세포에서 동시에 균사 성장(hyphal growth)을 관찰하는 것이 가능했다. 광학 및 전자 현미경 관찰 (Garcia et al., 1997; Garcia, 1999 및 Várzea et al., 2002b)에서 볼 수 있듯이, 취약한 배축, 녹색 열매 및 잎의 괴사 단계(necrotrophic phase) 동안 캘러스(callose)가 존재했지만, 표피 및 피질 세포(epidermal and cortex cells)의 균사(그림 2G-H) 주변에만 존재했다. 취약한 조직에서의 이러한 숙주 반응은 곰팡이 성장과 포자 형성을 방지하기에는 너무 늦게 발생하는 것으로 보인다 (Garcia et al., 1997; Garcia, 1999 & Várzea et al., 2002b).
몇 가지 세포벽 분해효소들(폴리갈락투로나제(polygalacturonases), 폴리메틸갈락투로나제 (polymetylgalacturonase), 펙테이트 리아제 (pectate lyase), 펙틴 리아제 (pectin lyase), 카르복시메틸셀룰라제)의 활성 평가가 C. kahawae를 접종한 취약한 녹색 베리 추출물에서 수행되었다 (Chen, 2002; Chen et al., 2004a). 접종 후 3일째에 측정할 수 있는 펙테이트 리아제 활성(생균 영양 단계의 곰팡이 포함)은 5일째(괴사성 병변이 이미 관찰된 때)에는 거의 두 배로 증가했으며 9일째(실험 마지막 날)에는 최대치에 도달했다. 이러한 결과는 이 효소가 C. kahawae의 병원성에 역할을 할 수 있음을 나타낸다.
Figures 2C~H. Coffee ─ C. kahawae interaction.
Figure 2C - Prepenetration fungal growth stages on a green berry.
그린 베리에서의 침투 전 곰팡이 성장 단계
Figures 2D-2F - Hemibiotrophic fungal growth on susceptible hypocotyls.
취약성 배축들에서의 반생물영양 기생곰팡이 성장.
Figures 2G-2H – Late responses of susceptible hypocotyls. 취약성 배축들의 늦은 반응들.
Figure 2C – Scanning electron microscope observation. Germinated conidium (C)
with germ tube (T) and appressoria (A) (x21,000).
주사형 전자현미경 관찰. 발아관(germ tube) (T)과 부착기들(appressoria)(A)가 있는
발아된 분생자포(Germinated conidium) (C) (21,000배).
Figure 2D - Light microscope observation, blue lactophenol staining.
광학현미경 관찰, 블루 락토페놀 염색 (550배)
Two infection sites showing melanised appressoria (A) which penetrated and reached
the stage of infection vesicle (v) in one case and further intra- and intercellular growth (arrow)
in the other, 41 h after inoculation (biotrophic growth) (x550).
침투하여 감염 소포(v)의 단계에 도달한 멜라닌화된 부착기들(A)을 보여주는 경우와,
그리고 더 나아가 접종 41시간 후(생물영양 성장) 세포내 및 세포간 성장 (화살표)를
보여주는 두 감염 부위들 (550배).
Figure 2E - Light microscope observation, toluidine blue staining.
광학현미경 관찰, 톨루이딘 블루 염색.
Fungal hyphae (arrows) in living and in necrotized (n) host cells, 5 days after inoculation (x300).
접종 5일 후, 살아 있는 숙주세포들과 괴사된 숙주세포들(n)의 곰팡이 균사들 (300배)
Figure 2F - Transmission electron microscope observations, uranyl acetate and lead citrate staining.
투과형 전자현미경 관찰, 우라닐 아세테이트 및 시트르산납 염색.
Hyphae (H) within the degraded cell wall (arrow) and inside an epidermal cell
with disorganised cytoplasmic content (x5,700).
분해된 세포벽(화살표) 내의 균사 (H)와, 지저분한 세포질의 표피세포 내부의 균사 (H) (5,700배)
Figure 2G - Light microscope observation, aniline blue test. 광학 현미경 관찰, 아닐린 블루 테스트.
Callose around intracellular hyphae (arrows), 7 days after inoculation
(n = necrotized host cell) (x150).
접종 7일 후 세포내 균사 주위의 캘로스 (n = 괴사된 숙주 세포) (150배)
Figure 2H - Transmission electron microscope observations, uranyl acetate and lead citrate staining.
Callose deposition (arrow) around an intracellular hypha (H),
which presents disorganised cytoplamic content (x6,500).
투과형 전자현미경 관찰, 우라닐 아세테이트 및 시트르산납 염색.
세포내 균사(H) 주위의 캘로스 침착 (화살표), 헝클어진 세포질을 보여준다 (6,500배)
케냐의 CBD에 대해 수행된 연구는 많은 귀중한 정보를 제공했다. 다양한 커피 유전자형이 현지 C. kahawae 분리주를 사용하여 테스트 되었으며, 이 나라에서는 차별적인 병원성이 관찰되지 않았다 (van der Vossen et al., 1976). 더욱이, 에티오피아에서는 숙주와 병원체 집단 사이의 차별적인 상호작용이 거의 발견되지 않았다 (van der Graaff, 1981). 후자의 저자는 그러나 긍정적인 효과는 작았으며 이것이 유전자 대 유전자 특이성으로 인한 것일 가능성은 낮다고 언급한다.
많은 저자들은 병원체 집단의 공격성(aggressiveness)이 동일한 또는 다른 지리적 기원들로부터의 분리주들 사이에 변동성 (variability)을 보여준다는 데 동의한다 (Firman and Waller, 1977; Omondi et al., 1997; Masaba and van der Vossen, 1978; van der Vossen, 1985; Manga et al., 1998; Manga, 1999; Varzea et al., 2002b, Varzea et al., 2001).
처음으로 Rodrigues et al. (1992) 및 Várzea et al. (1993)은 C. kahawae의 생리학적 종족들(physiologic races)이 존재한다는 증거를 언급했다. CATIE의 Sarchimor 및 Catimor 선택에 대한 차별적인 반응은 Bieysse et al. (1995)에서도 발견되었다. 더 철저한 연구에서는 C. kahawae 분리주의 공격성에서만 차이점이 발견되었다 (Manga et al., 1998).
Omondi et al. (1997, 2000)은 현지 케냐 분리주를 대상으로 연구하면서 C. kahawae 분리주 사이의 병원성 변동성은 주로 공격성으로 인한 것이고 차별적 병원성은 비록 작지만 매우 중요하므로 무시할 수 없다는 결론을 내렸다. 그러나 그들은 C. kahawae의 생리학적 종족에 대한 긍정적인 증거를 찾지 못했다.
Bieysse et al. (미공개 데이터, INCO-project ICA4-CT-2001-10008)은 동아프리카와 중앙아프리카에서 수집된 균주를 대상으로 한 연구에서 균주 간의 차이는 주로 공격성으로 인해 발생한다고 결론지었다.
서로 다른 지리적 기원의 C. kahawae 개체군들을 대상으로 수행된 분자 연구에서는 이 種 내의 다형성(polymorphism)이 존재하지 않음을 보여주었다 (Beynon et al., 1995; Sreenivasaprasad and Mills, 1993; Manga et al., 1998; Loureiro et al. , 2004, 2005).
그러나 PAGE (non-denaturating electrophoresis in polyacrylamide gel 폴리아크릴아미드 겔의 비변성 전기영동) 및 IEF (isoelectric focusing 등전점 전기영동) 기술을 사용한 동질효소 특성 분석(isoenzymatic characterisation)은 연구된 분리주 사이에서 다형성을 보여주었다 (Loureiro et al., 2004; Loureiro et al., 2005).
최근에 Bieysse et al. (미공개 데이터 - INCO-project ICA4-CT-2001-10008)은 미소부수체 시동물(microsatellite primers)를 사용하여 모든 지리적 영역(카메룬, 케냐, 부룬디, 탄자니아, 르완다, 짐바브웨, 말라위, 앙골라, 에티오피아)에서 수집된 140종의 균주를 분석했다. 그들은 연구된 계통이 동아프리카와 카메룬의 두 그룹으로 분류될 수 있다고 결론지었다. 각 지리적 개체군은 분리주 사이에 강한 동질성(homogeneity)을 나타냈는데, 이는 병원체의 클론 증식(clonal multiplication)을 시사한다.
CBD에 대한 커피의 유전적 저항성은 C. canephora에서는 완전하고 C. arabica에서는 부분적인 것으로 나타났다.
아라비카의 경우, van der Vossen & Walyaro (1980)가 케냐에서 수행한 연구에 따르면 CBD에 대한 커피 저항성은 세 가지 다른 유전자좌의 주요 유전자에 의해 제어되는 것으로 나타났다.
저항성이 높은 품종인 Rume Sudan은 우성 R-유전자와 열성 K-유전자를 가지고 있다.
프리토리아(Pretoria) 품종에도 K-유전자가 있다.
중간 저항성 품종인 K7은 열성 K-유전자만을 갖고 있다.
Hibrido de Timor는 중간 유전자 활동(intermediate gene action)이 있는 T-유전자좌에 CBD 저항성에 대한 하나의 유전자를 보유한다.
Robinson (1974)과 van der Graaff (1981, 1985)는 CBD 저항성이 수평적/정량적이라고 제시했다.
Ameha & Belachew (1982)는 비이입된 아라비카(non-introgressed Arabicas)에서의 CBD에 대한 저항성을 3-5개의 열성 유전자(recessive genes)가 조절한다고 언급했다.
CBD에 대한 커피나무의 저항성 차이가 현장 및 실험실 조건에서 자주 관찰된다.
케냐에서는, "Geisha 10"과 "Blue Mountain“, K7, Rume Sudan 그리고 "Hibrido de Timor" (HDT)의 일부 자손들이 "Harar" 및 "Bourbon"보다 더 많은 저항력을 가지고 있다.
Rume Sudan에서 높은 수준의 저항성이 발견되었다 (Rayner, 1952; Nutman and Roberts, 1960; Firman, 1964; Gibs, 1968; Firman and Waller, 1977; van der Vossen, 1985; van der Vossen et al., 1976; van der Vossen & Walyaro, 1980).동부
아프리카에서 CBD가 급속히 발생함에 따라, 일부 국가에서는 케냐와 탄자니아에서처럼 CBD 및 커피 잎 녹병(CLR)에 대한 저항성과 소출을 결합하려는 목적으로 교배 프로그램을 수행하게 되었다.
1989년에 다양한 커피 재배 국가에서 CBD 저항성에 대한 육종 프로그램을 지원하기 위한 새로운 연구 라인이 CIFC에서 시작되었다. 다양한 커피 유전자형의 수천 가지 자손이 다양한 지리적 출처의 CBD 분리주들에 대해 테스트되었다. 배축 사전 선별 테스트에 사용된 모든 분리주에 대해 100% 저항성을 보인 커피 유전자형은 없었다. 그러나 Rume Sudan의 일부 계열은 HDT CIFC 1343의 일부 파생물 뿐만 아니라 연구된 대부분의 분리주들에 대해 높은 수준의 저항성을 나타냈다. 중간 수준의 저항성도 서로 다른 기원의 이종간 4배체 하이브리드들(interspecific tetraploid hybrids)의 파생물에서도 발견될 수 있었다.
커피 재배 국가들에서 질병 저항성을 지닌 전구 품종들(progenitors) 중에는 Hibrido de Timor, Rume Sudan, Kaffa 및 Geisha가 있었으며, 이들은 품종 SL 28, SL 34, N 39, KP 423 및 H 66과 교배되었다 (Walyaro, 1983; van der Vossen 및 Walyaro, 1980, 1981).
잠비아에서는, 콜롬비아 품종에서 유래한 것으로 추정되는 한 순수 계통(pure line)이 Caturra 또는 Catuai에 비해 높은 수준의 저항성을 나타냈다. 이들 후자 품종의 경우, 화학적 방제를 적용하지 않았을 때 작물 손실의 80%가 관찰된 반면, 콜롬비아 품종에서 유래한 순수 계통의 손실은 15-20%에 불과했다 (C. Hemmings, 개인 통신).
탄자니아에서는, 높은 수준의 저항성을 갖는 8개의 새로운 클론이 선발되었으며, 體細胞胚發生 (somatic embryogenesis)에 의해 영양적으로 증식되었다 (Teri et al., 2004).
케냐에서는 복합 하이브리드 Ruiru 11이 좋은 수준의 저항을 나타냈다.
에티오피아에서는(EARO Institute에서 개발한 ‘커피 랜드레이스 프로그램'을 기반으로 함) 결과가 매우 빠르게 얻어졌으며 강한 기생충 압력 조건 하에서 CBD에 대한 우수한 내성(good tolerance)을 나타내는 약 20개의 순수 커피 라인들이 1978년부터 선발되어 전국의 커피 재배 지역 전체를 대상으로 농민들에게 배포되었다.
아라비카 커피에서, C. kahawae에 대한 저항성 메커니즘은 미리 형성되기도 하고 유도되기도 하며 그리고 다양한 발병 단계에서 작동한다 (Gichuru, 1997).
커피 베리 큐티클은 침투하는 병원체에 대한 물리적 장벽 역할을 할 수 있다. Nutman & Roberts (1960)는 그린 커피 베리의 표피를 제거하면, 상처가 없는 베리들에 비해, Blue Mountain 및 Kent와 같은 저항성 품종들이 Harar 품종 만큼 취약해진다는 것을 관찰했다. 상처를 입으면 영양분이 侵入絲(infection peg)로 직접 침출(direct leaching)될 수 있으며, 곰팡이가 내부 조직으로 직접 접근할 수도 있다 (Nutman and Roberts, 1960; Gichuru, 1997).
큐티클에서 미리 형성된 항진균 화합물의 발생과 CBD 저항성에서의 가능한 역할에 대한 몇몇 조사가 수행되었지만 이들 화합물의 화학적 성질은 확인되지 않았다.
Nutman & Roberts (1960)는 저항성 품종인 Blue Mountain의 추출물이 취약성 품종인 Harar에서 발생한 것과 대조적으로 감염 과정에 자극 효과(stimulatory effect on the infection process)가 있음을 발견했다.
그러나 Steiner (1972)는 Rume Sudan과 Blue Mountain의 그린 베리에서 클로로포름(chloroform)으로 추출한 표면 왁스에는 분생포자의 발아(conidial germination)를 크게 감소시키는 물질이 포함되어 있으며, 이러한 품종에서 볼 수 있는 C. kahawae에 대한 필드 저항성의 높은 수준에 기여할 수 있다고 결론지었다.
Lampard & Carter (1973)는 또한 커피 그린 베리의 큐티클 왁스 층(cuticular wax layers)에 항진균 화합물(antifungal compounds)이 존재한다고 보고했으며, 많은 아라비카 커피 품종의 큐티클 왁스 추출물의 활성 정도와 C. kahawae에 대한 필드 저항성 사이의 상관관계를 발견했다. 그러나 다른 품종의 큐티클 추출물에서 얻은 활성은 보고된 취약성과 잘 연관되지 않았다.
Masaba & Helderman (1985)은 또한 Rume Sudan과 SL 28의 배축이 접종 2일 후 C. kahawae의 분생포자 발아(conidia germination)와 균사체 성장(mycelial growth)을 억제하는 화합물을 형성한다는 것을 발견했다.
Masaba & van der Vossen(1982)에 따르면, 아라비카 커피의 CBD에 대한 저항성은 어느 정도 코르크 장벽의 형성(formation of cork barriers)에 기초할 수 있다. 감염 부위 아래의 일부 세포에서는 펠로겐(phellogen)이 빠르게 형성되었으며, 진균 침입의 진행은 코르크화된 세포(suberised cells)의 완전한 장벽에 의해 차단되었다. 이러한 코르크 장벽은 CBD에 대한 저항의 일반적인 육안으로 보이는 표현인 딱지 병변(scab lesion)에 해당한다 (Gichuru, 1997).
그런 저항 메커니즘은 안정적일 가능성이 높으며(race-nonspecific), 식물 조직의 활발한 대사에 분명히 의존한다 (Masaba & van der Vossen, 1982; Masaba & Waller, 1992).
실제로 코르크 장벽 형성은 나무에 매달려 있는 열매들과 배축들 모두에서 관찰되었지만, 떨어진 열매들에서는 관찰되지 않았으며 C. kahawae 감염에 반응하는 능력을 빠르게 상실했다.
코르크 장벽의 형성은 온도에 따라 달라진다 (Masaba, 1982).
저항성 품종과 취약성 품종의 코르크 장벽 형성 차이는 19°C와 22°C 사이에서 가장 컸다.
반면에 16°C 미만과 28°C 이상의 온도에서는 장벽 형성이 저하되었다.
생화학적 연구들에서는 C. kahawae를 접종한 후 커피 품종에서 단백질 분해 효소(proteolytic enzymes)와 과산화효소 (peroxidase) 활성이 크게 증가한 것으로 나타났다 (Gichuru, 1993; Gichuru et al., 1997). 접종되지 않은 배축들 그리고 떨어진 베리들과 매달린 베리들에서 얻은 추출물의 퍼록시다아제 활성은 저항성 품종과 취약성 품종 사이의 차이를 나타내지 않았지만, 효소 활성의 가장 높은 증가는 저항성보다는 취약성과 관련이 있었다 (Gichuru et al., 1997).
Hibrido de Timor (HDT) 파생물의 저항성 배축을 이용한 조직학적 연구들이
취약성 품종인 Caturra의 것과 비교하여 분생포자 발아와 멜라닌화 부착기들의 분화에서는 차이가 없음을 보여주었으나,
숙주 조직 내부의 균사 길이(hyphal length)는 접종 후 41시간부터 저항성 유전형(resistant genotypes)이 유의하게 더 낮았다 (Silva et al., 1999b; Várzea et al., 2002b).
저항성 커피 유전자형에서 그 곰팡이의 균사(the fungal hyphae)는 표피 세포(epidermal cells), 또는 피질 세포(cortex cells)의 첫 번째 층에 국한되어 있었다. 이들 지점들에서, 비호환성 징후들가 관찰되었다:
(i) 과민성 숙주 세포 사멸(hypersensitive host cell death) (세포 자가형광 및/또는 갈변에 의해 모니터됨);
(ii) 세포벽의 변형(modifications in the cell walls) (두께 및 자가형광) 및
(iii) 페놀성 화합물의 초기 축적 (epifluorescence test 표면형광 테스트로 표시됨)(그림 2I-K).
이러한 숙주 반응들은 육안으로 보이는 딱지 병변(scab lesion)에 해당한다.
동일한 반응 패턴이 C. racemosa의 저항성 배축들 (Silva et al., 미공개 데이터)과 C. canephora에서 관찰되었는데, 테스트된 배축들의 대부분(>90%)에서 증상이 발견되지 않았다. (Loureiro et al., 미공개 데이터).
숙주 감염 세포의 급속한 과민성 사멸(rapid hypersensitive death)이 C. lindemuthianum과 P.vulgaris 및 Vigna unguiculata, C. trifolii와 Medicago sativa 및 Medicago truncatula의 양립할 수 없는 상호작용들, 그리고 C. gloeosporioides 및 Stylosanthes spp.와 관련된 어떤 상호작용들의 전형적인 특징이다 (O'Connell & Bailey, 1986; Trevorrow et al., 1988;Bailey et al., 1990; Mold et al., 1991; Torregrosa et al, 2004).
빈 탄저병 병리체계에서 이러한 초기의 HR(숙주반응)은 호환가능한 상호작용에서 발생하지 않으므로. HR과 레이스 품종 특유성 사이에 높은 상관관계가 있음을 나타낸다 (Esquerré-Tugayé et al., 1992).
숙주 세포벽 변형, 즉 HRGP (hydroxyproline-rich glycoproteins, 히드록시프롤린이 풍부한 당단백질) 수준의 증가, 그리고 감염된 숙주 세포의 페놀성 화합물의 초기 축적(early accumulation of phenolic compounds)도 Colletotrichum spp.에 대한 숙주 저항성과 관련이 있다 (Esquerré-Tugayé et al., 1992; Skipp et al., 1995; Torregrosa et al., 2004).
M. truncatula - C. trifolli 비호환 상호작용에서, 축적된 초기 페놀성 화합물들 중 하나가 파이토알렉신 메디카르핀 (phytoalexin medicarpin)인데, 이는 페닐프로파노이드 경로(phenylpropanoid pathway)의 몇 가지 효소들의 동원(mobilization)을 통해 합성된다. 이 경로의 몇가지 유전자들이 최대 수준의 자가형광 (autoflorescence) (페놀성 화합물의 축적을 나타냄) 이전에 저항성 품종들에서 유도되었다 (Torregrosa et al., 2004).
커피와 C. kahawae 간의 상호작용에 관련된 페놀성 화합물들의 식별이 현재 연구 중이며, 예비 결과에서는 감염 부위에 플라보노이드와 하이드록시신남산 유도체 (flavonoides and hydroxycinnamic acid derivatives)가 축적된 것으로 나타났다. 이들 화합물은 취약성 유전자형들보다 저항성 및 부분 저항성 유전자형들에서 더 일찍 검출되었다.
특정 HDT 유도체의 저항성 배축들에서, 검출된 또 다른 초기 숙주 반응은, 아닐린 블루 테스트(aniline blue test)에서 가리킨 바와 같이, 표피 세포(epidermal cells)와 때로는 피질 세포(cortex cells)의 세포내 균사(intracellular hyphae) 주변에 캘러스가 침착(deposition of callose)되는 것이었다 (figure 2L). (callus ⇒ 상처 부분이 나아 생긴 딱딱한 조직)
자주 보고되는 것은 Colletotrichum spp.이 침투를 시도한 부위에서 원형질막(plasma membran)과 표피 세포(epidermal cells)의 외벽 사이에 침착된 벽 반대(wall oppositions)(papillae 돌기, 유두)의 형성이다. Colletotrichum spp.에 반응하여 생성된 돌기(papillae)는 저항성 숙주와 취약성 숙주 모두의 살아있는 세포에서 주로 캘로스(callose), HRGPs 및 페놀성 물질들로 구성되어 있는 것으로 설명된다 (O'Connell and Bailey, 1986; Skipp et al., 1995).
커피 - C. kahawae 간의 호환 및 비호환 상호작용에서, 숙주와 병원체 사이의 인터페이스에 관여하는 화합물의 특성을 확인하기 위해 세포화학적 테스트들이 수행될 것이다.
지난 수십 년 동안 커피 녹병 및 CBD와 같이 경제적으로 중요한 식물 질병을 방제하기 위한 저항성을 위해 고전적 육종을 사용하여 상당한 성공을 거두었다. 녹병 및 CBD 저항성에 대한 유전적 배경이 좋은 "Hibrido de Timor" (HDT)의 발견은 커피 연구에 획기적인 발전이었다.
그러나 지난 몇 년 동안 HDT의 일부 개량된 상업용 품종과 Icatú와 같은 다른 이종간 4배체 하이브리드들은 H. vastatrix 병독성(virulence)의 증가로 인해 일부 국가에서 녹병에 대한 저항성을 점차 잃어가고 있다. 이는 새로운 녹병 계열들로 기존 품종들을 재평가하는 것의 중요성과 새로운 품종 출시 전에 필요한 주의를 보여준다.
또한 보다 지속적인 저항성의 원인을 식별하는 데 우선순위를 두어야 한다. 병원체 집단의 역학과 숙주 저항성 또는 취약성을 결정하는 요인에 대한 더 나은 지식이 있다면 보다 효과적이고 지속적인 형태의 질병 통제가 고안될 수 있다는 것이 오랫동안 인식되어 왔다.
다양한 연구 접근법(유전학, 분자생물학, 세포학, 생화학)을 통합하면서 최근 커피 저항성, 특히 잎 녹병에 대한 중요한 진전이 이루어졌다. 앞으로는 환경적 요구와 지속가능한 커피 경제 발전을 고려하여 두 질병에 대한 커피 저항성의 내구성을 향상시키는 데 상당한 기여를 할 것으로 예상된다.
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